Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

50 yılı aşkın bir süre önce, deri fibroblastları gibi terminal olarak diferansiye olmuş hücrelerin, embriyonik kök hücrelere benzer pluripotent bir duruma zorlanabileceği hipotezi ortaya atılmıştır. Bu kavramın temeli, birkaç küçük istisna dışında tüm hücre tiplerinin aynı genetik koda sahip olduğu ve hücre tipleri arasındaki tek farkın kodun nasıl okunduğu olduğu gözlemiydi. Diferansiye bir hücrenin hücresel kimliğini pluripotent bir duruma dönüştürme yeteneğine hücresel yeniden programlama denir.

Yarım on yıllık araştırmaların ardından, dört transkripsiyon faktörünün zorlanmış ekspresyonunun, deri fibroblastlarını pluripotent hale gelecek şekilde yeniden programlayabildiği yakın zamanda gösterilmiştir. Bu bulgunun etkisi çok büyüktür. Temel biyoloji açısından taşıdığı önemin ötesinde, bu yöntem aynı zamanda insan embriyonik kök hücrelerinin transplantasyon tedavisinde kullanımına yönelik temel etik itirazları da ortadan kaldırmaktadır.

Yeniden programlamanın gerçekleşebilmesi için, transkripsiyon faktörleri OC four, sox two, cmic ve K four'ü kodlayan dört genin paketlenip bir lentivirüs doku kültürü ortamına yerleştirilmesi gerekir. Saflaştırılmış virüs içeren bu ortam daha sonra yüksek yoğunlukta fibroblast içeren bir hücre kültürü tabağına eklenir ve bu tabak içerisinde olağanüstü bir olay meydana gelir. Fibroblastların küçük bir kısmı, transkripsiyon faktörü taşıyan dört virüsün tamamıyla enfekte olur ve dediferansiyasyon sürecine girer.

Morfolojilerinde ve proliferasyonlarında köklü değişiklikler geçirirler ve pluripotent kök hücrelerden oluşan büyük kümelere bölünmeye başlarlar. Embriyonik kök hücre koşullarında iki ila üç haftalık kültürden sonra, yeniden programlanmış fibroblast kolonileri manuel olarak izole edilebilir ve in vitro ortamda genişletilebilir. Saflaştırıldıktan sonra bu hücreler, belirli bir yüzde hücresinin dediferansiye olmuş bu fibroblastlardan türediği ve farenin farklı dokularına katkıda bulunabildiği kimerik fareler oluşturmak için kullanılabilir.

Orijinal fibroblastların genetik materyalinin germ hattına katkıda bulunduğu kimeralarda, genetik kod bir sonraki nesle ve ardından sonraki nesillere aktarılır. Viral iletim sistemlerinin kullanımı şu an için klinik uygulamalar önünde bir engel teşkil etse de, bunun kısa süre içinde aşılacağı muhtemeldir. Bu videoda, Yin laboratuvarı üyeleri, fare embriyonik fibroblastlarından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin nasıl elde edildiğini gösterecekler.

Merhaba, ben Massachusetts, Cambridge'deki Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde bulunan Rudolph Jish laboratuvarından Grant Welted. Ben de Jish laboratuvarından Tobias Bro brink. Bugün size, bu dört cDNA'yı Tet OCMV promotöründen eksprese eden lentivirüsler kullanarak OCT four, SOX two, CIC ve KF four'ün aktarımıyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretilmesini göstereceğiz.

Bu, fare embriyonik fibroblastlarının enfeksiyonundan sonra bu dört transgenin ekspresyonunun hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır. Bugün size göstereceğimiz protokol, insan hücrelerini enfekte etme potansiyeli olan lentivirüslerinle çalışmayı içerir. Bu işlemi kendi başınıza denemeden önce her zaman güvenli prosedürleri takip etmeniz ve güvenlik ofisinizle iletişime geçmeniz kritik önem taşır.

Şimdi, mezenkimsel hücreleri iPS hücrelerine dönüştürecek lentivirüsler üretmek amacıyla bazı iPS hücreleri oluşturalım. 293 hücreleri, üç plazmit ile transfekte edilmelidir: viral paketleme için gerekli genetik elementleri sağlayan Paks iki; dört CD aid'den biri olan T dört SOX iki, KLA dört veya CMIC olan FUW TE OCMV lentivirüs viral omurgası ve veziküler stomatit virüsünün (VSV) zar glikoproteinini eksprese eden PMDG.

Bu işlem, atropik virüs üretecek virüsü oluşturur. Bu nedenle, uygun BSL-2+ prosedürlerinin takip edilmesi gerekir. Bu videoda gerçekte enfeksiyöz virüsle çalışmadığımız için tipik önlüklerimizi giymiyoruz ve BSL-2+ tesisimizde bulunmuyoruz.

Transfeksiyondan önce, 2, 9 3 hücreleri sıvı azottan çözülür ve %90 konfluens düzeyine kadar büyütülür; ardından hücrelere FU geni transfekte edilir ve virüsün eksprese edilmesi için 48 ila 72 saat süre verilir. Bu sürenin sonunda, hücrelerin bulunduğu besiyeri 0,45 mikronluk bir filtre ile süzülür ve ultrasantrifügasyon kullanılarak konsantre edilir. Virüs konsantre edildikten sonra, iPS kümeleri oluşturmak amacıyla MEF'leri enfekte etmeye hazırız. Viral hazırlık aşamaları sırasında, üçten az pasaj yapmış fare embriyonik fibroblastları, 10 santimetrelik kaplarda, kap başına yaklaşık 2 x 10⁶ hücre olacak şekilde %90 konfluens düzeyine kadar büyütülür. Bu özel deneysel protokolde, doksisiklin ekspresyonu için kritik olan RTTA'yı ve endojen OC four lokusundan GFP'yi eksprese eden MEF'ler kullanıyoruz.

