Name: İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde mitokondrial solunum zinciri komplekslerinin in-gel aktivite analizi yöntemini. Bu teknik, hücre fizyolojisi ve kök hücre biyolojisindeki mitokondrial fonksiyonları anlamak için araştırmacılara değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teitell laboratuvar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları henüz California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Biz bu ve ek çalışmalar tavsiye ve anlayışlar sağlamak için Dr. Carla Köhler (UCLA) ve Köhler, laboratuvar üyelerine teşekkür ederim.

Mitokondrial Kompleksi için Yüksek Çözünürlüklü Temizle Doğal Jel Electophoresis (hrCNE)-Gel Aktivitesi Tahliller İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) standart koşullar kullanarak MEF-klimalı ortamda 5 gün sonra Matrigel büyüme geçiş ˠ ışınlanmış veya mitomisin C ile tedavi edilen fare embriyonik fibroblastlar (MEFS), bir tek tabaka üzerinde tutuldu. MEFS kirlenmesine neden kaldırmak için, hESC Matrigel yeniden kaplama ve ek olarak 3 gün boyunca MEF-klimalı ortamda yetişen. Pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 İmmünofloresan mikroskopi hESC farklılaşma olmaması onaylamak için kullanılır oldu. <ol><li> , 5 dakika boyunca trypsinization (6 plaka kişi başına 1ml 1x tripsin) takip ılık 1x PBS, pH 7.4, hücreleri yıkayın. </li><li> Taze tripsin inhibitörü eşit hacmi (1x PBS, pH 7.4 1mg/ml) ekleyin. Hasat hücreleri ve 200g az santrifüj, 5 dakika, oda sıcaklığında. </li><li> Taze hazırlanmış 1 &#39;Proteaz İnhibitör Kokteyl; 1.7ml (hücre pelet boyutu dayalı), buz gibi mitokondri izolasyon tamponu (6.6mM imidazol / HCl, pH 7.0 83mm sakkaroz) - 0.8 supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri atın. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Homojenizatör (- 50 vuruş ~ 40) ile hücreler Dounce. Tripan mavisi ile dounced hücrelerinin ışık mikroskobu kullanılarak homojenizasyon tamlığı kontrol etmek için bir kısım Leke. </li><li> 4 10 dakika 20.000 g Santrifüj ° C çekirdek ve daha büyük hücre parçaları da içeren bir ham mitokondriyal pelet elde etmek için. Durusu ve süpernatantı atmak ve çöktürülmüş ham mitokondriyal pelet tartmak. Pelet -80 saklanabilir ° Bu bir durak noktası ise C sıvı azot anlık dondurma. NOT: Diferansiyel santrifüj veya diğer gradyan tabanlı işlemleri saf mitokondriyal membran fraksiyonu yalıtma ve toplamak için kullanılabilir. Bkz. Ürün. 4 Ayrıntılı bilgi için. Bu alternatif bir yaklaşım yerine hücre ağırlığı veya hücre sayısını mg başına karmaşık aktivite mitokondriyal protein mg başına mitokondriyal karmaşık aktivite verecektir. Mitokondriyal proteinlerin konsantrasyonu, bu karşılaştırma yapmak için arıtma sonra tespit edilmesi gerekecektir. Ayrıca bu yaklaşım, farklı bir izolasyon tampon için gerekli olabilir. Saf mitokondriyal membran fraksiyonu çözünürleştirme için, adım 6&#39;da aşağıdaki nota bakınız. </li><li> Buz üzerinde buz çözünürleştirme tamponu (50mm NaCl, 50mm imidazol / HCl pH 7,0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic asit) ile vorteks ham mitokondriyal pelet çözünür. 6-aminohexanoic asit 1x Proteaz İnhibitör Kokteyl ile değiştirilebilir. 35μl pelet ağırlığı 20 mg başına çözünürleştirme tampon kullanın. % 10 w / v digitonin pelet ağırlığı ve tüp hafifçe vurarak karıştırın 20mg başına 20μl ekleyin. Buz üzerinde 5-10 dakika inkübe. Dodesil-BD-maltoside veya triton X-100 proteinleri çözünür digitonin ikame edilebilir. Deterjan ve miktarı seçim supercomplexes veya mitokondriyal komplekslerinin multimer formları oluşumunu etkileyebilir. Daha fazla bilgi için, ref.1 bkz. NOT: saf mitokondriyal membran fraksiyonu çözünür için gerekli deterjan miktarı, 2-6g / g arasında değişen bir deterjan / protein ağırlık oranına karşılık Mitokondrial membranlar çözünür optimal oranı dodesil-BD-maltoside g / 2.5g için 3g / g triton X-100 ve 6g / digitonin g. </li><li> 15 dakika 4 ° C 100.000 g çözündüğünü pelet Santrifüj Net süpernatant toplayın. </li><li> Son% 5 w / v gliserol ve% 0.01 w / v Ponceau S (% 50 w / v gliserol,% 0.1 w / v Ponceau S yükleme tamponu stok solüsyonu kullanmak) tampon yükleme ekleyin. </li><li> 20-40mg şeritli başına ham mitokondriyal pelet içeren bir hacmi ile jel kuyu yükleyin. % 3.5 jel istifleme ile