İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitokondri Hücre fizyolojisinde metabolizma ve enerji üretiminden hücre ölümünü programlamaya ve steroid hormon sentezine kadar çok sayıda rolü vardır. Mitokondrinin hem temel hücresel fonksiyonlarda hem de hastalıkta önemine rağmen, mitokondrinin insan embriyonik kök hücrelerindeki ve farklılaşmış soylarındaki işlevi hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu videoda, insan amry kök hücrelerinin mitokondri solunum zinciri komplekslerinin Ingel aktivite testleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini göstereceğiz.

Merhaba, ben California Los Angeles Üniversitesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nde Michael Tetel'in laboratuvarından Ivan OV. Bugün size insan embriyonik kök hücrelerinde mitokondriyal solunum kompleksi fonksiyonunu değerlendirmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu jel aktivitesindeki bu değerlendirme, bu prosedürün insan embriyonik kök hücrelerinden ham mitokondriyal damağın izolasyonunu, eksüdatif fosforilasyon sisteminin mitokondriyal komplekslerinin daha yüksek çözünürlüklü berrak doğal poli akrilamid jel elektroforezi ile ayrılmasını ve ardından jel aktivitesinde sa'yı içerir.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedürdeki ilk adım, mitokondriyi insan embriyonik kök hücrelerinden izole etmektir. Bu tahlil için, besleyici içermeyen bir durumda matrigel kaplı bir plaka üzerinde büyütülen insan embriyonik kök hücrelerini kullanacağız.

İnsan amry kök hücrelerimizden mitokondri toplamak için, onları ılık bir XPDS pH 7.4 ile yıkayarak başlıyoruz ve ardından hücreleri beş dakika boyunca tripsin ediyoruz. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına bir mil bir x tripsin kullanabilirsiniz. Beş dakika sonra, bir XPBS'ye mil başına bir miligram eşit hacimde taze tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurabilir ve hücreleri hasat edebilirsiniz.

Toplanan hücreler daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjlenir. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı atın ve yeniden canlandırın, peletlenmiş hücreleri 0.8 ila 1.7 mililitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponunda taze hazırlanmış bir x proteaz inhibitörü kokteyli ile askıya alın. Ne kadar tampon kullandığınız, aldığınız hücre peletinin boyutuna bağlıdır Pelet yeniden süspanse edildikten sonra, yaklaşık 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Hücreleri bir homojenizatör ile inkübe ettikten sonra, bu yaklaşık 40 ila 50 vuruş sürebilir. DOD hücrelerinin bir alikotunu trian mavisi ile boyayarak ve bir ışık mikroskobuna bakarak homojenizasyonun tam listesini kontrol edebiliriz. Böyle bir şeye benzemeli.

Bu, bir iniş ile 50 vuruştan sonraki ilk atıştır. Bu, bir çıkışla 80 vuruştan sonraki ikinci atıştır. Hücreler homojenize edildikten sonra, dört derece C'de 10 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleyin ve bu bize çekirdek ve daha büyük hücre parçaları içerecek ham bir mitokondriyal pelet verecektir.

Peletin toplanmasından önce, sonraki pelet ağırlığını tahmin etmek için toplama tüpünü tartmamız, süpernatanı döküp atmamız ve ardından çökeltilmiş ham mitokondriyal peleti tartmamız gerekir. Bu noktada tüpün ağırlığını çıkararak, bir sonraki adımda gösterilecek olan peletin çözündürülmesine devam edilebilir. Ham mitokondriyal peleti çözündürmek için, peleti buz üzerinde tutarak ve 35 mikrolitre buz gibi soğuk çözündürme tamponu ile vorteksleyerek başlıyoruz.

Sahip olduğumuz her 20 miligram pelet için tampon bileşikleri hakkında ayrıntılı bilgi ekteki yazılı protokolde belirtilmiştir. Girdaplama ve çözündürme tamponunun eklenmesini takiben ve digit toin eklemeden önce, yeniden askıya alınmış peleti yüksek hızlı santrifüjleme için uygun bir tüpe aktarıyoruz ve daha sonra 20 miligram pelet ağırlığı için hacim başına 20 mikrolitre ağırlık% 10 ağırlık ekliyoruz ve iyice karıştırıldıktan sonra tüpü hafifçe vurarak karıştırıyoruz, mitokondriyal peleti buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe edin. Doil beta D çok taraflı veya DDM veya Triton X 100, çözünmüş proteinlere rakam toin ile ikame edilebilir.

Deterjan seçimi ve miktarı, buz üzerinde inkübasyonu takiben supra komplekslerin veya multimerik mitokondriyal kompleks formlarının oluşumunu etkileyebilir. Ve pelet çözündürüldükten sonra, dört derece C'de 15 dakika boyunca yüz bin kez G'de santrifüjleyeceğiz, daha sonra berrak süpernatanı toplayacağız. Artık mitokondrinin doğal gradyan jel elektroforezi için süpernatanı gradyan jelimiz üzerinde çalışmaya hazırlamaya hazırız.

%3,5 istifleme jeli ile %5 ila %13 arasında bir akrilamid gradyan jeli kullanmanızı öneririz. Jeli hazırlamak için, yazılı protokolde anlatıldığı gibi bir akrilamid bis akrilamid karışımı kullanacağız. Akrilamid bis akrilamid çözeltisi önceden hazırlanır ve karanlık bir yerde dört santigrat derecede saklanır.

