Name: Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Öğrenin, fare plasentasından hematopoietik kök hücre izolasyonu ve analizi yöntemlerini. Bu teknik, embriyonik gelişimdeki HSC nişlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Embriyo kaldırma ve plasental diseksiyonu <ol><li> Başlamak için, embriyolarının ilk hamile barajlardan izole edilmelidir. </li><li> Hayvanlar onaylanmış prosedürlere göre ötenazi bizim durumumuzda ölümcül dozda anestezi izofluran kullanmak için gidiyoruz </li><li> İlk olarak, etanol ile karın sprey ve bir makas ile küçük bir kesi yapmak. </li><li> Karın ortaya çıkarmak ve periton açık kesmek için iki elinizle deri koparmak. </li><li> Forseps ile uterin boynuz pick up ve onları her distal sonunda makas kullanarak toplamak. PBS ve yer buz dolu bir petri rahim boynuzları yerleştirin. Ayrıca, plasenta izole önce PBS ile birkaç kez yıkamak için hatırlıyorum. Biz şimdi plasenta ayırabilirsiniz. </li><li> Iki forseps ile embriyo conceptuses çevreleyen endometrial doku dikkatlice uzakta soyma başlar. Bir delinme veya embriyoların yapısal hasar, aksi takdirde sonraki diseksiyonu adımları zorlaştıracaktır dikkatli olmalıdır. </li><li> PBS ile buz üzerinde yeni bir petri izole conceptuses yerleştirin ve tüm conceptuses endometrium kurtulmuş kadar devam ediyor. </li><li> PBS ile mikroskop altında ve iki forseps plasenta desidua kabuğu ile yerleştirilen yeni bir petri bir konseptus aktarın. Desidua hücreleri tek hücre süspansiyonu ve flow sitometri ile müdahale mümkün olduğunca desidua kadar çıkarın. Pürüzsüz sürekli soyma hareketi en iyi sonuçları elde etmek için tavsiye edilir. </li><li> Iki organ arasında kavşakta plasenta yolk kesesi uzak kesin ve nazikçe plasenta uzak yolk kesesi ve vitellin damarları çekin. Bakım, özellikle erken embriyolar, plasentanın koryonik plaka bozmak için değil alınmalıdır. </li><li> Forseps çifti ve başka bir ile göbek kordonu ile plasentanın koryonik plaka dikkatlice tutarak, göbek kordonunun plasenta uzak ve bağlı embriyo çekin. </li><li> Tek hücre süspansiyonu hazırlanması sırasında topaklanma hücre en aza indirmek için plasentanın kenarlarında aşırı dev hücre dokusu çıkarın. </li><li> PBS +5% FCS ve buz üzerinde, uygun bir kaba 15 ml Falcon tüp gibi, plasenta toplayın. Disseke tüm plasenta için bunu yapın. </li><li> Bu noktada, ya da in vitro kültür veya transplantasyon gibi flow sitometri, fonksiyonel testleri, tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması ile devam edebilirsiniz ya da doku fiksasyon ve nihai immünohistokimya için gömme sabit dondurulmuş blok için bütün plasenta hazırlamak. </li></ol> 2. Plasenta dokusunun tek hücre süspansiyonu hazırlanması <ol><li> Şimdi FACS analizi için plasentanın tek bir hücre süspansiyonu nasıl oluşturmak için size gösterecektir. </li><li> Plasenta tek bir hücre süspansiyonu, mekanik ve enzimatik ayrılma hazırlamak için gereklidir. İlk% 10 FCS ve% 1 penisilin / Streptomisin çözüm PBS içinde% 0,1 kollajenaz solüsyon hazırlanır. </li><li> Kaç bağlı olarak kollajenaz çözüm uygun bir hacmi, plasenta ekleyin. Plasenta hacmi ve 2-5ml arasında iki kez hacmi önerilir. </li><li> 5 ml şırınga, iğne 3 kez kollajenaz çözüm ve plasenta yoluyla Pasajlanması doku mekanik bozmaya donatılmış bir 16-G iğne kullanın. 