ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma; Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırmalar Vakfı (2023A1515011278), Guangdong Eyaleti Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü Öz Kaynaklı Projesi (GDBRI-ZL202602) ve Kardiyovasküler Hastalık Modelleri ve Patogenezi üzerine Çin-Kanada Akademik Değişim ve İşbirliği (MS202500058) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), (2014).</li><li>Gao, E., Lei, Y. H., Shang, X., Huang, Z. M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 ile düzenlenmiş Cracd eksik bir fare modeli oluşturduk ve konvansiyonel ekokardiyografi, speckle‑tracking strain görüntüleme ve histoloji kullanarak MI sonrası fenotipleme için bir iş akışı kurduk. Protokol, CRACD protein kaybı doğrulanmış nakavtlar üretmiştir. Cracd eksik fareler, MI sonrası WT kontrollere kıyasla daha az ventriküler dilatasyon, daha iyi EF ve azalmış fibrozis göstermiş, bu da modelin kardiyak yeniden şekillenmeyi incelemedeki faydasını doğrulamıştır.
Bu modelin başarısı birkaç kritik adıma bağlıdır. gRNA tasarımı ve in vitro doğrulama, zigot düzenleme verimliliğini doğrudan etkiler.23CRISPRater skorları ≥ 0,5 olan gRNA'ları seçmek için CRISPick veya Benchling kullanıyoruz ve ardından bir in vitro Cas9/gRNA analizi ile kesim verimliliğini test ediyoruz. Yalnızca şu başarıyı elde eden gRNA'lar... &#62; Klivajların %50'si mikroenjekte edilir. Uygun LAD ligasyonu da aynı derecede kritiktir: Sağ ventrikülü delmeyi (çok derin) veya damarı tıkayamamayı (çok sığ) önlemek için 7-0 sütür, LAD başlangıcından 2-3 mm uzaklıkta ve 0,5-1 mm derinlikte geçirilmelidir; anterior duvarın anında beyazlaşması tıkanıklığı doğrular. Ekokardiyografi sırasında kalp hızının kontrol altında tutulması da esastır.24izofluranın (genellikle %1-2) ayarlanmasıyla 450–550 bpm değerinin korunması, konvansiyonel ve strain ölçümlerinin tekrarlanabilirliğini artırır. Son olarak, speckle‑tracking analizi için renk kodlu ağın görsel değerlendirmesi gereklidir25Ağ, sıçramalar olmadan miyokard sınırlarını takip etmelidir; aksi takdirde manuel iyileştirme gereklidir; üç denemeden sonra kalite hâlâ düşükse fare çalışma dışı bırakılır.
Protokol titizlikle takip edilse bile, bazı teknik zorluklar ortaya çıkabilir. Sistematik sorun giderme yöntemleri bunların çoğunu çözebilir. Düşük germ hattı iletim oranları (%10'un altı), genellikle zayıf donör oligonükleotid entegrasyonuna veya düşük gRNA aktivitesine işaret eder26. Sonuç olarak, donör oligonükleotidin 20 ng/µL'ye çıkarılması, homoloji kollarının 120–200 bp'ye uzatılması ve gRNA kesiminin (&gt; %50) yeniden kontrol edilmesi iletimi artırabilir. MI sonrası yüksek mortalite (%30'un üzeri), sıklıkla pnömotoraks, kanama ve geniş enfarktüsten kaynaklanır27. Bu nedenle, farelerin uyanana kadar sürekli oksijen altında tutulması ve vücut sıcaklığını korumak için bir ısıtma pedi kullanılması ölüm oranlarını belirgin şekilde düşürür. Ligasyondan sonra ön duvar soluklaşmıyorsa, LAD muhtemelen yanlış tanımlanmıştır veya sütür çok yüzeyeldir. Bu durumda, LAD'nin (parlak kırmızı diagonal bir damar) yeniden konumlandırılması ve iğnenin, bazen bir diseksiyon mikroskobu eşliğinde, 0,5–1 mm derinliğe yeniden geçirilmesi bu sorunu çözer. Kötü speckle-tracking kalitesi için düşük kare hızı, bulanık sınırlar veya hareket artefaktları olağan nedenlerdir28. Buna göre, kare hızının artırılması, kazancın (gain) ince ayarının yapılması, endokardiyal izin manuel olarak düzeltilmesi ve aritmi içeren döngülerin dışlanması yardımcı olur.
