Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

50 yıldan fazla bir süre önce, deri fibroblastları gibi terminal olarak farklılaşmış hücrelerin, embriyonik kök hücrelere benzer bir pluripotent duruma geçmeye zorlanabileceği varsayılmıştır. Bu kavramın temeli, birkaç küçük istisna dışında tüm hücre tiplerinin aynı genetik koda sahip olduğu ve hücre tipleri arasındaki tek farkın kodun nasıl okunduğu olduğu gözlemiydi. Farklılaşmış bir hücrenin hücresel kimliğini pluripotent bir duruma değiştirme yeteneği, hücresel yeniden programlama olarak adlandırılır.

Yarım on yıllık bir araştırmadan sonra, son zamanlarda dört transkripsiyon faktörünün zorla ekspresyonunun cilt fibroblastlarını pluripotent hale getirmek için yeniden programlayabileceği gösterilmiştir. Bu bulgunun etkisi çok büyük. Temel biyolojinin öneminin ötesinde, insan embriyonik kök hücrelerinin nakil tedavisi için kullanılmasına yönelik büyük etik itirazların da üstesinden gelir.

Yeniden programlamanın gerçekleşmesi için, transkripsiyon faktörlerini kodlayan dört genin OC, dört, sox, iki cmic ve K dördünün paketlenmesi ve bir lentivirüs doku kültürüne konması gerekir. Saflaştırılmış virüs içeren besiyeri daha sonra yüksek yoğunluklu fibroblast içeren bir hücre kültürü kabına eklenir ve bu kabın içinde inanılmaz bir şey meydana gelir. Fibroblastların küçük bir kısmı, transkripsiyon faktörü taşıyan virüslerin dördü ile enfekte olur ve farklılaşmaya başlar.

Morfolojilerinde ve çoğalmalarında ciddi değişiklikler geçirirler ve oluşan pluripotent kök hücrelerin büyük manevi kümelerine bölünmeye başlarlar. Embriyonik kök hücre koşullarında iki ila üç haftalık kültürden sonra, yeniden programlanmış fibroblast kolonileri manuel olarak izole edilebilir ve in vitro olarak genişletilebilir. Saflaştırıldıktan sonra, bu hücreler, farklılaşmış fibroblastlardan türetilen hücrelerin belirli bir yüzdesinin farenin farklı dokularına katkıda bulunabileceği kimerik fareler üretmek için kullanılabilir.

Orijinal fibroblastların genetik materyalinin germ hattına katkıda bulunduğu çanlarda, genetik kod bir sonraki nesle, sonra bir sonrakine ve sonra bir sonrakine aktarılır. Viral bir dağıtım sisteminin kullanımı şu anda klinik uygulamalar için bir engel olsa da, bu muhtemelen kısa sürede üstesinden gelinecektir. Bu videoda, yin laboratuvarı üyeleri, indüklenmiş güçlü kök hücrelerin fare embriyonik fibroblastlarından nasıl türetildiğini gösterecek.

Merhaba, ben Cambridge, Massachusetts'teki Whitehead Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'ndeki Rudolph Jish'in laboratuvarından Grant Welted. Ve ben Tobias Bro brink de ish lab'danım. Bugün size dört CDNA'nın tanıtılmasıyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin oluşumunu göstereceğiz: OCT, dört SOX, iki CIC, KF, dördü, bu dört CDNA'yı bir Tet OCMV promotöründen eksprese eden lentivirüsler kullanılarak.

Bu, fare Embriyonik fibroblastlarının enfeksiyonundan sonra bu dört transgenin ekspresyonunun hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Bugün size gösterdiğimiz protokol, muhtemelen insan hücrelerini enfekte edebilecek lentivirüsün işlenmesini içerir. Bunu kendiniz yapmaya çalışmadan önce her zaman güvenli prosedürleri izlemeniz ve güvenlik ofisinizle iletişime geçmeniz çok önemlidir.

Öyleyse, mes'i IPS hücrelerine dönüştürecek lentivirüs üretmek için bazı IPS hücreleri üretelim. 2 9 3 hücreleri, viral paketleme için gerekli genetik elementleri sağlayan üç plazmit Paks iki ile transfekte edilmelidir. Veziküler stomatit virüsü veya VSV'nin zarf glikoproteinini eksprese eden dört CD yardımcısı T dört SOX iki, KLA dört veya CMIC PMDG'den birine sahip bir FUW TE OCMV lentivirüsü olan viral omurga.

Bu da oluşturacak virüsü atropik virüs yapar. Bu nedenle, uygun BL iki artı prosedürlerinin izlenmesi gerekir. Bu özel videoda, aslında bulaşıcı virüsle ilgilenmiyoruz, bu yüzden tipik önlüklerimizi giymiyoruz ve BL iki artı tesisimizde değiliz.

Transfeksiyon 2'den önce, 9 3 hücreleri sıvı nitrojenden çözülür ve% 90 Co akıcılığına getirilir, hücreler daha sonra FU geni ile transfekte edilir ve virüsü eksprese etmek için 48 ila 72 saat verilir, bu sırada hücreleri yıkayan ortam 0.45 mikronluk bir filtre kullanılarak süzülür ve virüs konsantre edildikten sonra ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edilir. Artık IPS kümeleri oluşturmak için MES'i enfekte etmeye hazırız Viral hazırlama aşamaları sırasında, fare embriyonik fibroblastları üç defadan daha az geçiş, 10 santimetrelik tabaklarda yaklaşık iki kez 10 ila altı hücrede% 90 co akıcılığına kadar büyütülür. Bu özel deneysel protokolde, doksisiklin ekspresyonu ve endojen OC dört lokusundan GFP için kritik olan RTTA'yı eksprese eden MES kullanıyoruz.

