Jeller içinde Proteinler Boyama

Proteinlerin Elektroforetik Ayrılması başlıklı önceki bir videoda, karmaşık bir protein karışımının jel elektroforezi kullanılarak nasıl ayrılabileceğini gösterdik. Bu videoda, proteinlerin jel içindeki yerini görselleştirmek için size dört farklı jel boyama yöntemi göstereceğiz. Merhaba, ben UVP'den Sean Gallagher, KEG Graduate Institute'daki Proteomik Merkezi'nde çalışıyorum.

Bugün size elektroforez ile ayrıldıktan sonra proteinleri görselleştirmek için bir dizi teknik göstereceğim. Buna Kamasi mavisi gümüş boyama, cyro turuncu ve cyro yakut dahildir. Öyleyse Önce Kamasi mavisi ile başlayalım.

Kamasi mavisi boyama ile bir jeldeki protein yasaklarının tespiti, bir boyanın spesifik olmayan bağlanmasına bağlıdır. Bu durumda, Kamasi parlak mavi G iki 50. Bu yöntemde, bir poli akrilamid jel içinde ayrılan proteinler, yüksek saflıkta su kullanılarak yıkanır.

Proteinlerin yeri daha sonra su bazlı bir kamasi mavisi boyası kullanılarak tespit edilir. Tespit limiti, protein bandı başına 0.3 ila bir mikrogramdır. Başlamak için, proteinlerin elektroforez ile ayrıldığı bir poli akrilamid jel ile başlayın.

Çalkalarken, poli akrilamid jeli yavaşça 300 mililitre yüksek saflıkta su ile doldurulmuş plastik bir kaba koyun. Beş dakika bekletin. Üçüncü yıkamadan sonra atın ve iki kez daha tekrarlayın.

Suyu dökün ve jeli bir saat boyunca Kamasi mavisi boyama solüsyonu ile kaplayın, bir saatlik boyamadan sonra yavaşça çalkalayın, boyama solüsyonunu dökün. 30 dakika boyunca yaklaşık 200 mililitre suya koyarak jeli kısa bir süre durulayın. Bu noktada, jel gelecekteki görüntüleme için suda saklanabilir.

Kalıcı bir jel kaydı tutmak için jel bu aşamada da kurutulabilir. Bunu yapmak için, jeli iki yaprak Watman üç mm filtre kağıdına yerleştirin ve üstünü plastik sargı ile örtün. Daha sonra geleneksel bir jel kurutucuda yaklaşık 80 santigrat derecede bir ila iki saat kurutun.

Başka bir protein boyama yöntemi, daha sonra göstereceğimiz gümüş boyamadır. Kamasi mavisi boyama yöntemi daha kolay ve daha hızlı olmasına rağmen, gümüş boyama 0.3 nanogram BSA'lık bir tespit limiti ile önemli ölçüde daha hassastır. Gümüş boyama ile bir jel içindeki protein bantlarının tespiti, gümüşün proteindeki çeşitli kimyasal gruplara bağlanmasına bağlıdır.

Aşağıdaki protokol, Vitrogen'deki Silver Quest gümüş boyama kitine dayanmaktadır. Protokol, yaklaşık 30 dakikalık hızlı boyama protokolünden türetilmiştir ve kütle spektrometresi ile uyumlu gümüş boyama için kullanılan birçok kit bazlı kimyadan birini temsil eder. Bu durumda, gümüş boyamaya başlamadan önce in vitrojen prekast mini jel kullanacağız.

Parmak izi kontaminasyonunu önlemek için her zaman eldiven giydiğinizden emin olun. Jeli 100 mililitre reaktif sınıfı su ile mikrodalgaya dayanıklı bir tepsiye yerleştirin. Kısa bir süre durulayın ve ardından suyu dökün.

Daha sonra, yüksek saflıkta su ve mikrodalgada 30 saniye boyunca% 40 etanol,% 10 asetik asitten oluşan 100 mililitre fiksatif ekleyin. Mikrodalga işlemi, bağlanma ve lekelenmeyi hızlandırarak gerekli inkübasyon adımlarını kısaltır. Bu noktada, jeli bir çalkalayıcıya yerleştirin ve beş dakika boyunca yavaşça sallayın.

Beş dakika sonra, sabitleyiciyi dökün, jel mikrodalgayı 30 saniye yıkamak için 100 mililitre,% 30 etanol ekleyin ve ardından jeli beş dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Beş dakika sonra etanolü boşaltın. Şimdi 30 saniye boyunca 100 mililitre hassaslaştırıcı reaktif mikrodalga ekleyin ve ardından iki dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

İki dakika sonra hassaslaştırıcı reaktifi boşaltın. 30 saniye boyunca 100 mililitre reaktif dereceli su mikrodalgasına ekleyin ve iki dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Dökün ve toplam iki yıkama döngüsü boyunca tekrarlayın.

