Name: Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Öğrenin fare embriyonik fibroblastlarından lentiviral sistemle iPS hücreleri üretme yöntemini. Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 transkripsiyon faktörleriyle hücre yeniden programlama tekniğini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Adım 1: 293 lentivirüs üretim hücreleri ve plaka çözülme. <ol><li> 9 ml, 15 ml tüp DMEM + orta hazırlayın. </li><li> Dondurulmuş 293 hisse senetlerinin bir şişe sıvı nitrojen tankı çıkarın ve (hepsi değil) en hücreleri çözülmüş kadar 37 ° C su banyosunda flakon koymak. </li><li> 1. adımı 15ml tüp içine hücreleri dondurma şişe ve yerden çıkarın. </li><li> 180g az 5 dakika süreyle santrifüj, ve sonra süpernatantı atın. </li><li> DMEM + orta 10 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve jelatin kaplı 100 mm çanak transfer. Hücrelerin% 80-90 konfluent kadar 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör inkübe edin. </li><li> Geçiş: 293 hücreler PBS ile yıkama hücreleri, PBS aspirat ve 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA 10 cm çanak başına 4 ml ve 37 az 1 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> 10 ml DMEM + orta tekrar süspansiyon dokunarak yemeklerinden hücreleri, ve 15 ml tüp transfer ayırın. 180g az 5 dakika süreyle santrifüj, süpernatantı aspirat. </li><li> DMEM + orta uygun hacmi ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme hücreleri tek bir hücre süspansiyonu break up. </li><li> Hücrelerin sayısını ve FP orta ml başına 8x10 5 hücre konsantrasyonu ayarlayabilirsiniz. </li><li> Tohum hücreleri 100 mm kültür çanak başına 8x10 6 hücreli (10 ml), 37 o gece inkübe ° C,% 5 CO 2. </li></ol> Adım 2: Lentivirüs plazmid ve hasat virüsü ile Transfect 293 hücreleri <ol><li> Her 10 cm plaka için, FUW-Teto-cDNA 10 mikrogram (Oct4, Sox2, Klf4 veya c-Myc) PMD-G 2.5ug ile lentivirüs omurga ve pPax2 7.5 mikrogram kullanın. </li><li> Bir tüp içine üç plazmid aliquoting ederken, DMEM, serum olmadan 500μl içeren ikinci bir tüp içine Fugene 6 transfeksiyon reaktif 30μl teslim ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca parmak-vurma ve inkübe tarafından hafifçe karıştırın. </li><li> DNA karışımı Fugene 6/DMEM-containing tüpe damla bırak, parmak vurma ve 20 dakika inkübe hafifçe karıştırın. </li><li> 293 Kullanıcı çanak içine DNA / Fugene 6 karmaşık damla damla ekleyin ve 37 ° gece inkübe ° C,% 5 CO 2. </li><li> Ertesi sabah: transfeksiyon aspire reaktif içeren orta, 5 ml taze ES hücre orta ekleyin ve hücrelerin inkübatör dönün. </li><li> 48 saat ve 72 saat sonra transfeksiyon, 0.45 mikron gözenek boyutu selüloz asetat filtre üzerinden filtreleme, ve 15 ml tüp aktarılması, 10 ml steril tek kullanımlık şırınga kullanarak 293 orta toplamak. </li><li> Ultrasantrifügasyon tarafından virüs süpernatant Konsantre. Istenilen hacmi virüs pelletini tekrar Oct-3/4-, Sox2, Klf4-c-Myc-lentiviruses içeren orta eşit parçaya amixture. </li><li> Virüs yaparken, (2x10 6 hücre çanak ortalama) 10 cm yemekleri% 90 confluency Oct4-neo/rtTA veya Oct4-GFP/rtTA MEFS (geçit &lt;3) hazırlamak </li><li> Kültür ortamı ve 10 ml PBS ile yıkama aspire. </li><li> 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA çanak başına 1 ml ekleyin ve 37 inkübe ° C 10 dakika, PBS atın. </li><li> 9 ml kültür ortamı, hücreler tek bir hücre için askıya alma, ve 15 ml&#39;lik bir tüp transfer. </li><li> Hücrelerin sayısını ve 8x10 ml başına 4 hücreli konsantrasyonunu ayarlamak. Jelatin ile kaplı 10 cm çanak 10 ml (8x10 5 hücre) hücre süspansiyonu aktarın. 37 geceleme çanak inkübe ° C,% 5 CO 2. </li><li> Fibroblast çanak orta aspire ve virüs içeren orta 10 ml ekleyin. 