Bu operasyonel hususların ötesinde, yöntemin belirgin sınırlamaları vardır. Cracd nakavtı globaldir, bu nedenle CRACD tüm dokularda eksiktir. Sonuç olarak, sistemik katkılar da rol oynayabileceği için gözlemlenen koruma yalnızca kardiyomiyositlere atfedilemez. Hücre tipine özgü rolleri birbirinden ayırmak için koşullu bir nakavt gerekecektir. Bir diğer sınırlama ise 7. gündeki tek zaman noktasıdır; kronik yeniden şekillenme hakkında herhangi bir bilgi edinilememektedir. Bu nedenle, uzun süreli çalışmalar için daha geç zaman noktaları (4 veya 8 hafta) eklenmelidir. Tekrarlanabilirlik ayrıca görüntü kalitesine bağımlılıktan etkilenmektedir: her ultrason sistemi temiz endokardiyal sınırlar sağlayamaz ve operatör deneyimi önem taşır. Bu nedenle, tüm cerrahi işlemlerin ve ölçümlerin profesyonelce eğitilmiş bir kişi tarafından gerçekleştirilmesi önerilir.
Bu kısıtlamalar göz önüne alındığında, yaklaşımımızı post-MI yeniden yapılanmasında gen fonksiyonunu incelemeye yönelik alternatif stratejilerle karşılaştırmak faydalıdır. AAV aracılı gen manipülasyonu ve antisense oligonükleotidler (ASO'lar) yaygın kullanılan iki alternatiftir29,30. AAV9, herhangi bir üretim gerektirmeden kalp spesifik, geçici overekspresyon veya knockdown sağlayabilir; ancak paketleme sınırı (~4.7 kb), değişken transdüksiyon verimliliği ve hedef dışı etkileri dezavantajlarıdır31. Buna karşılık, CRISPR/Cas9 knockout modelimiz, uzun süreli çalışmalar için avantaj sağlayan kalıcı ve tam fonksiyon kaybı sunar. ASO'lar, hızlı başlangıçla geri dönüşlü ve doz bağımlı knockdown sağlayarak onları akut müdahaleler için uygun kılar; ancak tekrarlayan dozlama gerektirirler ve doku spesifisitesinden yoksundurlar32. Bu nedenle, burada açıklanan konstitütif knockout, ilk keşif ve kronik fenotipleme için en uygun yöntemdir.
Son olarak, protokol CRACD'nin çok ötesine genişletilebilir. Aynı iş akışı —CRISPR/Cas9 ile nakavt farelerin oluşturulmasının ekokardiyografi, strain görüntüleme ve histoloji ile birleştirilmesi— MI sonrası remodeling sürecindeki herhangi bir aday geni değerlendirmek için kullanılabilir. Fenotipleme çerçevesi, transvers aortik konstriksiyon (basınç aşırı yüklenmesi) veya iskemi-reperfüzyon hasarı gibi diğer kardiyovasküler hastalık modellerine de uygundur. Ayrıca, bu protokolden elde edilen doku örnekleri, moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak amacıyla multi-omik analizler (transkriptomik, proteomik, metabolomik) için kullanılabilir. Cracd eksiklik modeli, ilaç testleri için bir araç olarak hizmet edebilir: CRACD yolu üzerinden etki ettiği düşünülen bileşikler değerlendirilebilir. Böylece bu protokol, kardiyovasküler araştırmalarda geniş bir yelpazedeki mekanistik ve translasyonel çalışmalara uyarlanabilir bir platform sunmaktadır.