18-G bir iğne ile tekrarlayın. </li><li> 45 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör örnek yerleştirin. </li><li> 20 G iğne ile kollajenaz, pasajı hücre çözümü, 37, ek bir 45 dakika boyunca inkübe ° C de 45 dakika inkübasyondan sonra </li><li> Her bir iğne ile 22-G ve 25 G iğneler aracılığıyla kollajenaz, pasajı hücre çözümü toplam 1.5 saat inkübasyon sonra 3 kez. </li><li> 50 mikron filtre ile yeni bir 15 ml Falcon tüp takılı bir örnek Filtre, 4 PBS +% 5 FCS ve santrifüj ile yıkayın ° C 5 dakika boyunca 300 × g. </li><li> Bu noktada, biz FACS analiz ve fonksiyonel testleri için uygun tek bir hücre süspansiyonu var. </li></ol> 3. Dondurulmuş Bölüm Doku Fixation <ol><li> Hemen her embriyonun plasenta izole sonra, soğuk 1X PBS yerleştirilir. Genellikle 96-plaka genç plasenta (E8.5-11.5) için en iyi çalışır, ancak büyük plasentası ile E12.5 ve yaşlı, 24 plaka daha uygun olabilir. </li><li> Her plasenta taze çözülmüş% 4 paraformaldahyde veya PFA ile de dolu yeni bir aktarılır. E12.5 plasenta, doku yeni bir de elle taşınır, ancak E10.5 bir pipet yardımıyla dikkatlice PBS kaldırmak ve PFA ekleyin. Plasenta doku yaşına ve büyüklüğüne göre tamamen, 4 ° C&#39;de 2-4 saat süreyle dalmış olduğu önemlidir. </li><li> % 30 sukroz doku transferi, ya da dokuların çok küçük ve narin ise, PFA aspirat ve sakaroz doğrudan ekleyin. Bu aşamada, plasenta çözüm yüzen olacaktır. Dokular 4 geceleme ° C</li><li> % 30 sukroz gecede adım sonra, sonuçta dokuları uygun kriyoprezervasyon göstergesidir iyi alt lavabo olmalıdır. Sakaroz çözeltisini yarısını çıkarın ve OCT ile ses değiştirin ve 4 ° C&#39;de 1-2 saat süreyle doku yerleştirmek. Bu Ekim penetrasyonu kolaylaştırır. </li><li> Gömülü olması, bu tarihten sonra 1 saat süreyle% 100 Ekim doku aktarın. </li></ol> 4. Sabit Doku gömülmesi <ol><li> Uygun doku tanımlama ile (show örnek kalıp) Etiket plastik kalıplar. </li><li> OCT çözüm dokusu dışarı doğru çekin ve disk şeklindeki plasenta göbek kordonu yüzü aşağı bakacak şekilde yönlendirilmesi ve dikkatli bir şekilde sağlamak için baskı bırakmadan önce temiz bir jilet bıçağı ileri geri hareket etmek için emin olun dilimleme yarısında plasenta kesmek bile kesti. Plasenta, daha sonra plasental HKH&#39;lerin görselleştirmek için en iyi prientation ulaşmak için yarıya. </li><li> Bir kalıbın alt yüzeyi ile temas halinde kesme kenarı ile kalıp altındaki plasenta yarım. Diğer yarısı için yeni bir kalıp ile tekrarlayın. E10.5 plasenta için, her iki devreyi de aynı tekniği kullanarak aynı kalıp içine konabilir. </li><li> , Kalıp içine OCT dökülerek zaman, doğru yönde plasenta tutmak zor olabilir. Doku forseps ile yarım tutarak yerde plasenta sabitleyin. Ekim çözüm kalıp içine yavaşça dökün ve varsa kabarcıkları kaçının. E10.5 plasenta, forseps bir doku yarısını tutun ve forseps dışında diğer doku karşı yarım bekletin. Ekim çözüm E12.5 plasenta açıklandığı gibi yavaşça dökün. </li><li> Kalıp OCT ile doldurulduktan sonra, hızlı bir şekilde kuru buz üzerine kalıp, OCT doku dondurma beyaz flaş dönecek </li><li> Kalıp Drierite içeren küçük bir plastik torba içine koyun ve hemen -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Bu protokol açıklanan deneysel prosedürleri plasental doku ve hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin izolasyonu ve görüntüleme için izin verir. Fetal gelişim boyunca plasenta ve diğer fetal hematopoetik organlar HKH&#39;lerin beklenen hücresel verim ve sayısı hakkında kapsamlı bir özeti için Gekas, ark bakın. 2005. Plasenta gelişmekte HKH&#39;lerin ve diğer hematopoetik hücreler lokalizasyonu için Rodos ve ark bakın. 2008.