37 gecede 4 saat hücreleri ° C,% 5 CO 2 inkübe edin. </li><li> 24 sonra bir fibroblast çanak orta aspirat ve 10 ml taze ES hücre orta ekleyin. </li><li> Dört genlerin ifade başlatmak için orta içeren Doksisiklin düzenli ES hücre orta yerine, diğer bir deyişle, yeniden programlama başlatmak. </li><li> Oct4-neo muhabiri kullanıyorsanız, daha sonra 6 ve 9 gün arasında zaman ilaç bölümünü başlatın. </li><li> Koloniler aldı yeterince büyük olana kadar her gün orta değiştirin. Kolonileri ilk reprogramming başladıktan sonra yaklaşık bir hafta görünür hale gelir. Bunlar, yaklaşık 20 gün kadar alınır kadar büyük haline gelmelidir. </li></ol> Adım 3: IPS koloniler toplayıp Toplama önce Gün: <ol><li> Γ-ışınlanmış DR4 MEFS ile gerekli sayıda jelatin kaplı 24 kuyucuğu Tohum </li></ol> Gün 1 Klonlar Toplama: <ol><li> 1-2 saat almadan önce plakalar üzerinde koloniler besleyin. </li><li> Bir V-96-iyi dipli çanak kuyulardan 15 ul PBS ekleyin. </li><li> Kolonileri PBS ile bir kez alınır içeren çanak yıkayın ve çanak PBS 10ml eklemek. </li><li> Koloniler küçük 5μl pipetlemeyin ipuçları (4 ul P20 Pipetman ayarlamak) ile seçin. Transferi co96-iyi yemek, iyi bir lonies. </li><li> Tripsin 20 ul ve multi-kanal (12) pipetor kullanarak her ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı 3 kez. 37 ° C&#39;de 4 dakika. </li><li> 100 ES orta ul tripsinize koloniler ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı 10 kez. 12 yerde pipetor diğer her konumda bir ipucu kullanarak 24-iyi bir yemek için 96-iyi çanak bir defada 6 klonları aktarın. </li><li> 24 plaka hücreler hücrelerin ES hücre orta ile günlük beslenme,% 80-90 confluency ulaşıncaya kadar 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör büyütün. Hücreler muhtemelen 3-7 gün içinde genişletmek için hazır olacak. </li></ol> Adım 4 <ol><li> IPS hücreleri genişletilmesi <ol><li> Orta aspire, hücreler ve 1 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Tamamen PBS çıkarın, 0.1 ml% 0.25 tripsin / 37 az 1 mM EDTA ve inkübe ° C 10 dakika ekleyin. </li><li> ES orta 0.4 ml ekleyin ve tek hücre süspansiyonu için yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tarafından askıya. </li><li> 6-plaka iyi bir hücre süspansiyonu Transfer, 1.5 ml ES hücre orta ekleyin ve 37 inkübe ° C,% 5 CO2 inkübatör hücrelerin 6-kuyucuğu% 80-90 confluency ulaşana kadar. Bu noktada, aşağıdaki gibi hücreler dondurulmuş stok hazırlamak. </li></ol></li><li> Dondurma stok hazırlanması <ol><li> Orta aspire hücreleri ve 2 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Tamamen PBS çıkarın, 0.5 ml% 0.25 tripsin / 37 az 1 mM EDTA ve inkübe ° C 10 dakika ekleyin. </li><li> ES orta 2 ml ekleyin ve tek hücre süspansiyonu için yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tarafından askıya. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp hücre süspansiyonu Transfer, hücrelerin sayısını ve hücrelerin aşağı döndürün. </li><li> Süpernatantı atın ml başına 2x10 6 hücre konsantrasyonu ES orta hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 2 ES hücre dondurma orta (ES orta% 20 DMSO) ve flakon başına 0.5 ml kısım hazırlayın. </li><li> Şişeleri dondurma ve hafifçe karıştırın 0.5 ml hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Bir hücre dondurma kabı koyun ve şişeleri ° C gecede -80 tutmak, uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı azot transfer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

Bu video, Oct4-GFP/R26-M2rtTA ve Nanog-GFP/R26-M2rtTA fareler elde edilen MEFS GFP pozitif, pluripotent iPS hücreleri oluşturmak için bir indüklenebilir lentiviral sisteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu prosedür, yeniden programlama işlemi sırasında transgen ekspresyonu kontrolü sağlar çünkü iPS hücreleri üretmek için yararlı bir yöntemdir. IPS hücreleri nesil virüslerin kullanımı bir klinik ortamda bu hücrelerin kullanımını engellemektedir rağmen, bu prosedür henüz tanımlanan yeniden programlama sürecine altını önemli biyolojik sorulardan bazılarını yanıtlamak için etkinleştirin.

