Donma Çözülme ve Ulaştırma Ambalaj Hücreler
July 2nd, 2008
Kültüre memeli hücrelerinin hücre biyolojisi çalışmalarında yoğun olarak kullanılmaktadır. Bu video hücreleri ve dondurulmuş stokları nasıl kurtarmak için dondurma ve saklamak için gerekli temel becerileri açıklar.
Hücre kültürleri çok çeşitli araştırma ve teşhis uygulamalarında kullanılmaktadır. Bazen hücreleri korumak, yaşlanmayı önlemek, kontaminasyon riskini azaltmak ve genetik sürüklenmenin etkilerini en aza indirmek için gelecekteki çalışmalar için hücre hatlarının saklanması arzu edilir. Hücre hatları uzun süreli depolama için dondurulabilir.
Bu videoda size hem tek tabakalı hem de süspansiyon halinde yetiştirilen hücrelerin nasıl dondurulacağını ve bir kez daha büyümek için nasıl çözüleceğini gösteriyoruz. Merhaba, ben Ricky, Doğu Tennessee'deki Moleküler Patoloji Laboratuvarları Ağı'ndaki Dr.LAN'ın laboratuvarındayım. Bugün size uzun süreli depolama için hücreleri nasıl donduracağınızı ve bunları sıvı nitrojenden nasıl çözeceğinizi göstereceğim.
İnsan yapışma hücrelerini dondurmak için, onları paketliyormuş gibi plakadan kaldırarak başlarsınız. Kriyo-koruma için büyümenin günlük aşamasında olan hücreleri kullanmanın en iyisi olduğunu unutmayın. Hücreler ayrıldıktan ve serum veya serum içeren ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu durdurduktan sonra, hücre süspansiyonunu steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve iki değirmen ekleyin.
Aynı kaynağın aynı alt kültüründen üç veya daha fazla tabaktan elde edilen serum hücreleri ile komple ortam bir tüpe birleştirilebilir. Santrifüj, oda sıcaklığında 300 ila 350 Gs'de beş dakika süren hücrelerdir. Döndürmeden sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti 10 mil dört santigrat derecede yeniden süspanse edin.
Ortamı tamamlayın, eşit hacimde dört derece donma ortamı ekleyin, hücreleri iyice karıştırın ve ardından tüpü buz sayımı hücrelerinin üzerine yerleştirin. Bir hemo sitometre kullanarak, hücreleri neredeyse birleştirilmiş 25 santimetre karelik bir şişeden dondurmak için mililitrede 1 milyon veya 10 milyon hücrelik bir nihai hücre konsantrasyonu elde etmek için süspansiyonu daha fazla dondurma ortamı ile seyreltin. Resus, yaklaşık üç mil dondurma ortamında süspansiyonu askıya alır, bir mil hücre süspansiyonunu etiketli iki mil kriyo şişesine pipetleyin.
Şişelerin kapaklarını sıktığınızdan emin olun. Şişeleri eksi 80'lik bir dondurucuya bir saat ila bir gece koyun, ardından sıvı nitrojen depolama dondurucusuna aktarın. Süspansiyon kültüründen hücrelerin dondurulması, prensip olarak hücrelerin bir tek tabakadan dondurulmasına benzer.
En büyük fark, süspansiyon kültürlerinin trips olmasına gerek olmamasıdır. Önce inize edilmiş, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 300 ila 350 Gs'de 10 dakika döndürün. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti dört derecede yeniden süspanse edin, ortamı mil başına 1 milyon ila 10 milyon hücre yoğunluğunda dondurun.
Daha sonra bir mil hücre süspansiyonu alikotunu kriyo şişelerine aktarın ve dondurun. Donmuş şişelerin çözülmesi ve geri kazanılması için önceki Bölümde gösterilen tek katmanlı kültürler için yapıldığı gibi. İlk olarak, hücre şişesini sıvı nitrojen dondurucudan çıkarın ve hemen 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin.
Ortam çözülene kadar şişeyi sürekli olarak çalkalayın, bu genellikle 60 saniyeden az sürer. Çözüldükten sonra, açmadan önce şişenin üstünü %70 etanol ile silin. Daha sonra çözülme hücresi süspansiyonunu iki mil ılık tam ortam ve% 20 fetal sığır serum santrifüjü içeren steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
Bu, oda sıcaklığında 150 ila 200 Gs'de 10 dakika. Bu adım, santrifüjlemeden sonra herhangi bir kalıntı DMSO'yu çıkaracak, süpernatanı atacak ve hücre peletini küçük bir miktarda, yaklaşık bir mil tam ortamda nazikçe askıya alacak ve %20 FBS bunu uygun miktarda ortam içeren uygun şekilde etiketlenmiş bir kültür plakasına aktaracaktır. Genel olarak, beş ila 20 mil ortamda bir mil hücre süspansiyonuna ihtiyaç vardır.
Şimdi, hücreleri 24 saat sonra büyümek için 37 santigrat derecede bir inkübatöre koyabilirsiniz. Hücrelerin beş ila yedi gün sonra plakaya bağlandığından emin olmak isteyeceksiniz veya ortamdaki pH göstergesi renk değiştirdiğinde, ortamı değiştirmek isteyeceksiniz. Hücre hattı yeniden kurulana kadar kültürleri %20 FBS içeren bir ortamda tutmak isteyeceksiniz.