Miyokard enfarktüsü (MI), dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmekte ve küresel kardiyovasküler sağlık üzerinde önemli bir yüke katkıda bulunmaktadır1. MI sonrası uzun vadeli prognoz, öncelikle ventriküler dilatasyon, duvar incelmesi ve interstisiyel fibrozisi içeren3,4 ve kalp yetmezliğine (HF) ilerlemenin temel belirleyicileri olan sol ventrikül (LV) yeniden şekillenme süreciyle belirlenir2. Post-MI kardiyak yeniden şekillenme sonucu ortaya çıkan HF'nin küresel insidansı, kardiyovasküler hastalık yükünü daha da artırmaktadır5. Bu yerleşik klinik gözlemlere rağmen, post-MI yeniden şekillenmede spesifik genlerin rolünü değerlendirmek için hassas ve tekrarlanabilir in vivo modeller kullanan sistematik çalışmalar eksiktir. Mevcut hiçbir protokol, CRACD gibi bir hücre iskeleti regülatörünü değerlendirmek için CRISPR/Cas9 ile mühendisliği yapılmış bir nakavt modelini gelişmiş strain görüntüleme ile birleştirmemektedir. Bu nedenle, hassas genetik manipülasyon ve yüksek çözünürlüklü kardiyak fenotipleme sağlayan bir yönteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
KIAA1211 olarak da bilinen aktin dinamiğinin inhibe edici regülatörü kaplama proteini (CRACD), ağırlıklı olarak sitozolde yerleşmiş olan ve hücre iskeleti dinamiklerinde kritik bir rol oynayan bir aktin polimerizasyon regülatörüdür6. Aktin kaplama proteinlerine (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) bağlanarak ve onların aktin filamentlerinin dikenli uçlarını kaplamasını önleyerek aktin polimerizasyonunu pozitif yönde regüle eder7. Epitel dokularda CRACD, aktin hücre iskeletinin bütünlüğünü koruyarak hücre morfolojisinin ve sinyal iletiminin sürdürülmesinde kritik bir rol oynar8,9. Tümör hücrelerinde, regülasyon bozukluğu artan hücre metastazı ve proliferasyonu ile ilişkilidir6,10. CRACD'nin kalpteki rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Kardiyak transkriptom ve deneysel müdahale çalışmaları, Cracd gen ekspresyonunun patolojik strese yanıt verdiğini ve ventriküler yeniden yapılanma sırasında hücre iskeleti dinamikleriyle ilgili genleri regüle edebileceğini göstermektedir9,11. Ayrıca, inhibe edici proteini CapZ, kardiyak patoloji ile yakından ilişkilendirilmiştir: CapZ'nin fosforilasyonu, fenilefrin tarafından indüklenen hipertrofi sırasında miyofibrillerin büyümesini regüle eder12. Erken dönem araştırmalarımız, CRACD'nin orta düzeyde downregülasyonunun miyokard hasarına karşı koruma sağladığını ve akut iskemi sonrası miyofilaman kontraktilitesini koruduğunu göstermektedir13. Bu bulgular, CRACD'nin MI sonrası maladaptif ventriküler yeniden yapılanmada rol oynama olasılığını ortaya koymaktadır. Ancak, büyük ölçüde iskemik stres altındaki Cracd-eksik bir farenin üretilmesi ve fenotiplendirilmesi için doğrulanmış adım adım bir protokolün bulunmaması nedeniyle, Cracd eksikliğinin MI sonrası yeniden yapılanmayı modüle edip etmediğini test eden sistematik in vivo fonksiyon kaybı çalışmaları eksik kalmıştır.
Konstitütif nakavt farelerin üretilmesi için çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Embriyonik kök (ES) hücrelerinde uygulanan geleneksel homolog rekombinasyon hassas olsa da maliyetli, zaman alıcı (12–18 ay) ve belirli fare suşlarıyla sınırlıdır14. ENU (N‑etil‑N‑nitrozüre) mutajenezi, kapsamlı geri çaprazlama ve sekanslama gerektiren rastgele nokta mutasyonları oluşturur15. Buna karşın CRISPR/Cas9, bu çalışma için belirgin pratik avantajlar sunmaktadır: (i) doğrudan zigot enjeksiyonu süreci 4–6 aya indirir; (ii) fonksiyon kaybının tamamen gerçekleşmesini sağlamak için geniş bir genomik fragmanın (3153 bp) silinmesine olanak tanır; (iii) suş dönüşümüne gerek kalmadan doğrudan C57BL/6N arka planında çalışır ve (iv) seçilebilir bir belirteçten kaçınarak istenmeyen transkripsiyonel girişimi minimize eder. Bu nedenle CRISPR/Cas9, rutin kardiyovasküler fenotipleme için uygun, Cracd eksik bir hat oluşturmak için en verimli seçenektir. Bu teknoloji, hassas in vivo fonksiyon kaybı çalışmalarının yürütülmesinde yaygın olarak kullanılmıştır16,17.
Speckle-takip strain görüntüleme, miyokard içerisindeki doğal akustik speckle'ların hareketini kare kare takip eden bir işlem sonrası tekniktir; bu yöntemle strain (uzunluktaki fraksiyonel değişim) ve strain hızı (deformasyon hızı) gibi miyokardiyal deformasyon parametrelerinin hesaplanması sağlanır18. Global fonksiyonel indeksler (ejeksiyon fraksiyonu, fraksiyonel kısalma, sol ventrikül internal çapı) sağlayan ve bölgesel duvar hareket bozukluklarına karşı nispeten duyarsız olan geleneksel M-modu veya iki boyutlu ekokardiyografinin aksine, strain görüntüleme segmental kontraktil fonksiyonu nicelendirebilir. Bu durum, enfarkt geçirmemiş segmentlerin kompanse edici hiperkinezinin, belirgin bölgesel disfonksiyona rağmen global ejeksiyon fraksiyonunu koruyabildiği erken post-enfarkt döneminde özellikle önemlidir. Speckle-takip, standart son noktalara kıyasla çeşitli avantajlar sunar: segmental strain ve strain hızı, deplasman ve hız değerleri sağlayarak hafif subklinik değişiklikleri tespit eder19; geri dönüşümsüz remodeling gerçekleşmeden önce dissenkroniyi ve erken kontraktil eksiklikleri tanımlayabilir ve iskemiye karşı en hassas tabaka olan subendokardiyumu doğrudan sorgular20. Bu çalışmada CRACD, mikroskobik düzeyde miyofiber kontraktilitesini etkileyebilen bir sitoskeletal regülatördür. Geleneksel kavite tabanlı ölçümler, bu tür yerel mekanik etkileri kolayca gözden kaçırabilir. Bu nedenle, speckle-takip analizinin bu protokole entegre edilmesi, Cracd eksikliğinin erken koruyucu etkilerini tespit etme yeteneğini artırır. Buna bağlı olarak, speckle-takibin bu protokole entegrasyonu, özellikle erken dilatasyon ve kontraktil disfonksiyonun ortaya çıktığı MI sonrası ilk hafta boyunca post-enfarkt remodeling'i değerlendirmek için hassas ve kantitatif bir araç sağlar21,22.