MES GFP negatiftir, ancak gerçek IPS hücreleri GFP pozitif olur. Bu işaretleyici, yeniden programlanmış mes'i tanımlamak, kültür ortamını fibroblastlardan aspire etmek ve 10 mil hippi, EDTA ile yıkamak, hippilerin EDTA'sını atmak ve beş mil bir kez tripsin eklemek ve 10 dakika boyunca 37 derecede inkübe etmek için bir yönteme izin verir. Tripsin, hücreleri bulaşıkların altından kaldırmaya yardımcı olacaktır.

Şimdi, hücreleri tek bir hücre süspansiyonunda yeniden süspanse etmek ve 15 mil'lik bir tüpe aktarmak için dokuz mil kültür ortamı ekleyin. Bu hücreler daha sonra döndürülür ve peletlenir. Peletin tekrar askıya alınmasından sonra, süspansiyondaki hücre sayısı sayılır ve konsantrasyon, mil başına dört hücreye sekiz kez 10 olarak ayarlanır.

10 mil hücre süspansiyonu daha sonra jelatin ile kaplanmış 10 santimetrelik bir kaba aktarılır. Çanağı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin,% 5 CO2 gece boyunca inkübasyon ortamını takiben bir fibroblast kabından aspire edilir ve 10 mil virüs içeren besiyeri metamfetamin içine eklenir. Hücreleri dört saatten gece boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2'de inkübe edin.

Ertesi gün, besiyerini bir fiberblast kabından aspire edin ve ardından 10 mil taze ESL besiyeri ekleyin. Bu aşamada, hücreler dondurulabilir, genişletilebilir veya yeniden programlamanın başlatılması için hazırlanabilir. Yeniden programlamayı başlatmak için, dört genin ekspresyonunu başlatmak için normal ESL ortamını doksisiklin içeren ortamla değiştirin.

Bu hücreleri kuluçka makinesine yerleştirin, koloniler toplanacak kadar büyüyene kadar ortamı her gün değiştirin. Koloniler ilk olarak yeniden programlamanın başlamasından yaklaşık bir hafta sonra görünür hale gelmelidir. 20. gün civarında alınabilecek kadar büyük olmalıdırlar.

Artık 20 gün geçtiğine göre, kolonileri seçmeden önce IPS kolonilerini seçebiliriz. Toplamadan bir ila iki saat önce gerekli sayıda jelatin kaplı 24 kuyulu DR dört efsane ile jelatin kaplı 24 kuyulu plakayı görmeyi unutmamak gerekir. Toplamadan hemen önce taze besiyeri eklenerek koloniler plakalar üzerinde beslenmeli, toplamadan hemen önce V tabanlı 96 Kuyulu bir tabağın kuyucuklarına 50 mikrolitre HEPA tamponu eklenmeli, toplanacak kolonileri içeren kabı bir kez PBS ile yıkamalı ve tabağa 10 ml PBS eklenmelidir, IPS hücre kümeleri stereo veya ters mikroskop altında toplanabilir.

Kümeleri küçük bir pipet ucu ile toplayın ve kümeleri çıkarmak için PBS içeren 96 kuyulu çanağa bir kuyuya aktarın. Matematiği bölmek için kümenin etrafına pipet ucu ile bir daire çizilir. Artık yeniden programlanan hücreler çok kanallı pipetleyici kullanılarak ekstrakte edilebilir, her birine 20 mikrolitre tripsin eklenir.

Üç kez yukarı ve aşağı sıkın, 37 ° C'de dört dakika inkübe edin. Dört dakikalık inkübasyondan sonra, tripps güzel kolonilerine 100 mikrolitre ES ortamı eklenir. 10 kez yukarı ve aşağı sıkın ve bir seferde altı klon aktarın.

96 kuyulu çanağından 24 oyuklu bir çanağa kadar, 12 yerli pipetleyici hücreleri üzerindeki diğer her pozisyonda bir uç kullanılarak 24 oyuklu plaka üzerinde 37 cent derecede,% 5 CO2 inkübatörde hücreler% 80 ila 90'a ulaşana kadar büyütülür. Artık IPS hücreleri birleştiğine göre, ortamı aspire edin ve hücreleri bir mil hippi ile tamamen yıkayın Hipileri çıkarın ve 100 mikrolitre bir kez tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tripsin ile inkübasyonun ardından, 400 mikrolitre ESL ortamı ekleyin ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturun.

24 oyuktan gelen 500 mikrolitrelik tek hücreli süspansiyon daha sonra altı oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna aktarılır ve hücreler altı oyuklu plakada% 80 ila 90 co akıcılığa ulaşana kadar 37 santigrat derece% 5 CO2 inkübatörde inkübe edilir. Bu noktada, güney analizi, blastlar, enjeksiyonlar, teratom tahlilleri veya in vitro farklılaşma tahlilleri için hücreleri amplifiye etmeye devam edebilirsiniz. Ve bu değerli IPS hücresi stoğunu kaybetmemek için bu hücrelerin stok valflerini dondurmayı unutmamalısınız.

İndüklenebilir bir antiviral sistem kullanarak fare embriyonik fibroblastında pluripotensi nasıl indükleyeceğinizi gösterdik. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.