Geri kazanım oranı son derece düşükse, orijinal kültürün yalnızca bir alt popülasyonu büyüyor olabilir. Mozaik olduğu bilinen hücre dizileriyle çalışırken buna özellikle dikkat edin. Kültürlerin sevk edilmesi gerekiyorsa, bu hem tek katmanlı hem de süspansiyon kültürleri için kolayca yapılabilir.
25 santimetrelik doku kültüründe, şişe hücreleri tek tabakalı bir tabakada neredeyse eş akıcılığa veya süspansiyonda arzu edilen yoğunluğa kadar büyütülür. Tek katmanlı kültürler için, önce ortam çıkarılır ve daha sonra şişe taze ortamla doldurulur. Taşıma sırasında şişelerin ters çevrilmesi durumunda hücrelerin kurumasını önlemek için pulların tamamen ortamla doldurulması önemlidir.
Süspansiyon için, şişelerin doldurulması için kültürler, taze, orta eklenir. Kapak sıkılır ve parfüm kullanılarak yerine sabitlenir. Şişe, dökülmeyi önlemek için tasarlanmış sızdırmaz bir plastik torba veya başka bir sızdırmaz kap içinde kapatılmıştır.
Şişenin hasar görmesi durumunda, birincil kap daha sonra nakliye sırasında aşırı sıcaklıklardan korumak için ikincil yalıtımlı bir kaba yerleştirilir. Paketin dışına bir alıcı tehlike etiketi yapıştırılmıştır. Genel olarak, kültürler aynı gece veya bir gecede taşınır. Kurye.
Hem yapışık hem de süspansiyon hücreleri için insan hücre kültürlerinin nasıl dondurulacağını ve çözüleceğini size gösterdik. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve tüm deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu video, kültürlenmiş memeli hücrelerinin dondurulması ve depolanması için temel teknikleri ve ayrıca dondurulmuş stoklardan kurtarılmayı gösterir. Doğru hücre depolaması, hücre hatlarının gelecekteki araştırmalar için korunması için çok önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Hücre Kültür Teknikleri
- Hücre Korunması
Arka Plan
- Kültürlenmiş memeli hücreleri araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Hücreleri dondurmak, yaşlanmayı ve kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
- Hücre hatlarının uzun süreli depolanması gelecekteki deneyler için şarttır.
- Dondurulmuş hücreleri canlandırmak için buz çözme teknikleri gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Hücreleri uzun süreli depolama için dondurma sürecini göstermek.
- Dondurulmuş hücreleri sonraki büyüme için nasıl çözeceğinizi açıklamak.
- Hücre kültürleriyle çalışan araştırmacılara pratik beceriler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Monokatman ve süspansiyon şeklinde büyütülen hücrelerin dondurulması.
- Uzun süreli depolama için sıvı nitrojenin kullanılması.
- Dondurulmuş hücrelerin kurtarılması için buz çözme prosedürleri.
- Tekniklerin laboratuvar ortamında gösterimi.
Ana Sonuçlar
- Memeli hücrelerinin başarılı bir şekilde dondurulması ve depolanması.
- Etkili buz çözme tekniklerinin gösterimi.
- Buz çözme sonrası hücre canlılığının korunması.
- Hücre depolamada yaygın tuzaklardan kaçınmaya yönelik rehberlik.
Sonuçlar
- Dondurma ve buz çözme teknikleri hücre kültür çalışmaları için kritiktir.
- Doğru yöntemler, hücre hatlarının ömrünü uzatabilir.
- Bu beceriler hücre biyolojisi araştırmacıları için temeldir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable cell preservation and recovery are foundational for maintaining consistent preclinical models and ensuring reproducibility in target validation and assay development workflows. Proper cryopreservation minimizes genetic drift and contamination risks, supporting long-term cell line integrity for translational research. These techniques enable scalable, standardized cell sourcing across discovery and preclinical stages, reducing variability in mechanistic studies and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables preservation of genetically stable cell lines for consistent target engagement and pathway analysis.
- Operational Value: Reduces need for frequent subculturing, minimizing phenotypic drift and experimental variability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides renewable, low-passage cell stocks for reproducible high-throughput screening and assay qualification.
- Operational Value: Supports batch-to-batch consistency in cell-based assays, improving data reliability across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Ensures continuity of disease-relevant cell models from discovery through preclinical validation.
- Operational Value: Facilitates standardized cell distribution across teams and sites, supporting cross-functional collaboration.
Pipeline & Workflow Integration
Cell cryopreservation integrates into the discovery continuum by enabling reliable cell sourcing for target validation, assay development, and preclinical testing, ensuring model consistency across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing stable, well-characterized cell lines for target validation and pathway elucidation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, contamination-free cell stocks suitable for reproducible compound screening.
- Analytics: Generates quantifiable, consistent cellular inputs that improve confidence in dose-response and viability readouts.
- Translational Research: Maintains model fidelity from early discovery to preclinical studies, reducing biological risk in lead advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, centralized cell banking capability that standardizes cell sourcing across projects and geographies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by minimizing genetic drift and ensuring phenotypic consistency in cell-based assays.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through standardized freezing, thawing, and packaging protocols.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by ensuring reliable preclinical models and consistent biological outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted decision-making by providing dependable cell systems for target validation and lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and cryoprotectant handling to maintain cell viability.
- Dependent on access to controlled-rate freezing equipment and liquid nitrogen storage infrastructure.
- Necessitates standardized operating procedures across teams to ensure consistent cell recovery rates.
- Requires adaptation of freezing media and cell density based on cell type and growth characteristics.
- Limited by cell line sensitivity to cryoprotectants and freeze-thaw stress, which may affect recovery efficiency.