Bu protokol, konstitütif nakavt ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kombinasyonunu kullanarak, belirli bir gen delesyonunun akut (7 günlük) MI sonrası yeniden şekillenme üzerindeki fonksiyonel etkisini araştıran araştırmacılar için tasarlanmıştır. Hedef genin global kaybının kabul edilebilir olduğu ve temel sonlanım noktasının erken sistolik fonksiyon ve yapısal değişiklikler olduğu hipotez üretici çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, Cracd eksik fare global bir nakavttır; bu nedenle, sistemik katkılar da rol oynayabileceği için gözlenen kardiyoprotektif etkiler yalnızca kardiyomiyositlerdeki CRACD kaybına atfedilemez. Kalbe özgü delesyon sağlamak için koşullu nakavt stratejilerinin kullanıldığı gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. İkinci olarak, protokol tek bir zaman noktasına (7. gün) odaklanmaktadır ve kronik yeniden şekillenmeyi veya HF progresyonunu ele almamaktadır. Akut fazın ötesinde boylamsal çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. Üçüncü olarak, speckle-tracking analizi, tüm merkez tesislerde mevcut olmayabilecek yüksek kaliteli görüntüler (net endokardiyal sınırlar) ve özel yazılım gerektirir. Bu sınırlamalara rağmen protokol, MI sonrası kardiyak yeniden şekillenmede rol oynayan genlerin ilk fonksiyonel karakterizasyonu için sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sunmaktadır.
Bu çalışma, MI sonrası kardiyak yeniden şekillenme ve ventrikül duvar hareketi üzerindeki Cracd eksikliğinin etkisini incelemek amacıyla, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak Cracd-eksik bir fare modeli (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 to c.3352+255 del)) oluşturmayı ve doğrulamayı hedeflemiştir. Hem yabanıl tip (WT, C57BL/6N) hem de Cracd-eksik farelerde MI indüklenmiş ve MI'dan bir hafta sonra kapsamlı değerlendirmeler yapılmıştır. Değerlendirmeler; konvansiyonel ekokardiyografik parametreleri, speckle-tracking strain analizini ve histopatolojik değerlendirmeyi içermektedir. İlk yeniden şekillenme olaylarını yakalamak ve Cracd eksikliğinin MI'ın akut evresinde ventriküler dilatasyonu ve sistolik fonksiyonu etkileyip etkilemediğini belirlemek için özellikle erken MI sonrası faza (7. gün) odaklanılmıştır. Bulguların, MI sonrası advers kardiyak yeniden şekillenmenin modülasyonunda CRACD'nin rolüne dair değerli bilgiler sunması beklenmektedir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hidroklorür Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>DNA ekstraksiyon tamponu hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Fare kuyruğu sindirimi için kullanılır</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>P131</td><td>PCR amplifikasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>BioFroxx, Germany</td><td>1110GR500</td><td>1&amp;ndash;2% konsantrasyonda DNA jel elektroforezi için kullanılır</td></tr><tr><td>DNA Markörü</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>PCR ürünlerinin boyutlandırması için DNA merdiveni olarak kullanılır</td></tr><tr><td>TIANamp Genomik DNA Kiti</td><td>Tiangen Biotech, China</td><td>DP304</td><td>Fare kuyruğu dokusundan genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; T7 transkripsiyon kiti</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>gRNA'nın in vitro transkripsiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>RNA saflaştırma kiti</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Transkribe edilen gRNA'yı saflaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNA Tarama Kiti</td><td>Beyotime, China</td><td>D8412S</td><td>gRNA kesim aktivitesinin in vitro değerlendirmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>RNaz inhibitörü</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>In vitro transkripsiyon sırasında RNA degradasyonunu önlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>R001A</td><td>Fare kuyruğu DNA'sının PCR genotiplemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; Fare Sperm Preinkübasyon Ortamı: PM</td><td>Cosmo Bio, Japan</td><td>KYD-002-EX</td><td>In vitro fertilizasyon öncesi sperm kapasitasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA Kiti</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Cas9 mRNA'sının in vitro transkripsiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Gebe kısrak serum gonadotropini</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Süperovülasyon için kullanılır, intraperitonal enjeksiyonla uygulanır</td></tr><tr><td>İnsan koryonik gonadotropini</td><td>ProSpec, Israel</td><td>HOR-250</td><td>Ovülasyon indüksiyonu için kullanılır, intraperitonal enjeksiyonla uygulanır</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>Aladdin, China</td><td>R665526</td><td>RNA