Jeller içinde Proteinler Boyama

Proteinlerin Elektroforetik Ayrımı başlıklı önceki videomuzda, karmaşık bir protein karışımının jel elektroforezi kullanılarak nasıl ayrılabileceğini göstermiştik. Bu videoda, proteinlerin jel üzerindeki konumlarını görüntülemek için kullanılan dört farklı jel boyama yöntemini göstereceğiz. Merhaba, ben KEG Graduate Institute'daki Proteomik Merkezi ile birlikte çalışan UVP'den Sean Gallagher.

Bugün size, elektroforez ile ayrıştırma sonrası proteinleri görselleştirmek için kullanılan bir dizi tekniği göstereceğim. Bunlar arasında Coomassie blue, gümüş boyama, cyro orange ve cyro ruby yer almaktadır. Öyleyse ilk olarak Coomassie blue ile başlayalım.

Bir jeldeki protein bantlarının Coomassie blue boyama ile saptanması, bir boyanın non-spesifik bağlanmasına dayanır. Bu durumda Coomassie brilliant blue G-250 kullanılır. Bu yöntemde, poliakrilamid jelde ayrılan proteinler yüksek saflıktaki su kullanılarak yıkanır.

Proteinlerin konumu daha sonra su bazlı kamasi blue boyama ile tespit edilir. Tespit sınırı protein bandı başına 0.3 ile bir µg arasındadır. Başlamak için, proteinlerin elektroforez ile ayrıştırıldığı bir poliakrilamid jel ile başlayın.

Yavaşça karıştırırken poliakrilamid jeli 300 mililitre yüksek saflıktaki su ile doldurulmuş plastik bir kaba yerleştirin. Beş dakika bekletin. Suyu dökün ve üçüncü yıkamadan sonra işlemi iki kez daha tekrarlayın.

Suyu dökün ve jeli, yavaşça çalkalayarak bir saat boyunca Coomassie blue boyama çözeltisi ile kaplayın; bir saatlik boyamanın ardından boyama çözeltisini dökün. Jeli, yaklaşık 200 mililitre suyun içine 30 dakika boyunca yerleştirerek kısaca durulayın. Bu aşamada jel, gelecekteki görüntüleme işlemleri için su içinde saklanabilir.

Kalıcı bir jel kaydı tutmak için jel bu aşamada kurutulabilir. Bunun için jeli iki adet 3 mm'lik Whatman filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve üzerini streç filmle kapatın. Ardından, yaklaşık 80 °C sıcaklıkta, standart bir jel kurutucuda bir ila iki saat boyunca kurutun.

Bir diğer protein boyama yöntemi ise bir sonraki aşamada göstereceğimiz gümüş boyamadır. Coomassie blue boyama yöntemi daha kolay ve daha hızlı olsa da, gümüş boyama 0,3 nanogram BSA'lık saptama sınırı ile oldukça daha hassastır. Gümüş boyama ile jeldeki protein bantlarının saptanması, gümüşün proteindeki çeşitli kimyasal gruplara bağlanmasına bağlıdır.

Aşağıdaki protokol, Invitrogen'ın Silver Quest gümüş boyama kitine dayanmaktadır. Protokol, yaklaşık 30 dakika süren hızlı boyama protokolünden türetilmiştir ve kütle spektrometrisi ile uyumlu olan, gümüş boyama için kullanılan birçok kit tabanlı kimyasal yöntemden birini temsil etmektedir. Bu çalışmada, gümüş boyamaya başlamadan önce bir Invitrogen hazır döküm mini jel kullanacağız.

Parmak izi kontaminasyonunu önlemek için her zaman eldiven taktığınızdan emin olun. Jeli, 100 milliliters ayıracı saflıkta su içeren mikrodalgaya uygun bir tepsiye yerleştirin. Kısa bir süre durulayın ve ardından suyu dökün.

Ardından, %40 etanol ve yüksek saflıktaki su içinde %10 asetik asitten oluşan 100 mililitre tespit çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca mikrodalgada ısıtın. Mikrodalga işlemi, bağlanmayı ve boyanmayı hızlandırarak gerekli inkübasyon basamaklarını kısaltır. Bu aşamada, jeli bir çalkalayıcıya yerleştirin ve beş dakika boyunca yavaşça sallayın.

Beş dakika sonra tespit ediciyi dökün, jeli yıkamak için 100 mililitre %30 etanol ekleyip 30 saniye boyunca mikrodalgada ısıtın ve ardından jeli beş dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirin. Beş dakika sonra etanolü dökün. Şimdi 100 mililitre duyarlaştırıcı reaktif ekleyip 30 saniye boyunca mikrodalgada ısıtın ve ardından iki dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirin.

İki dakika sonra, duyarlaştırıcı reaktifi dökün. 100 mililitre reaktif saflığında su ekleyip 30 saniye mikrodalgada ısıtın ve iki dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirin. Suyu dökün ve toplam iki yıkama döngüsü olacak şekilde işlemi tekrarlayın.