bir akrilamid gradyan jel (4 -13%) kullanın. NOT: Jel hazırlanması ve elektroforez koşulları: Bisacrylamide akrilamid ve 1.5g (% 49.5 T, T, AA ve bisAA ve C toplam konsantrasyonu% 3 C 48g: jel hazırlanması için, aşağıdaki gibi bir akrilamid / bis-akrilamid (AA / bisAA) 3 karışımı kullanın toplam monomer, çapraz bağlayıcı (bisAA) yüzde olarak). Jel tampon (3): 1.5M 6-aminohexanoic asit; 75mm imidazol, pH 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gradient jel: </td><td> % 4 </td><td> % 13 </td><td> Jel İstifleme: </td><td> % 3.5 </td></tr><tr><td> AA / bisAA 3 karışımı </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Jel tampon 3 &#39; </td><td> 8.3 ml </td><td> 8.3 ml </td><td></td><td> 2.7 ml </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4.7 ml </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 ul </td><td> 125 ul </td><td></td><td> 67 ul </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 ul </td><td> 12.5 ul </td><td></td><td> 6.7 ul </td></tr></tbody></table> Anot tampon: 25mm imidazol / HCl, pH 7.0 Katot tamponu: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl,% 0,02 w / v dodesil-BD-maltoside,% 0.05, pH 7.0 w / v deoksikolatın Dökün ve soğuk bir oda (4-7 ° C) jeller çalıştırmak. Kullanılan ilk gerilimi 100V. Örnek istifleme jel girdiğinde, voltaj 15mA (0.15 &#39;14&#39; 14 cm jeller), akım sınırlı 500V yükseltilir. Elektroforez keskin bir çizgi, kırmızı Ponceau S boya jel ön yaklaşımlar 3-4 saat sonra durdurulur. Alternatif olarak, bir jel 70-100V sabit gerilim ile gece çalıştırmak olabilir. <ol><li> Jel aktivite testleri. Protein çözünmüş verimlilik ve iyi ortalama yüklenen malzeme miktarı her bir deney için inkübasyon süresi bağlıdır. I, IV ve V kompleksler genellikle kompleksleri II ve III daha güçlü sinyaller verir. </li></ol> Kompleks I (CI) Birkaç saat oda sıcaklığında jel dilim CI tamponu (2.5mg/ml NBT; 0.1mg/ml NADH 5mM Tris-HCl, pH 7.4) ile inkübe edin. CI tamponu: 5mM Tris-HCl, pH 7.4 100ml başına ekleyin: 0.01g NADH 0.25g NBT 15-45 dakika için% 50 metanol ve% 10 asetik asit jel sabitleyin. Sabit% 10 asetik asit jel korunur. Kompleks II (CII) CII tampon (0.2mm phenazine methasulfate;; 5mM Tris-HCl pH: 7.4; 2.5mg/ml NBT süksinat 20mm sodyum) ile oda sıcaklığında birkaç saat için jel dilim inkübe edin. CII tamponu: 5mM Tris-HCl, pH 7.4 100ml başına ekleyin: 200μl 1M sodyum süksinat 80μl phenazine methasulfate (250mm PMS DMSO içinde çözünmüş) 0.25g NBT Fix gibi Kompleksi için jel Kompleks III (CIII) , Oda sıcaklığında birkaç saat için; CIII tamponu (0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB), 50mm sodyum fosfat, pH 7.2) ile jel dilim inkübe edin. CIII tampon: 50mm sodyum-fosfat, pH 7,2 100ml başına ekleyin: 50mg diaminobenzidin tetrahydrochloride Fix gibi Kompleksi için jel Kompleks IV (CIV) Birkaç saat süreyle oda sıcaklığında; CIV tampon (0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB), 50μM at kalp sitokrom c 50mm sodyum fosfat, pH 7.2) ile jel dilim inkübe edin. CIV tampon: 50mm sodyum-fosfat, pH 7,2 100ml başına ekleyin: 50mg diaminobenzidin tetrahydrochloride 0.1g at kalp sitokrom c Fix gibi Kompleksi için jel Karmaşık V (CV) Jel dilim CV tampon (35mm Tris-taban, 270mm glisin pH 8.3, 25 ° C, 14mm MgSO 4,% 0.2 w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) birkaç saat oda sıcaklığında inkübe CV tampon başına çözüm 100ml eklemek: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-baz </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glisin </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> PH (8.3 olmalıdır) ayarlamak gerek yok - asit veya baz kullanmayın. Filtre ve ekle <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> 30 dakika süreyle% 50 metanol Fix jel ve su aktarmak.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

Bu video, insan embriyonik kök hücreleri, yüksek çözünürlükte net yerli jel elektroforezi (hrCNE) ayrılması, ve jel katalitik etkinlik analizleri ile sonraki analiz mitokondriyal protein kompleksleri çıkarma tarif ettiler. hrCNE mavi yerel jel elektroforezi ile karşılaştırılabilir bir çözünürlükte mitokondrial membran protein kompleksleri giderir ve jel faaliyet deneyleri için üstündür. Bu teknik, mitokondriyal solunum kompleksleri IV ölçmek için değil, aynı zamanda hESC ve bunların türev döl hem de herhangi bir mitokondrial membran protein...