çözündürme ve PCR kurulumu için kullanılır</td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>/</td><td>Genotipleme için kullanılır</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cerrahi&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>RWD Life Science, China</td><td>R510-22-10</td><td>Cerrahi sırasında anestezinin indüksiyonu ve idamesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Veet, France</td><td>1000207</td><td>Cerrahi ve ultrason öncesi tüyleri temizlemek için göğüs bölgesine uygulanır</td></tr><tr><td>7-0 Sütür</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ7022380206</td><td>Sol anterior descendant (LAD) koroner arterin kalıcı ligasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>4-0 Sütür</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ4022380412</td><td>Cerrahi sonrası cilt insizyonunu kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Anestezi ventilatörü</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>İzofluran iletimi ve solunum desteği için kullanılır</td></tr><tr><td>Küçük hayvan ventilatörü</td><td>Taimeng, China</td><td>HX-101E</td><td>Açık göğüs cerrahisi sırasında pozitif basınçlı ventilasyon sağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sabit sıcaklıklı ısıtma pedi</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Cerrahi ve iyileşme sürecinde fare vücut sıcaklığını korumak için kullanılır</td></tr><tr><td>Kaburga retraktörü</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>LN-18-4101</td><td>Kaburgaları ayırmak ve LAD ligasyonu için kalbi açığa çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-0551</td><td>Cilt insizyonları yapmak ve doku kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Stereoskopik mikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ 745</td><td>LAD arter ligasyonu cerrahisi sırasında büyütülmüş bir görünüm sağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskobik iğne tutucu</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-2211</td><td>Mikroskop altında küçük 7-0 sütür iğnesini manipüle etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Kimyasallar ve reaktifler&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik kuplaj ajanları</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, China</td><td>TM-100</td><td>Ekokardiyografi için göğse uygulanır, uygun prob temasını sağlar</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Hasat sonrası kalp dokusu fiksasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Macklin, China</td><td>1330-20-7</td><td>Parafin giderme ve boyama öncesi doku şeffaflaştırma için kullanılır</td></tr><tr><td>Hematoksilin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Çekirdek boyası, HE boyamasında kullanılır</td></tr><tr><td>Eozin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Sitoplazmik boya, HE boyamasında kullanılır</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Masson boyamasında sitoplazma boyama için kullanılır</td></tr><tr><td>Fosfomolibdik asit</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Masson boyamasında mordan ve diferansiyasyon için kullanılır</td></tr><tr><td>Anilin mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Masson boyamasında kollajen lif boyama (mavi) için kullanılır</td></tr><tr><td>CRACD antikoru</td><td>Absea, China</td><td>KC-35356</td><td>Western Blot ile CRACD proteinini saptamak için primer antikor, dilüsyon 1:2000</td></tr><tr><td>GAPDH antikoru</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Western Blot için yükleme kontrol antikoru, dilüsyon 1:5000</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Macklin, China</td><td>64-17-5</td><td>Dehidrasyon ve reaktif hazırlama için kullanılır (%70, %80, %95, %100 derecelerde)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratuvar ekipmanları&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17 Santrifüj</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Rutin örnek hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>PCR Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>DNA amplifikasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon sistemi</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5193000020</td><td>CRISPR/Cas9 reaktiflerinin zigotlara mikroenjeksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Vevo 2100 Görüntüleme Sistemi</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>Vevo2100</td><td>MI sonrası kalp fonksiyonlarının ve yapısının non-invaziv değerlendirmesi için yüksek frekanslı görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Işık Mikroskobu</td><td>Leica, Germany</td><td>DM2500</td><td>HE ve Masson boyalı kalp kesitlerini gözlemlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Analiz yazılımları&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Alan ölçümü, sinyal kantifikasyonu ve histolojik görüntülerin (HE ve Masson boyama) işlenmesi dahil olmak üzere görüntü analizi için kullanılır</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>/</td><td>Kardiyak fonksiyon analizi için VevoLab yazılımı; MI sonrası kardiyak performansı değerlendirmek için miyokardiyal strain analizi yapan VevoStrain modülü</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>İstatistiksel analiz ve grafik hazırlama için kullanılır</td></tr></tbody></table>

