Dodoplanin-pozitif mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarının dolaylı manyetik boncuk stratejisi kullanılarak izolasyonu ve doğrulanması

Araştırmamız, yüksek saflık ve okunabilirlikle maliyet etkin manyetik boncuk yumuşatması için belirli mezenkimal kök hücre alt kümesini izole etmeye odaklandı. Bu protokol, standart PE konjuge antikorlar kullanılarak herhangi bir membran proteinine uygulanabilir. Başlamak için gerekli reaktifleri toplayın.

Üçüncü ila beşinci pasajlardan %80 ila 90 birleşme oranına ulaşan mezenkimal kök hücreleri (MSC) seçin. Kültür ortamını at. Hücreleri 10 mililitre önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.

Kabı nazikçe sallayın ve PBS'yi atın. İki mililitre %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 derece Celsius'ta üç ila beş dakika kuluçka yapın. Mikroskop altında, hücreler yuvarlanıp ayrılmaya başlayana kadar gözlemleyin.

Tripsini nötralize etmek için %16,5 FBS içeren dört mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücreleri nazikçe pipetleyin, böylece tam ayrılma sağlanır ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarabilirsiniz. Hücre süspansiyonunu 300 gramda üç dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı atın.

Hücre pelletini bir mililitre tamponla yeniden askıya alın. Hücreleri sayarak toplam hücre sayısını belirleyin. Daha önce gösterildiği gibi santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

Hücreleri tampon ile yeniden askıya alınarak mililitrede 100 milyon hücre yoğunluğu elde edilir. Hücre süspansiyonunu beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Her 10 milyon hücreye 10 mikrolitre Fc gamma RII blokörü ekleyin.

Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. 10 milyon hücre başına beş mikrolitre fikoeritrin konjuge veya PE konjuge antihuman podoplanin veya PDPN antikoru ekleyin. Nazikçe karıştırın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçka yapın.

Her 10 milyon hücreye 10 mikrolitre seçim kokteyli ekleyin. Nazik karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın. Manyetik boncukları 30 saniye boyunca şiddetle karıştırmak için vortex mikser kullanın.

Her 10 milyon hücre için beş mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Etiketlenmiş hücre örneğini içeren beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpü manyetik ayırma standına yerleştirin.

Tüpe tampon ekleyin ve toplam hacmi 2,5 ila 3 mililitre çıkarır. Ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka yapın. Mıknatıs ve tüpü tek bir ünite olarak tutarak, onları ters çevirerek süpernatantı yeni bir toplama tüpüne dökebilirsiniz.

Toplanan PDPN negatif hücre fraksiyonunu buzun üzerine yerleştirin. Daha önce gösterildiği gibi manyetik ayırma prosedürünü üç kez tekrarlayın; her ayrımdan sonra süpernatantı aynı PDPN negatif fraksiyon toplama tüpüne dökebilirsiniz. Son yıkamadan sonra, manyetik olarak bağlanmış PDPN pozitif hücre fraksiyonunu içeren tüpü manyetik ayırma standından çıkarın.

Pozitif hücreleri yeniden askıya almak için üç mililitre tampon ekleyin. Pozitif fraksiyon hücresi süspansiyonunu yeni etiketlenmiş bir tüpe aktarın. Hem pozitif hem de negatif fraksiyon tüplerinden hücreleri say.

Her fraksiyon için hücre verimini kaydedin. Pozitif fraksiyon hücre süspansiyonunu 300 gramda üç dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. Hücre pelleti, %16,5 FBS içeren MEM alfa kültür ortamında yeniden askıya alın.

Hücre yoğunluğunu gerektiğinde ayarlayın ve hücreleri kültür plakalarına veya şişelere tohumlayın. Hücreleri %5 karbondioksit kuluçka makinesinde 37 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka yapın. Hücreler sayıldıktan sonra, onları 12 mililitre kültür ortamında her tabak başına üç milyon hücre yoğunluğunda 100 milimetrelik bir kültür kabına tohumlayın.

Tohumlamadan 24 saat sonra, hücre bağlanmasını gözlemleyin. Kültür ortamını, kalıntı manyetik boncukları ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için taze ortamla değiştirin. Hücreleri tripsizasyon yoluyla hasat edin.

Hücre süspansiyonunu 10-15 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin, manyetik boncukları ve kalıntı antikorları yerinden çıkarıp çıkarın. PDPN PE-pozitif hücrelerin yüzdesini akış sitometrisine göre değerlendirin. Logaritmik büyüme aşamasında hücreleri toplayın.

Hücreleri 96 kuyu ölçüsünde bir plakaya tohumlayın. Farklı zaman noktalarında, Cell Counting Kit-8m veya CCK-8, reaktif ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre absorbansı ölçün. Farklı zaman noktaları için ön ve sonradan sıralama verilerini GraphPad Prism yazılımında tablolayın, ardından yayılma eğrisini çizmek için verilere tıklayın.

FC reseptör bloklaması, antikor etiketleme ve manyetik ayrımdan sonra, nihai hücre sayısı PDPN pozitif fraksiyonu için yaklaşık 3,5 milyon hücre ve PDPN negatif fraksiyonu için 6,4 milyon hücre oldu. Manyetik sıralamadan önce, başlangıç hücre popülasyonunda PDPN pozitif hücrelerin sıklığı %38,7'ydi. Sıralamadan sonra pozitif fraksiyon %97,9 PDPN PE-pozitif hücreler içeriyordu. Negatif fraksiyonun akış sitometrisi analizi, PDPN pozitif hücrelerin %4,30'unun kaldığını ortaya koymuştur; bu da negatif fraksiyondan PDPN pozitif hücrelerin etkin şekilde tükendiğini göstermektedir.

Üç gün ardışık kültür boyunca PDPN pozitif hücrelerin proliferasyon eğrisi, sıralanmamış MSC'lere kıyasla anlamlı bir fark göstermedi; bu da sıralama stratejisinin CCK-8 bazlı proliferasyon veya metabolik aktivitede sortlanmamış MSC'lere kıyasla tespit edilebilir bir azalmaya yol açmadığını göstermektedir. Bu yaklaşım, araştırmaların alt popülasyonun yüksek saflık ve okunabilirlikle incelenmesini mümkün kılar. Bu protokolde en önemli husus, hücre okunabilirliğini korumak ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için nazik olmaktır.

Bu prosedürü takip ederseniz, araştırmalar proliferasyon testleri yapabilir, tortul ve deflasyon çalışmalarını takip edebilir.