Malzeme Listesi: 100 mM Glukoz 10mM NaN3 15 ml konik tüpler (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G ve 25 G iğneler (BD) % 30 Sakkaroz Çözüm 35mm Petriler (BD) 4% Paraformaldehit 50 - m hücre filtreleri (Celltrics) 5 ml şırınga (BD) Alkalin Fosfataz Yüzey Takımı (Vektör Kırmızı, Vektör) Alkalin Fosfataz Yüzey Takımı III (Vektör Mavi, Vektör) Antibiyotik (Penisilin / Streptomisin, P / S) çözümü Kollajenaz tip I (Sigma) Cryomold Disposable Vinil Numune Kalıpları (10mm x 10mm x 5 mm, Doku-Tek) Sitokeratin İlköğretim Antikor (DakoCytomation) Diseksiyon forseps, paslanmaz çelik veya titanyum, sayı 5 veya 55 Drierite Fetal sığır serumu (FBS) Fisherbrand Plastik Mikroskop Slayt Mailer (Balıkçı) Glikoz oksidaz 1000u/ml Levamisole (Vector) Montaj medya, Sulu tabanlı Montaj Orta (VectamountTM AQ) Normal At Serumu (Vektör) Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT, Doku-Tek) Peroksidaz Yüzey Takımı DAB (Vektör) Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Kalsiyum / Magnezyum (w Ca2 + / Mg2 +) Fosfat Tamponlu Salin (PBS), Kalsiyum / Magnezyum (w / o Ca2 + / Mg2 +) olmadan Plastik Slayt Kutusu (100 slaytlar tutan) Plastik Boru (Nalgene 180 PVC Sigara toksik Otoklavlanabilir) Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Tüp, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinaz K 20mg/ml Çözüm (Amresco) Araştırma Ürünler International Corp Süper Pap Kalem HT * Slayt işaretlerini (2,5 mm, Fisher) Doku kültürü U-şekilli (yuvarlak alt) tedavi 96-iyi ya da 24 kuyu levhalar (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Tyramide Amplifikasyon Kit (Invitrogen) Vectastain ABC Alkalin Fosfataz Standart Kiti (Vector) Vectastain ABC Standart Elite Kiti (Vector)

plasenta hematopoetik kök hücre İzolasyonu ve analizi

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoetik kök hücreler (HKH&#39;lerin), kendi kendini yenileme ve bireyin ömrü boyunca kan soyların bütün hücre tipleri oluşturmak yeteneğine sahip. Tüm HKH&#39;lerin kendi havuzu boyutu kendini sürekli yenileyen hücre bölünmeleri tarafından yapılmaktadır, bundan sonra, embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkar. HSC gelişme sürecini düzenleyen HKH&#39;lerin ve kritik gelişimsel olayların anatomik kökenli belirlenmesi, birçok anatomik siteler fetal hematopoez sırasında katılmak olarak karmaşık olmuştur. Son zamanlarda, büyük hematopoetik bir organ olarak HKH&#39;lerin (Gekas, ve ark 2005, Rodos, ve ark 2008) ve eşsiz microenvironmental nişler genişletilmiş plasenta belirledi. Sonuç olarak, plasenta, bunların ortaya çıkması ve ilk genişleme sırasında HKH&#39;lerin önemli bir kaynak. Bu makalede, biz E10.5 ve sırasıyla HKH&#39;lerin başlatılması ve plasenta HSC havuzu boyutu zirve gelişim evreleri ile ilgili E12.5 embriyolar, fare plasentanın izolasyonu için diseksiyon teknikleri gösteriyor. Buna ek olarak, flow sitometri veya fonksiyonel testleri kullanmak için tek hücre süspansiyonu içine plasental doku enzimatik ve mekanik ayrılma için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Plasentanın tek hücre süspansiyonu için kollajenaz kullanımı HKH&#39;lerin yeterli verimi verdiğini bulduk. Plasenta HSC verimi etkileyen önemli bir faktör, önceden mekanik ayrılma derecesi, ve enzimatik tedavi süresi. Biz de onların hassas hücresel nişler içinde immünohistokimya HKH&#39;lerin gelişmekte olan görselleştirme için sabit-dondurulmuş plasental doku kesitlerinde hazırlanması için bir protokol sağlar. Hematopoetik spesifik antijenler parafin bölümlerinin hazırlanması sırasında korunur olarak, rutin plasental HKH&#39;lerin ve atalarıdır lokalize için sabit dondurulmuş bölümleri kullanabilirsiniz.