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>pH değeri NaOH ile 8.0'e ayarlanmalıdır</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Sodyum süksinat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0.1M Sodyum fosfat tamponu pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 ve BP329-1</td><td>25 °C'de pH 7.2 değerinde 0.1M sodyum fosfat tamponu hazırlamak için 68.4 ml 1M Na2HPO4 ve 31.6 ml 1M NaH2PO4 karıştırın</td></tr><tr><td>1M Trisin, pH 7.0 (NaOH ile ayarlanmış)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>4 °C'de saklayın</td></tr><tr><td>1M imidazol/HCl, pH 7.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>4 °C'de saklayın</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>%20 (ağırlık/hacim) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Suda çözünmüş. 1 ml'lik alikotları &amp;#8211;20 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td>%10 (ağırlık/hacim) digitonin (&amp;gt;%50 saflık, yeniden kristallendirme yapılmadan kullanılmış)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Suda çözünmüş. 0.1&amp;#8211;1 ml'lik alikotları &amp;#8211;20 °C'de saklayın. Kullanımdan önce 95 °C'ye ısıtılmalıdır.</td></tr><tr><td>2M 6-aminoheksanoik asit</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>4 °C'de saklayın</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/gliserol stok çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 ve G6279-1L</td><td>Suda %0.1 Ponceau S, %50 gliserol (ağırlık/hacim).</td></tr><tr><td>%10 a/h sodyum desoksikolat</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Suda çözünmüş. Işıktan korunmalıdır. pH değeri HCl ile 7.0'e ayarlanmalı, filtrelenmeli ve oda sıcaklığında saklanmalıdır.</td></tr><tr><td>250 mM fenazin metasülfat (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>DMSO içinde çözülmüş ve alikotlanmış. &amp;#8211;20 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Nitro-mavi tetrazolyum (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&amp;rsquo;-trifosfat disodyum tuzu (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Derece I, minimum %99</td></tr><tr><td>beta-nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) indirgenmiş form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>At kalbinden sitokrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>&amp;#8211;20 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypan mavi boyası %0.4</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Tripsin (%0.5)</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin İnhibitörü</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan embriyonik kök hücreleri mitokondrial kompleksi aktivite araştırmayı

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitokondri, sitoplazma, hücre metabolizması ve homeostasis birincil rolü var organelleri, hücre sinyal ağının düzenlenmesi, ve programlı hücre ölümü. Mitokondri üretmek ATP, sitoplazmik redoks devlet ve Ca2 + dengesini düzenleyen yağ asitleri catabolize, hem, nükleotidler, steroid hormonlar, amino asitler, sentez ve proteinlerin demir-kükürt kümeleri bir araya yardımcı. Mitokondri, aynı zamanda ısı üretimi önemli bir rolü var. Mitokondriyal genom mutasyonları insan bozukluğunun çeşitli neden olur. MtDNA mutasyonlarının birikmesi, yaşlanma ile ilişkilidir ve kanser gelişiminde önemli bir role sahip şüphelenilen. Tüm hücre tipleri hayati önemli rol nedeniyle, mitokondri fonksiyonu da kök hücreler için kritik öneme sahip olmalıdır. Kök hücre canlılığı, proliferasyon ve farklılaşma kapasitesi anlayışımızın önemli ilerlemeler yapılmıştır. Ancak kök hücrelerin fonksiyonel aktivite, özellikle enerji durumu, henüz detaylı bir şekilde incelenmemiştir değildi. Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve farklılaştırılmış habercisi döl mitokondriyal özellikleri hakkında neredeyse hiçbir şey bilinir. HESC işlev ve gelişim potansiyeli mitokondri rolünü anlamak ve değerlendirmek için tek yolu doğrudan mitokondriyal solunum kompleksleri aktivitesini ölçmek için. Burada, yüksek çözünürlüklü hESC beş solunum zinciri kompleksleri analiz etmek için bir yöntem olarak jel faaliyet görselleştirme net yerli jel elektroforezi ve sonraki açıklar.

Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitokondriler; hücresel metabolizma ve homeostazda, hücre sinyal ağının düzenlenmesinde ve ... temel rol oynayan sitoplazmik organellerdir.

Mitokondriler, metabolizma ve enerji üretiminden programlı hücre ölümüne ve steroid hormon sentezine kadar hücre fizyolojisinde çok sayıda role sahiptir. Mitokondrilerin hem temel hücresel fonksiyonlardaki hem de hastalıklardaki önemine rağmen, insan embriyonik kök hücrelerinde ve bunların farklılaşmış soyundan gelen hücrelerdeki fonksiyonları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu videoda, insan amry kök hücrelerinin mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin tekil aktivite analizleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini göstereceğiz.Merhaba, ben University of California Los Angeles, Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Michael Tetel laboratuvarından Ivan OV. Bugün sizlere insan embriyonik kök hücrelerinde mitokondriyal solunum kompleksi fonksiyonlarının değerlendirilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Bu jel içi aktivite değerlendirme prosedürü; insan embriyonik kök hücrelerinden kaba mitokondriyal pellet izolasyonunu, oksidatif fosforilasyon sisteminin mitokondriyal komplekslerinin yüksek çözünürlüklü berrak doğal poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılmasını ve ardından gelen jel içi aktivite analizini içermektedir.Hadi başlayalım. Bu prosedürdeki ilk adım, insan embriyonik kök hücrelerinden mitokondri izole etmektir. Bu analiz için, besleyici hücre içermeyen koşullarda matrijel kaplı bir plakta büyütülmüş insan embriyonik kök hücrelerini kullanacağız.İnsan amry kök hücrelerimizden mitokondri toplamak için, öncelikle hücreleri ılık 1X PBS pH 7.4 ile yıkayarak başlarız ve ardından hücreleri beş dakika boyunca tripsinizle işleme tabi tutarız. Altı kuyucuklu bir plakada her kuyucuk için 1 ml 1X tripsin kullanabilirsiniz. Beş dakika sonra, 1X PBS içinde 1 mg/ml konsantrasyonunda eşit hacimde taze tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurabilir ve hücreleri hasat edebilirsiniz.Toplanan hücreler daha sonra oda sıcaklığında, 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Döndürme işleminden sonra, süpernatant atılır ve çökelmiş hücreler, taze hazırlanmış 1x proteaz inhibitörü kokteyli içeren 0,8 ila 1,7 mililitre buz soğukluğunda mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden süspande edilir. Kullanılacak tampon miktarı, elde edilen hücre pelletinin boyutuna bağlıdır. Pellet yeniden süspande edildikten sonra, yaklaşık 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.İnkübasyonu takiben, hücreleri bir homojenizatör ile parçalıyoruz; bu işlem yaklaşık 40 ila 50 darbe sürebilir. Homojenizasyonun tamamlandığını, DOD hücrelerinden bir alikotu tripan mavisi ile boyayıp ışık mikroskobunda inceleyerek kontrol edebiliriz. Görüntü şuna benzer olmalıdır.Bu, downs ile 50 darbeden sonraki ilk çekimdir. Bu, downs ile 80 darbeden sonraki ikinci çekimdir. Hücreler homojenize edildikten sonra, onları 4 °C'de 10 dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüjleyin. Bu işlem, çekirdekleri ve daha büyük hücre fragmanlarını da içeren kaba bir mitokondriyal pelet sağlayacaktır.Pellet toplanmadan önce, sonraki pellet ağırlığını tahmin edebilmek için toplama tüpünü tartmalı, süpernatantı döküp atmalı ve ardından çökelmiş ham mitokondriyal pelleti tartmalıyız. Bu aşamada tüpün ağırlığını çıkararak, bir sonraki adımda gösterilecek