MES'ler GFP negatiftir, ancak gerçek iPS hücreleri GFP pozitif hale gelir. Bu marka, yeniden programlanmış hücrelerin tanımlanmasını sağlayan bir yöntem sunar. Fibroblastlardaki kültür ortamını aspire edin ve 10 ml PBS-EDTA ile yıkayın, PBS-EDTA'yı boşaltın ve 5 ml 1x tripsin ekleyip 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin, hücrelerin kapların tabanından ayrılmasına yardımcı olacaktır.

Şimdi, hücreleri tek hücre süspansiyonu şeklinde yeniden süspande etmek için dokuz ml kültür ortamı ekleyin ve bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Bu hücreler daha sonra santrifüj edilerek peletlenir. Pelet yeniden süspande edildikten sonra, süspansiyondaki hücre sayısı sayılır ve konsantrasyon ml başına 8 × 10⁴ hücreye ayarlanır.

Ardından, hücre süspansiyonundan 10 ml jelatin ile kaplanmış 10 santimetrelik bir kaba aktarılır. Kabı gece boyunca 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin. Gece boyunca süren inkübasyonun ardından, fibroblast kabındaki besiyeri aspire edilir ve kaba virüs içeren 10 ml besiyeri eklenir. Hücreleri dört saatten gece boyunca sürecek şekilde 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin.

Ertesi gün, fibroblast kabındaki besiyerini aspire edin ve ardından 10 mL taze ESL besiyeri ekleyin. Bu aşamada hücreler dondurulabilir, genişletilebilir veya yeniden programlamanın başlatılması için hazırlanabilir. Yeniden programlamayı başlatmak için, dört genin ekspresyonunu başlatmak amacıyla standart ESL besiyerini doksisiklin içeren besiyeri ile değiştirin.

Bu hücreleri inkübatöre yerleştirin ve koloniler toplanabilecek kadar büyüyecek seviyeye gelene kadar besiyerini her gün değiştirin. Koloniler, yeniden programlamanın başlatılmasından yaklaşık bir hafta sonra görünür hale gelmelidir. Yaklaşık 20. gün civarında toplanabilecek kadar büyümüş olmaları gerekir.

20 gün geçtiğine göre, kolonileri seçmeden önce iPS kolonilerini seçme işlemine geçebiliriz. Seçimden bir ila iki saat önce, gama ışınlanmış DR-four myths içeren gerekli sayıda jelatin kaplı 24 kuyucuklu plakların hazır bulunduğundan emin olunmalıdır. Seçimden hemen önce, plakalardaki kolonilere taze besiyeri eklenerek besleme yapılmalıdır; seçme işleminden hemen önce V tabanlı 96 kuyucuklu bir tabağın kuyucuklarına 50 µL HEPA tamponu ekleyin, seçilecek kolonileri içeren tabağı bir kez PBS ile yıkayın ve tabağa 10 mL PBS ekleyin. iPS hücre kümeleri, stereo veya ters mikroskop altında seçilebilir.

Kümelenmeleri gidermek için kolonileri küçük bir pipet ucuyla seçin ve PBS içeren 96 kuyucuklu plağın bir kuyucuğuna aktarın. Kümelenmeleri parçalamak için pipet ucuyla kümenin etrafına bir daire çizilir. Artık çok kanallı pipet kullanılarak yeniden programlanmış hücreler çıkarılabilir; her birine 20 µL tripsin eklenir.

Üç kez pipetle yukarı aşağı karıştırın ve 37 °C'de dört dakika inkübe edin. Dört dakikalık inkübasyonun ardından, tripps nice kolonilerine 100 µL ES medium ekleyin. 10 kez pipetle yukarı aşağı karıştırın ve her seferinde altı klonu transfer edin.

Hücreler, 12 kanallı pipetleyicinin her iki konumunda bir uç kullanarak 96 kuyucuklu kaptan 24 kuyucuklu kaba aktarılır ve ardından 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatörde, hücreler %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar 24 kuyucuklu plakada büyütülür. Hücreler, ES hücre ortamı ile beslenerek muhtemelen üç ila yedi gün sonra ekspansiyona hazır hale gelecektir. Birkaç gün sonra, iPS hücreleri konfluense ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen uzaklaştırın, 100 µL 1X tripsin ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin ile inkübasyonu takiben, 400 µL ESL ortamı ekleyin ve pipetle aşağı-yukarı çekerek hücreleri süspanse edip tek hücre süspansiyonu oluşturun.

24 kuyucuklu plakadan alınan 500 µL tek hücre süspansiyonu, ardından altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarılır ve hücreler altı kuyucuklu plakada %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde inkübe edilir. Bu noktada, hücreleri southern analizi, blastlar, enjeksiyonlar, teratoma deneyleri veya in vitro diferansiyasyon deneyleri için çoğaltma aşamasına geçebilirsiniz. Bu değerli iPS hücresi stoklarını kaybetmemek için bu hücrelerin stok tüplerini dondurmayı unutmamalısınız.

İndüklenebilir bir antiviral sistem kullanarak fare embriyonik fibroblastlarında pluripotensinin nasıl indüklendiğini size göstermiş olduk. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.