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH&#39;lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH&#39;lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoetik kök hücreler (HKH'ler), bireyin yaşamı boyunca kendilerini yenileme ve tüm kan soyu hücre tiplerini üretme yeteneğine sahiptir. ...

Merhaba, ben Mikkola ve laboratuvarıma hoş geldiniz. Laboratuvarımızın temel odak noktası, hematopoetik kök hücre gelişimini araştırmaktır. Embriyogenez sırasında, plasentayı ana bir hematopoetik organ olarak tanımladık ve hematopoetik kök hücrelerin plasentadaki benzersiz mikroçevresel nişlerde hem üretildiğini hem de genişlediğini bulduk.Bu nedenle plasenta, hematopoetik kök hücrelerin ortaya çıkışı ve ilk genişlemeleri sırasında muazzam bir kaynak değeri taşır. Bugün laboratuvar üyelerim, hematopoetik kök hücrelerin plasentadan izolasyonu ve HCS'lerin kendilerine özgü mikroçevresel nişlerinde görüntülenmesi için gerekli olan deneysel teknikleri gösterecekler. Merhaba, ben UCLA Moleküler Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nde, Dr. Hannah Mola'nın laboratuvarından Chriss Geka.Bugün size fare plasentasının nasıl diseke edileceğini ve fetal hematopoetik kök hücrelerin fax analizi için plasenta dokusundan tek hücre süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Ben Katrina Rhodes ve size immunohistokimya için plasenta dokusunun nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Hadi başlayalım.Başlamak için, embriyolar önce gebe dişilerden izole edilmelidir. Hayvanlar, onaylanmış prosedürlere uygun olarak ötanize edilir. Bizim durumumuzda, anestezik isof fluorine'in öldürücü bir dozunu kullanacağız.Öncelikle, karnı etanolle püskürtün ve bir makas yardımıyla küçük bir insizyon yapın. Karın bölgesini açığa çıkarmak için deriyi iki elinizle ayırın ve peritonu pensle kesin. Uterin hornları tutun ve her bir distal uçtan makas kullanarak toplayın.Uterin hornları PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerine koyun. Ayrıca, iki pensle plasentayı izole etmeden önce birkaç kez PBS ile yıkamayı unutmayın. Embriyo kavramlarını çevreleyen endometrial dokuyu dikkatlice soymaya başlayın.Bu embriyolar, hematopoetik kök hücrelerin veya HSC'lerin plasentada zirveye ulaştığı gelişimsel yaş olan embriyonik gün 12,5'e aittir. Sonraki diseksiyon aşamalarını zorlaştıracağı için embriyoların delinmemesine veya yapısal olarak zarar görmemesine dikkat edilmelidir. İzole edilen konseptler, üzerinde buz üzerinde PBS bulunan yeni bir petri kabına yerleştirilmeli ve tüm konseptler endometriyumdan ayrılana kadar işleme devam edilmelidir.Bir konseptusu, mikroskop altına yerleştirilmiş PBS içeren yeni Petri kabına aktarın. İki forseps yardımıyla, deciduayı G plasentasından soyarak ayırın. Decidua hücreleri girişime neden olacağı için, deciduayı mümkün olduğunca temizleyin.Tek hücre süspansiyonu ve akış sitometrisi ile. En iyi sonuçları elde etmek için pürüzsüz ve sürekli bir soyma hareketi önerilir. Şunu belirtmek gerekir ki, bu embriyonik gün 10.5 veya E 10.5 embriyoları gibi daha genç embriyolarla çalışırken, deidra tüm konseptusu çevreleyecektir.E 10,5 embriyolarda, E 12,5 embriyolarının aksine, HSC'ler plasenta içinde henüz yeni ortaya çıkmaya başlamaktadır. E 10,5 ve E 12,5 embriyoları arasındaki belirgin boyut farkına dikkat edin. Vitellüs kesesini, iki organın birleştiği noktadan plasentadan kesin ve vitellüs kesesi ile belin damarlarını nazikçe plasentadan ayırın.