Akrilamid ve bis akrilamid hem toz hem de sıvı formda toksik kimyasallardır, bu nedenle onlarla çalışırken özel dikkat gösterilmelidir. Akrilamid bis akrilamid çözeltisini, pH 7.0'da 1.5 molar altı amino hekzanoik asit ve 75 milimolar olden oluşan üç x jel tamponundan oluşan bir alikot ile birleştiriyoruz. Tampona eklediğimiz akrilamid bis akrilamid çözeltisinin miktarı, gradyan jeli yapmak için yaptığımız jel yüzdesine bağlı olacaktır.

Bir% 4 karışım ve% 13 karışım yapacağız ve istifleme jeli% 3.5'lik bir karışım olacaktır. % 13'lük karışıma gliserol eklemeyi unutmayın. Her üç karışım da hazır olduğunda, karışımlara sülfat ve temid başına uygun miktarda amonyum ekliyoruz ve karışımları gradyan eski bir döküm odasına döküyoruz.

Haznenin sol kısmı %5'lik karışımı içerir. Haznenin sağ kısmı, küçük bir manyetik karıştırma çubuğunda %13'lük karışımı içerir. Haznenin sağ kısmını açarak jeli dökmeye başlıyoruz.

Sonra hemen haznenin sol kısmını açıyoruz ve gradyanı elde etmek için %5'lik çözeltinin %13'lük bir çözelti ile karışmasına izin veriyoruz. Polimerizasyondan sonra jel için keskin bir düz sınır oluşturmak için jelin üstüne az miktarda izopropanol ekliyoruz. Yaklaşık bir saat sonra gradyan jelin polimerizasyonu tamamlandığında, izopropanolü çıkarır ve 3.5 istifleme jelini aparatın içine döker ve bir jel tarağı yerleştiririz.

Jelleri yaklaşık dört ila yedi santigrat derece soğuk bir odada bir araya getirip çalıştıracağız. Bu jeli çalıştırmak için iki farklı tampon kullanacağız. Anot odasında, 25 milimolar ole hidroklorik asit pH 7.0 içeren bir tampon kullanacağız.

Katot tamponu, 50 milimetre trik, 7.5 milimolar ole hidroklorik asit, hacim başına %0.02 ağırlık, doil beta D çok taraflı veya DDM ve hacimce %0.05 ağırlık, deoksi kaplama pH 7.0 içerecektir. Süpernatanı az önce döktüğümüz jelde çalıştırılacak şekilde hazırlamak için, ağırlıkça %5 hacim gliserol ve ağırlıkça %0.01'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yükleme tamponu eklenir. Ponto S, tipik olarak doğrudan süpernatanlara gliserol ve panço içeren 10 x stok çözeltisi ekleriz.

Artık jel örneğini jelin üzerine yüklemeye hazırız. Jel kuyularına, şerit başına 20 ila 40 miligram ham mitokondriyal protein içeren bir hacim yükleyeceğiz. Yüklemeden hemen sonra jel 100 voltta çalıştırılır.

Numune istifleme jeline girdikten sonra, akım 15 miliamper ile sınırlı olacak şekilde voltaj 500 volta yükseltilebilir. Jeli genellikle gece boyunca 70 ila 100 voltta çalıştırmamıza rağmen, kırmızı zos boyasının keskin bir çizgisi jel önüne yaklaştığında elektroforezi durdururuz. Artık jel çalıştırıldığına göre, farklı protein komplekslerinin aktivitesini doğrudan jel içinde analiz edebiliriz.

Her tahlil için inkübasyon süresi, protein çözündürmesinin verimliliğine ve oyuk başına yüklenen malzeme miktarına bağlıdır. Bir, dört ve beşinci kompleksler genellikle ikinci ve üçüncü komplekslerden daha güçlü sinyaller verir. Bu nedenle kompleks iki ve üç için boyama süresi daha uzun olmalıdır.

Karmaşık aktiviteyi test etmek için, her kompleks için özel tamponlar kullanmamız gerekecek. Bireysel tamponlar için malzemeleri yazılı protokolde bulabilirsiniz. Şimdi jelin tek tek şeritlerini keseceğiz Ingel aktivite testlerini ayrı ayrı gerçekleştirmek için.

Tüm kompleksler için, jel dilimini, kompleks beş hariç tüm kompleksler için oda sıcaklığında birkaç saat boyunca ilgili tamponlarında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, jeli 15 ila 45 dakika boyunca% 50 metanol ve% 10 asetik asit içinde sabitleyin. Sabit jel% 10 asetik asit içinde korunur.

Burada karmaşık olanın lekelenmesinin nasıl göründüğünü görüyorsunuz. Jel diliminde karmaşık olana karşılık gelen bir koyu mor bant vardır. Berrak jeller, mitokondriyal kompleks aktivitelerden dansitometri yapmanıza ve karşılaştırmalı analizler yapmanıza olanak tanır.

Yoğun sitometriden sonra, jel dilimlerini genellikle uzun süreli depolama ve / veya yüksek kaliteli bir görüntü kompleksi elde etmek için tarama için kuruturuz, iki leke aynı mor renkte bir kompleks üç ve kompleks dört olarak bulunur. Her ikisi de turuncu veya sarımsı bir boyama bandı verir. İşte karmaşık iki, üç ve dört boyama aktivitelerine örnekler.

İnsan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen ve doğal jel elektroları da dahil olmak üzere daha yüksek çözünürlükle ayrılan mitokondriyal eksüdatif asyon komplekslerinin aktivitesini nasıl analiz edeceğinizi az önce gösterdik. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve denemenizde iyi şanslar.