<table><tbody><tr><td>Doksisiklin hiklat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

sox-2 zorla İfade yoluyla mefs ips hücreler oluşturma, eki 4, c-myc ve klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency farklılaştırılmış murin Oct4 viral transdüksiyon tarafından indüklenen olabilir, Sox2, Klf4, ve c-Myc (Takahashi ve Yamanaka, 2006; Wernig ve ark, 2007; Okita, vd, 2007;. Maherali, et al, 2007). Biz bu dört transkripsiyon faktörleri doksisiklin ifade edildiği bir yeniden programlama strateji geliştirdiler (dox) lentiviral vektörler (Brambrink ve ark, 2008) indüklenebilir. Bu indüklenebilir yapıları kullanarak, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) alınan uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri elde edebilirsiniz. Bu videoda, biz dört transkripsiyon faktörleri ifade ve iPS hücreleri üretmek için bu virüsleri ile enfekte MEFS nasıl göstereceğim indüklenebilir lentiviruses nesil için prosedürü göstermektedir. Indüklenebilir lentiviruses kullanarak, kültür ortamı Doxycyline ek tarafından kontrol dört faktör ifade. Bu sistemin avantajı, geleneksel retroviral enfeksiyon üzerinde, programlama ve gen ekspresyonu gereksinimleri kinetiği ayrıntılı olarak analiz edilebilir kapalı genler açmak ve kapatmak için yeteneğidir.

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Pluripotens, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc'ın viral transdüksiyonu yoluyla farklılaşmış fare hücrelerinde indüklenebilir (Takahashi ve Yamanaka, 2006; Wernig ve ark., ...

50 yılı aşkın bir süre önce, deri fibroblastları gibi terminal olarak diferansiye olmuş hücrelerin, embriyonik kök hücrelere benzer pluripotent bir duruma zorlanabileceği hipotezi ortaya atılmıştır. Bu kavramın temeli, birkaç küçük istisna dışında tüm hücre tiplerinin aynı genetik koda sahip olduğu ve hücre tipleri arasındaki tek farkın kodun nasıl okunduğu olduğu gözlemiydi. Diferansiye bir hücrenin hücresel kimliğini pluripotent bir duruma dönüştürme yeteneğine hücresel yeniden programlama denir.Yarım on yıllık araştırmaların ardından, dört transkripsiyon faktörünün zorlanmış ekspresyonunun, deri fibroblastlarını pluripotent hale gelecek şekilde yeniden programlayabildiği yakın zamanda gösterilmiştir. Bu bulgunun etkisi çok büyüktür. Temel biyoloji açısından taşıdığı önemin ötesinde, bu yöntem aynı zamanda insan embriyonik kök hücrelerinin transplantasyon tedavisinde kullanımına yönelik temel etik itirazları da ortadan kaldırmaktadır.Yeniden programlamanın gerçekleşebilmesi için, transkripsiyon faktörleri OC four, sox two, cmic ve K four'ü kodlayan dört genin paketlenip bir lentivirüs doku kültürü ortamına yerleştirilmesi gerekir. Saflaştırılmış virüs içeren bu ortam daha sonra yüksek yoğunlukta fibroblast içeren bir hücre kültürü tabağına eklenir ve bu tabak içerisinde olağanüstü bir olay meydana gelir. Fibroblastların küçük bir kısmı, transkripsiyon faktörü taşıyan dört virüsün tamamıyla enfekte olur ve dediferansiyasyon sürecine girer.Morfolojilerinde ve proliferasyonlarında köklü değişiklikler geçirirler ve pluripotent kök hücrelerden oluşan büyük kümelere bölünmeye başlarlar. Embriyonik kök hücre koşullarında iki ila üç haftalık kültürden sonra, yeniden programlanmış fibroblast kolonileri manuel olarak izole edilebilir ve in vitro ortamda genişletilebilir. Saflaştırıldıktan sonra bu hücreler, belirli bir yüzde hücresinin dediferansiye olmuş bu fibroblastlardan türediği ve farenin farklı dokularına katkıda bulunabildiği kimerik fareler oluşturmak için kullanılabilir.Orijinal fibroblastların genetik materyalinin germ hattına katkıda bulunduğu kimeralarda, genetik kod bir sonraki nesle ve ardından sonraki nesillere aktarılır. Viral iletim sistemlerinin kullanımı şu an için klinik uygulamalar önünde bir engel teşkil etse de, bunun kısa süre