Özellikle erken evre embriyolarda, plasentanın koroid plağının bozulmamasına dikkat edilmelidir. Bir forsepsle plasentanın CHO plağını, diğeriyle ise göbek kordonunu dikkatlice tutun. Göbek kordonunu ve ona bağlı embriyoyu plasentadan uzağa doğru çekin.Plasentanın kenarlarındaki fazla dev hücre dokusunu temizleyin. Tek hücre süspansiyonu hazırlığı sırasında hücre kümelenmesini en aza indirmek için, plasentayı PBS ve %5 FCS içeren 15 ML Falcon tüpü gibi uygun bir kaba toplayın ve buza yerleştirin. Bunu diseke edilen tüm plasentalar için uygulayın. Bu aşamada, in vitro kültür veya transplantasyon gibi akış sitometrisi fonksiyonel analizleri için tek hücre süspansiyonu hazırlama işlemine devam edebilir veya doku fiksasyonu ve nihai immünohistokimya için fiksasyonlu dondurulmuş blok gömme işlemi amacıyla tüm plasentayı hazırlayabilirsiniz.Şimdi size, FACS analizi için plasentadan nasıl tek hücre süspansiyonu oluşturacağınızı göstereceğiz. İlk olarak, %10 FCS ve %1 penisilin streptomisin içeren PBS içinde %0,1'lik bir kollagenaz çözeltisi hazırlayın. Plasentanın miktarına bağlı olarak, uygun hacimde kollagenaz çözeltisi ekleyin; plasenta hacminin iki katı olan, iki ila beş mililitre arasında bir hacim önerilir.Kollajenaz çözeltisini ve plasentayı bir beş ml şırıngaya takılmış 16 gauge iğne aracılığıyla üç kez geçirerek dokuyu mekanik olarak parçalayın. İşlemi sekiz gauge iğne ile tekrarlayın. 45 dakikalık inkübasyonun ardından örneği 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 45 dakika boyunca bekletin.Kollajenaz pasajında, toplam bir buçuk saatlik kollajenaz inkübasyonunun ardından hücre solüsyonunu 20 gauge bir iğne aracılığıyla geçirin ve 37 derecede 45 dakika daha inkübe edin; ardından hücre solüsyonunu 22 gauge ve 25 gauge iğnelerle, her bir iğneyi üçer kez kullanarak geçirin. Şimdi örneği, yeni bir 15 ML Falcon tüpüne takılı 50 µm'lik bir filtreden süzün, PBS artı %5 FCS ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin. Bu noktada, FACS analizi için uygun tek hücreli bir süspansiyona sahip olduk.Plasental dokunun immünohistokimya için nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Plasental dokunun immünohistokimyası, plasental mikroçevre içindeki hematopoetik kök hücrelerin lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Plasentanın her bir embriyodan izole edilmesinin hemen ardından, soğuk 1x PBS içine yerleştirilirler; genellikle genç plasentalar (embriyonik gün 8.5 ile 11.5 arası) için 96 kuyucuklu plaka en iyi sonucu verir, ancak E 12.5 ve daha yaşlı plasentalar için 24 kuyucuklu plaka daha uygun olabilir.Her bir plasenta, taze çözünmüş %4 PARALDEHYD veya E 12.5 günü plasentaları için PFA ile doldurulmuş yeni bir kuyucuğa aktarılır. Doku, elle yeni bir kuyucuğa taşınır. Ancak E 10.5 plasentaları için, PBS'yi bir pipetle dikkatlice çekip PFA ekleyebilirsiniz.Dokunun yaşına ve boyutuna bağlı olarak, plasentanın 4 °C'de iki ila dört saat boyunca tamamen daldırılması önemlidir. Ardından dokuyu %30 sükroza aktarın. Dokular çok küçük ve hassassa, PFA'yı aspire edin ve sükrozu doğrudan ekleyin.Bu aşamada plasenta çözelti içinde yüzer halde olacaktır. Dokunun dört derece C'de gece boyunca bekletilmesine izin verin. %30 sükroz içindeki gecelik bekleme adımından sonra, dokuların kuyucuğun dibine çökmesi gerekir ki bu durum doğru kriyoprezervasyonun göstergesidir. Ardından, sükroz çözeltisinin yarısını uzaklaştırın ve bu hacmi OCT ile değiştirin.Dokuyu bir ila iki saat boyunca dört °C'ye geri yerleştirin. Bu işlem, OCT penetrasyonunu kolaylaştırır. Son olarak doku, bir saat