olan pelleti çözücüde çözme işlemine geçilebilir. Ham mitokondriyal pelleti çözmek için, pellet buz üzerinde tutularak 35 µL buz gibi soğuk çözündürme tamponu ile vorteksleyerek işleme başlarız.Detaylı bilgisine sahip olduğumuz her 20 miligram pelet için tampon bileşimleri beraberindeki yazılı protokolde belirtilmiştir. Vorteksleme ve solubilizasyon tamponu eklemesinin ardından, digitonin eklemeden önce, resüspande edilen peleti yüksek hızlı santrifüj için uygun bir tüpe aktarıyoruz ve ardından 20 miligram pelet ağırlığı için 20 mikrolitre %10 ağırlık/hacim digitonin ekleyip tüpü hafifçe sallayarak karıştırıyoruz; iyice karıştırıldıktan sonra mitokondriyal peleti buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe ediyoruz. Proteinleri solubilize etmek için digitonin yerine dodecyl beta-D-maltoside (DDM) veya Triton X 100 kullanılabilir.Deterjan seçimi ve miktarı, buz üzerinde inkübasyon sonrası mitokondriyal komplekslerin supra kompleks veya multimerik formlarının oluşumunu etkileyebilir. Pelet solubilize edildikten sonra, örneği 4 °C'de 15 dakika boyunca 100.000 ×g hızda santrifüj edeceğiz ve ardından berrak süpernatantı toplayacağız. Artık süpernatantı, mitokondrilerin doğal gradyan jel elektroforezi için gradyan jelde yürütmeye hazırlayabiliriz. %5 ile %13 arasında akrilamid gradyan jel ve %3,5'lik bir istifleme (stacking) jeli kullanılmasını öneririz. Jeli hazırlamak için, yazılı protokolde belirtilen akrilamid bis-akrilamid karışımını kullanacağız. Akrilamid bis-akrilamid çözeltisi önceden hazırlanır ve karanlık bir yerde, 4 °C'de saklanır.Akrilamid ve bis akrilamid hem toz hem de sıvı formda toksik kimyasallardır, bu nedenle bunlarla çalışırken özel dikkat gösterilmelidir. Akrilamid bis akrilamid çözeltisini, 1.5 molar 6-aminoheksanoik asit ve pH 7.0'da 75 millimolar OLET içeren üç katı jel tamponu bir alikotu ile birleştiriyoruz. Tampona eklediğimiz akrilamid bis akrilamid çözeltisinin miktarı, gradyan jel oluşturmak için hazırladığımız jelin yüzde değerine bağlı olacaktır.Bir adet %4'lük karışım ve bir adet %13'lük karışım hazırlayacağız, istifleme jeli ise %3,5'lik karışım olacaktır. %13'lük karışıma gliserol eklemeyi unutmayın. Üç karışım da hazır olduğunda, karışımlara uygun miktarda amonyum persülfat ve temed ekleyip karışımları gradyan oluşturucu döküm odasına döküyoruz.Hücrenin sol kısmı %5'lik karışımı içerir. Hücrenin sağ kısmı, küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ile birlikte %13'lük karışımı içerir. Hücrenin sağ kısmını açarak jeli dökmeye başlarız.Ardından hemen hücrenin sol kısmını açarız ve gradyanı oluşturmak için %5'lik çözeltinin %13'lük çözelti ile karışmasını sağlarız. Polimerizasyondan sonra jel için düzgün ve keskin bir sınır oluşturmak amacıyla jelin üst kısmına az miktarda izopropanol ekleriz. Yaklaşık bir saat sonra, gradyan jelin polimerizasyonu tamamlandığında, izopropanolü uzaklaştırırız ve 3,5 yığınlama jelini cihaza döküp bir jel tarağı yerleştiririz.Jelleri yaklaşık dört ila yedi santigrat derece sıcaklıktaki bir soğuk odada hazırlayıp çalıştıracağız. Bu jeli çalıştırmak için iki farklı tampon kullanacağız. Anot odasında, 25 milimolar ole hidroklorik asit pH 7.0 içeren bir tampon kullanacağız.Katot tamponu 50 milimolar tric, 7,5 milimolar hidroklorik asit, ağırlık/hacimce %0,02 doil beta D multiside veya DDM ve ağırlık/hacimce %0,05 dokozolat pH 7,0 içerecektir. Az önce döktüğümüz jelde yürütülecek olan süpernatantı hazırlamak için, ağırlık/hacimce %5 gliserol ve ağırlık/hacimce %0,01 Ponto S nihai konsantrasyonu sağlayacak şekilde yükleme tamponu eklenir; genellikle gliserol ve poncho s içeren 10x'lik bir stok çözelti süpernatantlara doğrudan eklenir.