içinde aşılacağı muhtemeldir. Bu videoda, Yin laboratuvarı üyeleri, fare embriyonik fibroblastlarından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin nasıl elde edildiğini gösterecekler.Merhaba, ben Massachusetts, Cambridge'deki Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde bulunan Rudolph Jish laboratuvarından Grant Welted. Ben de Jish laboratuvarından Tobias Bro brink. Bugün size, bu dört cDNA'yı Tet OCMV promotöründen eksprese eden lentivirüsler kullanarak OCT four, SOX two, CIC ve KF four'ün aktarımıyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretilmesini göstereceğiz.Bu, fare embriyonik fibroblastlarının enfeksiyonundan sonra bu dört transgenin ekspresyonunun hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır. Bugün size göstereceğimiz protokol, insan hücrelerini enfekte etme potansiyeli olan lentivirüslerinle çalışmayı içerir. Bu işlemi kendi başınıza denemeden önce her zaman güvenli prosedürleri takip etmeniz ve güvenlik ofisinizle iletişime geçmeniz kritik önem taşır.Şimdi, mezenkimsel hücreleri iPS hücrelerine dönüştürecek lentivirüsler üretmek amacıyla bazı iPS hücreleri oluşturalım. 293 hücreleri, üç plazmit ile transfekte edilmelidir: viral paketleme için gerekli genetik elementleri sağlayan Paks iki; dört CD aid'den biri olan T dört SOX iki, KLA dört veya CMIC olan FUW TE OCMV lentivirüs viral omurgası ve veziküler stomatit virüsünün (VSV) zar glikoproteinini eksprese eden PMDG.Bu işlem, atropik virüs üretecek virüsü oluşturur. Bu nedenle, uygun BSL-2+ prosedürlerinin takip edilmesi gerekir. Bu videoda gerçekte enfeksiyöz virüsle çalışmadığımız için tipik önlüklerimizi giymiyoruz ve BSL-2+ tesisimizde bulunmuyoruz.Transfeksiyondan önce, 2, 9 3 hücreleri sıvı azottan çözülür ve %90 konfluens düzeyine kadar büyütülür; ardından hücrelere FU geni transfekte edilir ve virüsün eksprese edilmesi için 48 ila 72 saat süre verilir. Bu sürenin sonunda, hücrelerin bulunduğu besiyeri 0,45 mikronluk bir filtre ile süzülür ve ultrasantrifügasyon kullanılarak konsantre edilir. Virüs konsantre edildikten sonra, iPS kümeleri oluşturmak amacıyla MEF'leri enfekte etmeye hazırız. Viral hazırlık aşamaları sırasında, üçten az pasaj yapmış fare embriyonik fibroblastları, 10 santimetrelik kaplarda, kap başına yaklaşık 2 x 10⁶ hücre olacak şekilde %90 konfluens düzeyine kadar büyütülür. Bu özel deneysel protokolde, doksisiklin ekspresyonu için kritik olan RTTA'yı ve endojen OC four lokusundan GFP'yi eksprese eden MEF'ler kullanıyoruz.MES'ler GFP negatiftir, ancak gerçek iPS hücreleri GFP pozitif hale gelir. Bu marka, yeniden programlanmış hücrelerin tanımlanmasını sağlayan bir yöntem sunar. Fibroblastlardaki kültür ortamını aspire edin ve 10 ml PBS-EDTA ile yıkayın, PBS-EDTA'yı boşaltın ve 5 ml 1x tripsin ekleyip 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin, hücrelerin kapların tabanından ayrılmasına yardımcı olacaktır.Şimdi, hücreleri tek hücre süspansiyonu şeklinde yeniden süspande etmek için dokuz ml kültür ortamı ekleyin ve bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Bu hücreler daha sonra santrifüj edilerek peletlenir. Pelet yeniden süspande edildikten sonra, süspansiyondaki hücre sayısı sayılır ve konsantrasyon ml başına 8 × 10⁴ hücreye ayarlanır.Ardından, hücre süspansiyonundan 10 ml jelatin ile kaplanmış 10 santimetrelik bir kaba aktarılır. Kabı gece boyunca 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin. Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, fibroblast kabındaki besiyeri aspire edilir ve kaba virüs içeren 10 ml besiyeri eklenir. Hücreleri dört saatten gece boyunca sürecek şekilde 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin.Ertesi gün, fibroblast kabındaki besiyerini aspire edin ve ardından 10 mL taze ESL besiyeri ekleyin. Bu aşamada hücreler dondurulabilir, genişletilebilir veya yeniden programlamanın başlatılması için hazırlanabilir. Yeniden programlamayı başlatmak için, dört genin ekspresyonunu başlatmak amacıyla standart ESL besiyerini doksisiklin içeren besiyeri ile değiştirin.Bu hücreleri inkübatöre yerleştirin ve koloniler toplanabilecek kadar büyüyecek seviyeye gelene kadar besiyerini her gün değiştirin. Koloniler, yeniden programlamanın başlatılmasından yaklaşık bir hafta sonra görünür hale gelmelidir. Yaklaşık 20. gün civarında toplanabilecek kadar büyümüş olmaları gerekir.20 gün geçtiğine göre, kolonileri seçmeden önce iPS kolonilerini seçme işlemine geçebiliriz. Seçimden bir ila iki saat önce, gama ışınlanmış DR-four myths içeren gerekli sayıda jelatin kaplı 24 kuyucuklu plakların hazır bulunduğundan emin olunmalıdır. Seçimden hemen önce, plakalardaki kolonilere taze besiyeri eklenerek besleme yapılmalıdır; seçme işleminden hemen önce V tabanlı 96 kuyucuklu bir tabağın kuyucuklarına 50 µL HEPA tamponu ekleyin, seçilecek kolonileri içeren tabağı bir kez PBS ile yıkayın ve tabağa 10 mL PBS ekleyin. iPS hücre kümeleri, stereo veya ters mikroskop altında seçilebilir.Kümelenmeleri gidermek için kolonileri küçük bir pipet ucuyla seçin ve PBS içeren 96 kuyucuklu plağın bir kuyucuğuna aktarın. Kümelenmeleri parçalamak için pipet ucuyla kümenin etrafına bir daire çizilir. Artık çok kanallı pipet kullanılarak yeniden programlanmış hücreler çıkarılabilir; her birine 20 µL tripsin eklenir.Üç kez pipetle yukarı aşağı karıştırın ve 37 °C'de dört dakika inkübe edin. Dört dakikalık inkübasyonun ardından, tripps nice kolonilerine 100 µL ES medium ekleyin. 10 kez pipetle yukarı aşağı karıştırın ve her seferinde altı klonu transfer edin.Hücreler, 12 kanallı pipetleyicinin her iki konumunda bir uç kullanarak 96 kuyucuklu kaptan 24 kuyucuklu kaba aktarılır ve ardından 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatörde, hücreler %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar 24 kuyucuklu plakada büyütülür. Hücreler, ES hücre ortamı ile beslenerek muhtemelen üç ila yedi gün sonra ekspansiyona hazır hale gelecektir. Birkaç gün sonra, iPS hücreleri konfluense ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen uzaklaştırın, 100 µL 1X tripsin ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin ile inkübasyonu takiben, 400 µL ESL ortamı ekleyin ve pipetle aşağı-yukarı çekerek hücreleri süspanse edip tek hücre süspansiyonu oluşturun.24 kuyucuklu plakadan alınan 500 µL tek hücre süspansiyonu, ardından altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarılır ve hücreler altı kuyucuklu plakada %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde inkübe edilir. Bu noktada, hücreleri southern analizi, blastlar, enjeksiyonlar, teratoma deneyleri veya in vitro diferansiyasyon deneyleri için çoğaltma aşamasına geçebilirsiniz. Bu değerli iPS hücresi stoklarını kaybetmemek için bu hücrelerin stok tüplerini dondurmayı unutmamalısınız.İndüklenebilir bir antiviral sistem kullanarak fare embriyonik fibroblastlarında pluripotensinin nasıl indüklendiğini size göstermiş olduk. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, polisistronik bir yapıda Gata4, Tbx5 ve Mef2c'nin retrovirüs aracılı dağıtımını kullanarak iCM'lerin üretilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, geliştirilmiş verimlilik ve kaliteye sahip nispeten homojen bir yeniden programlanmış hücre popülasyonu sağlar ve gelecekteki iCM yeniden programlama çalışmaları için değerlidir.

Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Öğrenin fare embriyonik fibroblastlarından lentiviral sistemle iPS hücreleri üretme yöntemini. Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 transkripsiyon faktörleriyle hücre yeniden programlama tekniğini keşfedin.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Daha fazla video keşfet