boyunca %100 OCT'ye aktarılır ve ardından gömme işlemi yapılabilir.Plastik kalıpları uygun doku tanımlama etiketleri ile işaretleyin. Dokuyu OCT çözeltisinden çıkarın ve disk şeklindeki plasentayı, göbek kordonu tarafı aşağı gelecek şekilde konumlandırarak temiz bir jiletle dikkatlice kesip ikiye bölün; eşit bir kesim sağlamak için basıncı serbest bırakmadan önce jileti geri hareket ettirdiğinizden emin olun.Plasental hematopoetik kök hücrelerin daha sonraki görselleştirmesi için en iyi yönelimi sağlamak amacıyla plasenta ikiye bölünür. Ardından, plasenta yarısının bir parçası, kesik kenarı kalıbın alt yüzeyiyle temas edecek şekilde kalıbın tabanına yerleştirilir. Diğer yarı için işlem yeni bir kalıpla tekrarlanır.E 10.5 plasentaları için, her iki yarı da aynı teknik kullanılarak aynı kalıba yerleştirilebilir. OCT kalıba dökülürken plasentayı uygun yönde tutmak zor olabilir. E 10.5 plasenta için doku yarısını pensle tutarak plasentayı yerinde sabitleyin.Dokunun bir yarısını pensle tutun ve dokunun diğer yarısını pensin dış kısmına yaslayın. Ardından, E 12.5 için açıklandığı şekilde OCT çözeltisini yavaşça dökün. Kalıp OCT ile dolduğunda, kalıbı hızla kuru buzun üzerine yerleştirin.OCT beyazlaşacak ve dokuyu şok donduracaktır; kalıbı küçük bir plastik torbaya yerleştirin ve derhal -80 °C dondurucuda saklayın. Burada E 10.5 plasentasının temsili bir kesiti yer almaktadır. Kesitlerinizin, görüntünün altında gösterilen korionik plakayı ve ortada gösterilen, feto-maternal değişimi kolaylaştıran plasenta bölgesi olan plasental labirenti içermesi önemlidir.Bu kesit, endotelyumu kırmızıya boyayan bir CD 31 antikoru ile boyanmıştır. Kahverengi olarak görünen trofoblastlar sitokeratin ile işaretlenmiştir. Labirent, hem kırmızıyla işaretlenmiş fetal damar sistemini hem de kahverengi trofoblastlarla çevrili maternal kan boşluklarını barındırır.Mavi hücreler CD 41 pozitif yeni oluşmuş hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdir; bunların fetal damar sisteminde lokalize olduklarına dikkat edin. Size plasenta kütlesinin nasıl diseke edileceğini ve tek hücre süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını, ayrıca plasental hematopoetik kök hücrelerin akış sitometrisi ile nasıl tanımlanacağını gösterdik. Ayrıca, hematopoetik kök hücrelerin immünohistokimya ile görüntülenmesi için plasenta dokusu kesitlerinin nasıl hazırlanacağını da gösterdik.Bu prosedürler gerçekleştirilirken birkaç kritik parametreye dikkat edilmesi önemlidir. Plasenta diseksiyonu yapılırken, tek hücreli süspansiyon hazırlığı için yüksek hücresel canlılığı korumak amacıyla hızlı çalışmak ve embriyoları ile solüsyonları mümkün olduğunca soğuk tutmak önemlidir. Enzim tedavisi öncesindeki mekanik disosyasyon derecesi ve tedavi sırasındaki inkübasyon süresi, canlılığı ve hücre sağlığını etkileyen en kritik faktörlerdir.Ve son olarak, immünohistokimya yaparken aşırı fiksasyon bazı antijenler için sorunlara yol açabilir; öte yandan yetersiz fiksasyon doku yıkımına neden olabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video yolk kesesi ve aort-gonad mesonephros bölge embriyolardan mikro incelemek ve hematopoietik kök hücreler sıralamak için flow sitometri kullanmak nasıl gösterir.

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Öğrenin, fare plasentasından hematopoietik kök hücre izolasyonu ve analizi yöntemlerini. Bu teknik, embriyonik gelişimdeki HSC nişlerini incelemek için kullanılır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Daha fazla video keşfet