Şimdi jel örneğini jele yüklemeye hazırız. Jel kuyucuklarını, her şerit için 20 ila 40 miligram ham mitokondriyal protein içeren bir hacimle dolduracağız. Yükleme işleminin hemen ardından jel 100 volt üzerinden yürütülür.Numune istifleme jeline girdikten sonra, voltaj 15 miliamper akım sınırı ile 500 volta yükseltilebilir. Genellikle jeli gece boyunca 70 ile 100 volt arasında çalıştırsak da, kırmızı zos boyasının keskin bir hattı jel ön yüzüne yaklaştığında elektroforezi durdururuz. Jel çalıştırıldıktan sonra, farklı protein komplekslerinin aktivitesini doğrudan jel üzerinde analiz edebiliriz.Her bir analiz için inkübasyon süresi, protein çözünürleştirme verimliliğine ve kuyu başına yüklenen materyal miktarına bağlıdır. Birinci, dördüncü ve beşinci kompleksler genellikle ikinci ve üçüncü komplekslerden daha güçlü sinyaller verir. Bu nedenle, ikinci ve üçüncü kompleksler için boyama süresi daha uzun tutulmalıdır.Kompleks aktivitesini test etmek için, her kompleks için spesifik tamponlar kullanmamız gerekecektir. Münferit tamponların içeriklerini yazılı protokolde bulabilirsiniz. Şimdi, Ingel aktivite analizlerini ayrı ayrı gerçekleştirmek için jelden münferit şeritleri keseceğiz.Beşinci kompleks hariç tüm kompleksler için, jel dilimini ilgili tampon çözeltilerde oda sıcaklığında birkaç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, jeli %50 methanol ve %10 acetic acid içerisinde 15 ila 45 dakika boyunca sabitleyin. Sabitlenen jel, %10 acetic acid içerisinde saklanır.Burada kompleks 1 boyamasının nasıl göründüğünü görebilirsiniz. Jel diliminde kompleks 1'e karşılık gelen tek bir koyu mor bant bulunmaktadır. Şeffaf jeller, mitokondriyal kompleks aktivitelerinden densitometre yapmanıza ve karşılaştırmalı analizler gerçekleştirmenize olanak tanır.Yoğun sitometri sonrası, uzun süreli saklama ve/veya yüksek kaliteli bir görüntü kompleksi elde etmek için tarama amacıyla jel dilimlerini genellikle kuruturuz; iki boyama, kompleks iki ile aynı mor renge sahipken kompleks üç ve kompleks dört turuncu veya sarımsı bir boyama bandı verir. Burada kompleks iki, üç ve dört boyama aktivitelerine örnekler yer almaktadır.İnsan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen ve doğal jel elektroforezi dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü yöntemlerle ayrıştırılan mitokondriyal eksudatif aktivite komplekslerinin aktivitesinin nasıl analiz edileceğini size göstermiş olduk. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir...

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Daha önce dondurulmuş arşivlenmiş katı dokulardan mitokondri ile zenginleştirilmiş örneklerin hazırlanması, araştırmacıların çeşitli deneysel yöntemlerde mitokondrilerin hem fonksiyonel hem de analitik değerlendirmelerini yapmalarına izin verdi. Bu çalışma, donmuş kalp dokusundan mitokondri ile zenginleştirilmiş preparatların nasıl hazırlanacağını ve mitokondrilerin analitik değerlendirmelerinin nasıl yapıldığını göstermektedir.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde mitokondrial solunum zinciri komplekslerinin in-gel aktivite analizi yöntemini. Bu teknik, hücre fizyolojisi ve kök hücre biyolojisindeki mitokondrial fonksiyonları anlamak için araştırmacılara değerli bilgiler sunar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Daha fazla video keşfet