Donma Çözülme ve Ulaştırma Ambalaj Hücreler

Hücre kültürleri, çok çeşitli araştırma ve tanı uygulamalarında kullanılmaktadır. Hücreleri korumak, yaşlanmayı önlemek, kontaminasyon riskini azaltmak ve genetik sürüklenme etkilerini en aza indirmek amacıyla hücre hatlarının gelecekteki çalışmalar için saklanması bazen tercih edilir. Hücre hatları, uzun süreli saklama için dondurulabilir.

Bu videoda, hem monokatman hem de süspansiyon halinde büyütülen hücrelerin nasıl dondurulacağını ve yeniden büyütülmeleri için nasıl çözüleceğini gösteriyoruz. Merhaba, ben Ricky; Doğu Tennessee'deki Moleküler Patoloji Laboratuvarları Ağının Dr. LAN laboratuvarındayım. Bugün size hücrelerin uzun süreli saklama için nasıl dondurulacağını ve sıvı azottan nasıl çözüleceğini göstereceğim.

İnsan adherent hücrelerini dondurmak için, öncelikle onları paketleyecekmiş gibi plakadan ayırarak başlarsınız. Kriyoprezervasyon için büyüme aşamasının log fazında olan hücrelerin kullanılmasının en iyisi olduğunu unutmayın. Hücreler ayrıldıktan ve serum veya serum içeren besiyeri ekleyerek tripsin reaksiyonunu durdurduktan sonra, hücre süspansiyonunu steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve iki mililitre ekleyin.

Aynı kaynaktan gelen aynı alt kültürün üç veya daha fazla kabındaki serumlu hücreli tamamlayıcı besiyeri tek bir tüpte birleştirilebilir. Hücreleri oda sıcaklığında, 300 ila 350 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 10 ml 4 °C sıcaklıktaki çözeltide yeniden süspande edin.

Tam besiyerine, eşit hacimde dört derece dondurma besiyeri ekleyin, hücreleri iyice karıştırın ve ardından tüpü buza yerleştirip hücreleri sayın. Yaklaşık konfluente ulaşmış 25 cm²'lik bir flasktan hücreleri dondurmak için, bir hemositometre kullanarak süspansiyonu, mililitre başına nihai hücre konsantrasyonu 1 milyon veya 10 milyon hücre olacak şekilde daha fazla dondurma besiyeri ile seyreltin. Yaklaşık 3 mL dondurma besiyeri içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonundan 1 mL'lik alikotları etiketli 2 mL'lik kriyoviyallere pipetleyin.

Flakonların kapaklarının sıkıca kapatıldığından emin olun. Flakonları bir saat ile bir gece boyunca -80 °C dondurucuda bekletin, ardından sıvı nitrojen depolama dondurucusuna aktarın. Süspansiyon kültüründen hücre dondurma işlemi, prensip olarak monokatman hücre dondurma işlemiyle benzerdir.

Temel fark, süspansiyon kültürlerinin öncelikle tripsinize edilmesine gerek olmamasıdır. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 300 ila 350 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı uzaklaştırın ve peleti, mL başına 1 milyon ila 10 milyon hücre yoğunluğunda, dört derecelik dondurma mediumunda yeniden süspanse edin.

Ardından, hücre süspansiyonundan birer mil'lik alikotları kriyoviyallere aktarın ve dondurun. Monolayer kültürler için yapıldığı gibi, dondurulmuş viyalleri çözmek ve geri kazanmak için önceki Bölüm'de gösterildiği şekilde; öncelikle, hücrelerin bulunduğu viyali sıvı azot dondurucusundan çıkarın ve hemen 37 derece bir su banyosuna yerleştirin.

Besiyeri çözünene kadar flakonu sürekli olarak çalkalayın; bu işlem genellikle 60 saniyeden kısa sürer. Çözündükten sonra, açmadan önce flakonun üst kısmını %70 etanol ile silin. Ardından, çözünmüş hücre süspansiyonunu, iki mL sıcak tamamlayıcı besiyeri ve %20 fetal bovine serum içeren steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleyin.

Bunu oda sıcaklığında 150 ila 200 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu adım, santrifüj sonrası herhangi bir kalıntı DMSO'yu uzaklaştıracaktır; süpernatantı atın ve hücre peletini yaklaşık 1 mL kadar az miktarda komple besiyeri ve %20 FBS içerisinde nazikçe resüspande edin. Bunu, uygun miktarda besiyeri içeren, uygun şekilde etiketlenmiş bir kültür plağına aktarın. Genellikle, 5 ila 20 mL besiyerinde 1 mL hücre süspansiyonu gereklidir.

Şimdi, hücreleri büyümeleri için 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirip 24 saat bekletebilirsiniz. Hücrelerin plakaya tutunduğundan emin olun; beş ila yedi gün sonra veya ortamdaki pH indikatörü renk değiştirdiğinde ortamı yenilemeniz gerekecektir. Hücre hattı yeniden kurulana kadar kültürleri %20 FBS içeren bir ortamda tutmalısınız.

Eğer geri kazanım oranı aşırı düşükse, orijinal kültürün yalnızca bir alt popülasyonu büyüyor olabilir. Özellikle mozaik olduğu bilinen hücre hatlarıyla çalışırken bu duruma dikkat edin. Kültürlerin gönderilmesi gerekiyorsa, bu işlem hem monolayer hem de süspansiyon kültürleri için kolaylıkla gerçekleştirilebilir.

25 santimetrelik doku kültürü balonlarında hücreler, tek tabaka halinde neredeyse konfluen hale gelene kadar veya süspansiyonda istenen yoğunluğa ulaşana kadar büyütülür. Tek tabaka kültürleri için, önce besiyeri uzaklaştırılır ve ardından balon taze besiyeri ile doldurulur. Taşıma sırasında balonların ters dönmesi durumunda hücrelerin kurumasını önlemek için balonun tamamen besiyeri ile doldurulması önemlidir.

Süspansiyon kültürleri için, erleni dolduracak şekilde ortam eklenir. Kapak sıkıca kapatılır ve parafilm kullanılarak sabitlenir. Erlen, sızıntıyı önlemek için tasarlanmış sızdırmaz bir plastik torba veya başka bir sızdırmaz kap içerisinde mühürlenir.

Balonun hasar görmesi durumunda, ana kap, taşıma sırasında aşırı sıcaklıklardan korumak amacıyla ikincil bir yalıtımlı kaba yerleştirilir. Paketin dışına bir biyotehlike etiketi yapıştırılır. Kültürler genellikle aynı gece veya ertesi gün teslim edilen kuryelerle taşınır.

Hem adherent hem de süspansiyon hücreler için insan hücre kültürlerinin nasıl dondurulacağını ve çözüleceğini göstermiş olduk. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, tüm deneylerinizde başarılar dileriz.