Şimdi 100 mililitre boyama solüsyonu ekleyin, 30 saniye mikrodalgada pişirin ve beş dakika yavaşça çalkalayın. Beş dakika sonra boyama solüsyonunu dökün. 100 mililitre reaktif sınıfı su ekleyin, mikrodalgayı atlayın, adım atın ve 20 ila 60 saniye boyunca doğrudan bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Suyu atın ve hemen 100 mililitre gelişmekte olan çözeltiyi ekleyin ve protein bantları görünür hale gelene kadar geliştirin. Arka plan temiz kaldığında, bu işlem yaklaşık beş ila 10 dakika sürecektir. Bu noktada, en iyi sonuçları elde etmek için geliştirmeyi durdurmak için geliştiriciye 10 mililitre durdurucu solüsyon ekleyin.

Renk yoğunluğunda küçük değişiklikler ve spesifik olmayan arka plan öğelerinde artışlar olabileceğinden, jeli mümkün olan en kısa sürede fotoğraflayın. Zamanla, gördüğünüz jel artık proteinler içerir Elektro lekelemeden sonra, kalıcı bir kayıt tutmak için jeli kurutun veya sızdırmaz bir plastik torbada saklayın. Daha sonra, floresan boyama jelleri için bir yöntem gösteriyoruz.

Floresan boyaların geleneksel protein lekelerine göre bir takım avantajları vardır. Burada ana hatlarıyla açıklayacağımız Cipro turuncu protein jel lekeleri, bant başına bir ila iki nanogram protein tespit edebilir. Bu, kamasi parlak mavi boyamadan daha hassastır ve birçok gümüş boyama tekniği kadar hassastır.

Floresan boyama, tipik gümüş boyama protokollerinden daha az zamanla basittir ve bir saatten kısa sürede tamamlanır. Lekeli proteinler, standart bir 300 nanometre UV translüminatörü veya bir lazer tarayıcı kullanılarak görselleştirilebilir. Bu durumda, SDS sayfasını kullanarak proteinleri hazırlamaya ve ayırmaya başlamak için yine bir in vitrojen prekast mini jel kullanacağız.

Ancak, arka plan floresansını azaltmak için normal %0,1 SDS yerine çalışan arabellekte %0,05 SDS kullanın. Boyama prosedürüne başlamak için, bir veya iki standart boyutlu mini jel için küçük bir plastik tabağa cipro turuncu floresan boyama solüsyonu dökün. Yaklaşık 50 mililitre boyama solüsyonu kullanın.

Herhangi bir deterjan lekelenmeyi engelleyeceğinden, leke yapan bulaşıkların kullanımdan önce iyice temizlenmesi ve durulanması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Şimdi, jeli boyama solüsyonuna yerleştirin. Boyayı parlak ışıktan korumak için kabı alüminyum folyo ile örtün.

Jeli oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Boyama solüsyonunu atın ve ardından jeli bir dakikadan daha kısa bir süre boyunca% 7.5 asetik asitle, jel yüzeyinden fazla lekeyi çıkarmak için yaklaşık 100 mililitre durulayın, protein bantlarını görselleştirmek ve fotoğraflamak için% 0.1 ile 20 arasında gece boyunca inkübe ederek jeli alıkoyun. Floresan etiketli jeli doğrudan standart bir 300 nanometre translüminatörün veya mavi ışık translüminatörünün üzerine yerleştirin.

Daha sonra, Cipro yakut floresan boyası kullanan alternatif bir floresan boyama yöntemi göstereceğiz. Cipro yakut boyama yöntemi, özellikle iki boyutlu sayfada kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ancak standart tek boyutlu SDS sayfası için en hassas protein jel boyası olduğu kanıtlanmıştır. Başlamak için jeli uygun boyutta temiz bir polipropilen veya PVC kaba aktarın.

Jeli, 50 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sürekli hafif çalkalama ile uygun miktarda seyreltilmemiş yakut proteini jel boyasında inkübe edin. Jeli örtün ve en az üç saat inkübe edin. Jeli temiz bir boyama kabına aktarın ve %10 metanol, %7 asetik asit solüsyonunda bir kez yıkayın, geri kazanın ve jeli 30 dakika boyunca külbütöre geri koyun.

Arka plan floresansını azaltmak ve hassasiyeti artırmak için jel artık görüntülenmeye ve fotoğraflanmaya hazırdır. Bugünkü protokolleri izlediğiniz için teşekkür etmek istiyorum. Elektroforezden sonra proteinleri görselleştirmek için size bir dizi farklı prosedür gösterdik.

Floresan boyama ve gümüş boyama gibi bazıları çok hassastır ve bazıları kamasi mavisi boyama gibi rutindir. Reaktif saflığının kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Ultra saf su kullanmak da çok önemlidir ve ayrıca adımların her birinin zamanlaması da çok önemlidir.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için buna da çok dikkat etmeniz gerekir. İşte bu ve bir sonraki deney setinizde iyi şanslar.