Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

Doku kültürü teknolojisi, hücre biyolojisi alanında geniş uygulama alanı bulmuştur. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücreler sağlıklı kalmak için düzenli bakım gerektirir. Hücreler eş akıcılığına ulaştıkça, alt kültürlenmeleri veya geçişleri gerekir.

Bunun yapılmaması, büyümenin azalmasına ve nihayetinde hücre ölümüne neden olur. Bu videoda, hem yapışık hem de süspansiyon hücre hatları için doku kültürü hücrelerinin nasıl korunacağını gösteriyoruz. Merhaba, ben Ricky, Doğu Tennessee'deki Moleküler Patoloji Laboratuvarları Ağı'ndaki Dr.LAN'ın Laboratuvarı'ndayım.

Bugün size hücreleri paketlemek, askıya almak ve yapıştırmak için iki teknik göstermek istiyorum. Bir hücre plakasını geçmek için. 60 milimetrelik bir Petri kabında veya beş mil doku kültürü ortamı içeren 25 santimetre karelik bir doku kültürü şişesinde akıcılık sağlamak için yetiştirilen bir birincil kültürle başlamak isteyeceğiz.

Steril pipet ile tüm besiyerini birincil kültürden çıkararak başlıyoruz. Daha sonra, yapışan hücre tek tabakasını bir veya iki kez, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 37 santigrat derece HBSS'lik küçük bir hacimle yıkarız. Bir sonraki adımda eklenecek olan tripsin enziminin etkisini inhibe edebilecek herhangi bir kalıntı fetal sığır serumunu çıkarmak için.

Daha sonra, yapışan hücre tabakasını kaplayacak şekilde kültüre yeterince ılık tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Daha sonra plakayı bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derece ısıtma tepsisine yerleştirebilirsiniz. İnkübasyondan sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için plakanın altını düz bir yüzeye hafifçe vurun.

Hücrelerin yuvarlatıldığından emin olmak için kültürü ters çevrilmiş bir mikroskopla kontrol edin, bu da yüzeyden ayrıldıklarını gösterir. Hücreler yeterince ayrılmamışsa, plakayı bir veya iki dakika daha ısıtma tepsisine geri koyun. Dürbünden inceledikten sonra, kabı tam ortamda durulayın ve süspansiyonu iki mil tam ortam içeren 15 mil konik bir tüpe pipetleyin.

Hücreleri pelet yapmak için aşağı doğru döndürün ve peleti tam ortamda yeniden süspanse edin. Şimdi, uygun şekilde etiketlenmiş taze plakaların her birine eşit hacimde hücre süspansiyonu ekleyin. Alternatif olarak, hücreler bir hemo sitometre kullanılarak sayılabilir ve istenen yoğunluğa seyreltilebilir, böylece her plakaya belirli sayıda hücre eklenebilir.

Her plakayı alt kültürün tarihi ve geçiş numarası ile etiketlediğinizden emin olun. Hücre süspansiyonunu ekledikten sonra, her yeni kültüre bir mil taze ortam yerleştirin. Şimdi plakaları nemlendirilmiş 37 santigrat derece% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.

Hücreleri gece boyunca inkübe ettikten sonra, plakalara taze ortam ekleyin ve tekrar 37 dereceye getirin. Plaka akıcı hale geldiğinde, bu prosedürü tekrarlayarak plakayı tekrar geçirebilir ve gerektiği kadar geçmeye devam edebilirsiniz. Şimdi size süspansiyon kültüründe hücreleri nasıl geçireceğinizi göstereceğiz.

Süspansiyon kültüründe hücrelerin paketlenmesi, yapışma hücrelerine göre daha basittir. Süspansiyon kültürlerini paketlemeden önce, hücreler, hücrelerin süspansiyon içinde bir araya toplandığı ve ortamın bulanık göründüğü eş akışkanlığına ulaşana kadar her iki ila üç günde bir beslenerek korunmalıdır. Şişe döndürüldüğünde.

Bunu yapmak için, süspansiyon hücrelerinin şişesini inkübatörden çıkarın ve şişeye yerleşmiş olanları rahatsız etmemeye dikkat edin. Aseptik olarak altta, ortamın yaklaşık üçte birini şişeden çıkarın ve atın ve 37 santigrat derecede eşit hacimde bir ön ısıtma ortamı ile değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra, şişeyi döndürün ve 37 santigrat derece, %5 CO2 olan inkübatöre geri koyun.

15 milden az varsa, şişedeki bir ortam, hücreden ortama teması artırmak için şişeyi yatay konumda inkübe eder. Aksi takdirde, şişeler kültürlerin beslenmediği günlerde dikey olarak inkübe edilebilir. Hücreleri yeniden askıya almak için daireleri döndürerek kontrol edin.

Ortamda iyi bir metabolik büyümeyi gösteren herhangi bir renk değişikliğini gözlemlediğinizden emin olun. Kültürler birleştiğinde, mil başına yaklaşık 2,5 milyon hücre olması gerekir, bunları geçebilirsiniz. Bir kez daha, size hem yapışkan hem de süspansiyon kültürleri için kültürlenmiş hücrelerin nasıl geçirileceğini gösterdik.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve tüm deneylerinizde iyi şanslar.