Şimdi 100 milliliters boyama çözeltisi ekleyin, 30 saniye boyunca mikrodalgada ısıtın ve beş dakika boyunca yavaşça ajite edin. Beş dakikanın sonunda boyama çözeltisini dökün. 100 milliliters reaktif saflığında su ekleyin, mikrodalga adımını atlayın ve doğrudan 20 ila 60 saniye boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Suyu dökün ve hemen 100 mililitre geliştirme çözeltisi ekleyip protein bantları görünür hale gelene kadar geliştirme işlemini sürdürün. Arka plan temiz kaldığı sürece bu işlem yaklaşık beş ila 10 dakika sürecektir. En iyi sonuçlar için, geliştirme işlemini durdurmak amacıyla bu aşamada geliştiriciye 10 mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Renk yoğunluğunda hafif değişiklikler meydana gelebileceği ve spesifik olmayan arka plan unsurları artabileceği için jelin fotoğrafını mümkün olan en kısa sürede çekin. Zamanla, gördüğünüz jel kalıntı proteinler içerir. Elektroblotlama işleminden sonra, kalıcı bir kayıt tutmak için jeli kurutun veya kapatılabilir plastik bir torbada saklayın. Ardından, jellerin floresan ile boyanması için bir yöntem gösteriyoruz.

Floresan boyalar, geleneksel protein boyamalarına kıyasla birçok avantaja sahiptir. Burada açıklayacağımız Cipro orange protein jel boyaları, bant başına bir ila iki nanogram proteini tespit edebilmektedir. Bu yöntem, Coomassie brilliant blue boyamasından daha hassastır ve birçok gümüş boyama tekniği kadar hassasiyet gösterir.

Floresan boyama, tipik gümüş boyama protokollerine göre daha az manuel işlem gerektiren, basit bir yöntemdir ve bir saatten kısa sürede tamamlanır. Boyanan proteinler, standart bir 300 nanometre UV translüminatör veya bir lazer tarayıcı kullanılarak görselleştirilebilir. Bu uygulamada, SDS-PAGE ile proteinleri hazırlamaya ve ayırmaya başlamak için yeniden bir Invitrogen hazır döküm mini jel kullanacağız.

Ancak, arka plan floresansını azaltmak için yürütme tamponunda olağan 0.1%SDS yerine 0.05%SDS kullanın. Boyama prosedürüne başlamak için, cipro orange floresan boyama çözeltisini bir veya iki standart boyutlu mini jel için uygun küçük bir plastik kaba boşaltın. Yaklaşık 50 milliliters boyama çözeltisi kullanın.

Boyama kaplarının kullanım öncesinde iyice temizlenmesi ve durulanması gerektiğini belirtmek önemlidir, çünkü herhangi bir deterjan kalıntısı boyama işlemini etkileyecektir. Şimdi, jeli boyama çözeltisinin içine yerleştirin. Boyayı parlak ışıktan korumak için kabın üzerini alüminyum folyo ile kapatın.

Jeli oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Boyama solüsyonunu dökün ve ardından jel yüzeyindeki fazla boyayı uzaklaştırmak için jeli bir dakikadan kısa bir süre boyunca yaklaşık 100 mililitre %7.5 asetik asit ile durulayın; protein bantlarını görüntülemek ve fotoğraflamak için jeli %0.1 tween 20 içinde gece boyunca inkübe ederek bekletin. Floresan işaretli jeli doğrudan standart bir 300 nanometre transilüminatöre veya mavi ışık transilüminatörüne yerleştirin.

Ardından, Cipro ruby floresan boya kullanılan alternatif bir floresan boyama yöntemini göstereceğiz. Cipro ruby boyama yöntemi özellikle iki boyutlu jel elektroforezde kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ancak standart tek boyutlu SDS-PAGE için en hassas protein jel boyası olduğu kanıtlanmıştır. Başlamak için jeli, uygun boyuttaki temiz bir polipropilen veya PVC kaba aktarın.

Jeli, orbital bir çalkalayıcıda 50 RPM'de sürekli ve hafif ajitasyonla, uygun miktarda seyreltilmemiş cipro ruby protein jel boyasında inkübe edin. Jelin üzerini kapatın ve en az üç saat boyunca inkübasyona bırakın. Jeli temiz bir boyama kabına aktarın ve %10 metanol, %7 asetik asit çözeltisi ile bir kez yıkayın; ardından jeli geri alarak 30 dakika boyunca tekrar sallar platforma (rocker) yerleştirin.

Arka plan floresanını azaltmak ve hassasiyeti artırmak için jel artık görüntülenmeye ve fotoğraflanmaya hazırdır. Bugünkü protokolleri izlediğiniz için teşekkür ederim. Size, elektroforez sonrası proteinleri görselleştirmek için bir dizi farklı prosedür gösterdik.

Bazıları, floresan boyama ve gümüş boyama gibi oldukça hassasken, bazıları kamasi mavi boyama gibi rutin işlemlerdir. Reaktif saflığının kritik olduğunu unutmamak önemlidir. Ultra saf su kullanılması ve ayrıca her bir adımın zamanlaması da oldukça önemlidir.

Yine üretilebilir sonuçlar elde edebilmek için buna çok dikkat etmeniz gerekir. Hepsi bu kadar, bir sonraki deney setinizde başarılar dileriz.