miyokard enfarktüsü sonrası yeniden Şekillenme Çalışmaları İçin crispr/cas9 ile düzenlenmiş cracd-eksik fare modelinin Üretimi ve fenotipik karakterizasyonu

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myokard infarktüsü (MI) dünya çapında morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir. Bu protokol, bir MI modelinin oluşturulmasını ve karakterizasyonunu sağlayan bir yöntem tanımlamaktadır. CracdC57BL/6N arka planında CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak CRACD eksik fare hattı oluşturuldu. Zigotlara, 3153-bp'lik genomik bir silinme oluşturacak şekilde tasarlanmış Cas9 mRNA'sı, bir gRNA yapısı ve bir donör şablonu birlikte enjekte edildi. Düzenlenmiş alel, PCR genotipleme ve Sanger dizileme yöntemiyle doğrulandı. CRACD'nin post-MI remodelleme sürecindeki fonksiyonel rolünü değerlendirmek amacıyla Cracd-eksik ve vahşi tip (WT, C57BL/6N) farelerde sol ön inen koroner arterin kalıcı ligasyonu ile miyokard infarktüsü (MI) oluşturuldu. Postoperatif 7. günde transtorasik ekokardiyografi ve nokta izleme birim görüntüleme yöntemiyle kardiyak fonksiyonlar ve sol ventrikül duvar hareketleri değerlendirildi, ardından H&amp;&E ve Masson trikrom boyama. Temsili sonuçlar, bunu gösterdi: Cracdeksik farelerde ventriküler dilatasyon azalmış ve sistolik fonksiyon WT kontrol gruplarına kıyasla korunmuştur. Bu protokol, kardiyak patofizyolojide CRACD'nin mekanistik çalışmalarına güvenilir bir deneysel platform sunar.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Bu protokol, miyokard enfarktüsü sonrası kardiyak yeniden şekillenmede CRACD'nin rolünü incelemek amacıyla CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bir C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) fare modelinin oluşturulmasını ve fenotipik karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeniden Şekillenme Çalışmaları İçin CRISPR/Cas9 ile Düzenlenmiş Cracd-Eksik Fare Modelinin Üretimi ve Fenotipik Karakterizasyonu

Miyokard enfarktüsü (MI), dünya genelinde morbidite ve mortalitenin başlıca nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Bu protokol, ... üretmek ve karakterize etmek için bir yöntemi tanımlamaktadır.

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz tekrar elde edilebilirliğini arttırmak için, sol ön inen arter (LAD) üzerine ligasyon konumlandırma daha fazla netlik sağlar fare modellerinde miyokard infarktüsü (MI) simüle etmek için deneysel iskemi / reperfüzyon (I / R) hasarı ikna etmek için bir cerrahi yöntemi tanıtmak Farelerde MI deneyler.

Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

Kalp yetersizliği hastaneye yatışların önde gelen nedeni ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Miyokard enfarktüsü sonrası ventriküler yeniden şekillenme ve kardiyak disfonksiyonu araştırmak için farelerde sol ön inen koroner arterin kalıcı ligasyonu modeli uygulanır. Farelerde invaziv hemodinamik ölçüm tekniği sunulmuştur.

Farelerde Sol Ön İnen Koroner Arter Daimi ligasyonu: Post-miyokard Enfarktüs Remodelling ve Kalp Yetmezliği Bir Model

Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Burada farelerde sol anterior inen koroner arterin kalıcı ligasyonunun nasıl elde edilebildiğini gösteren bir cerrahi prosedürü açıklıyoruz. Bu model miyokard enfarktüsü ve eşlik eden biyolojik süreçlerin patofizyolojisini araştırmak için yüksek öneme hemşilir.

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Bu makalede farelerde miyokardiyal kriyoyaralanma sonrası kardiyak remodeling çalışma modeli göstermektedir.

Farede Miyokard Enfarktüsü Çalışması İçin Kriyoyaralanma Modeli

Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve...

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Sağ ve sol ventriküller arasında birkaç fark vardır. Ancak sağ ventrikül enfarktüsünün (RVI) patofizyolojisi aydınlatılamamıştır. Mevcut protokolde, RVI fare modeli üretimi için RVI'nın mekanizmasını açıklamak için bir araç sağlayabilecek tekrarlanabilir bir yöntem tanıtılmıştır.

Farelerde Sağ Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile İndüklenen Sağ Ventrikül Miyokard İnfarktüsünün Oluşumu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Fototromboz son derece tekrarlanabilir bir şekilde ilgi alanları küçük ve iyi ayrılmış enfarktüsü uyaran için hızlı, minimal invaziv bir tekniktir. Bu transgenik farelerde beyin plastisitesi oluşturan hücresel ve moleküler okuyan cevapları için özellikle uygundur.

Photothrombotic İskemi: Fare İnme Araştırmalar bir Minimal İnvaziv ve tekrarlanabilir fotokimyasal Kortikal Lezyon Model

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeniden Şekillenme Çalışmaları İçin CRISPR/Cas9 ile Düzenlenmiş Cracd-Eksik Fare Modelinin Üretimi ve Fenotipik Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet