Name: Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Keşfedin fare kemik iliği öncü hücrelerinden miyeloid dendritik hücreleri farklılaştırma yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve aşı geliştirme çalışmalarında hücre morfolojisi ve fenotip analizi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JB, Fen Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) studentships tarafından desteklenmektedir. Bu proje için Destek Hibe MOP-67.066, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.

Bu protokol, Lutz ve ark adapte edilmiştir. 1 Hasat ve kemik iliği işleme <ol><li> Tibia ve femur İzolasyon: donör fare Euthanize ve% 70 etanol ile bacaklarda sprey. Künt forseps ile ilk ayak bileği sıkıca kavrayın ve tibia maruz deri ve altta yatan kas kesip başlar. Kemik hasar görmesini önlemek için, tibia, diz eklem sağlam bırakarak yavaş yavaş ve paralel kesmek. Femur temizlemek için, künt forseps tutarak diz eklemi hareketsiz. Kas uzak, keskin bir makas ve kavisli bir forseps bir çift ile temizleyin. Kalça ekleminin maruz kaldığı ve femur başı ve kalça eklemi arasındaki makas konabilir kadar yukarı doğru devam edin. Fosfat içine femur ve kalça eklemi ve yer arasındaki kesim tarafından kemikleri çıkarın buz tamponlu salin (PBS). </li><li> Kemik iliği Temizleme: makas ve kavisli bir forseps kullanarak kemiklerden Temizlik kalan kas. Her kemik epifizleri kesiniz ve merkezi boşluğu bulmak. PBS ile yüklü bir 10 ml şırınga ve 25G0.5 &quot;iğne kullanarak, olmayan bir doku kaplı petri, kemik iliği yıkayın. </li><li> Kemik iliği İşleme: (hareket kazıma, yukarı ve aşağı tuşlarını kullanarak), bir tek hücre süspansiyonu haline kemik iliği ayırmak bir 1ml şırınga pistonu kauçuk sonuna kullanın . Kemik iliği, konik bir şahin tüp içinde toplamak ve rezidüel kemik iliği PBS ile yıkayın. </li></ol> Dendritik hücreler Kültür <ol><li> Bir hemasitometre DC medya ve sayısı DC öncüleri yeniden süspanse hücreleri (Şekil 1). Farklı boyutlarda hücreleri göreceksiniz DC öncüleri en büyük ve en parlak. Ayirt sadece bu hücreleri saymak. Iki femur ve iki tibiaları yabani tip C57BL / 6 fare (eski 6-8 hafta), 25-40 x 10 6 toplam DC öncüleri arasında beklemek gerekir. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Şekil 1 </li><li> 2 x 5 10 DC öncüleri / mL, 40 ng / mL rekombinant fare GM-CSF ile desteklenmiş DC medya yoğunluğu Kültür hücreleri . Levha hücreleri, doku kaplı olmayan polistiren petri tabak. </li></ol> Medya (3 gün) Medya yenilemek için 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze medya toplam hacminin yarısını ekleyin. Bir medya üçüncü (günde 6) ve olgunlaşma değiştirin Medya yenilemek için, medya toplam hacmin üçte biri dikkatlice çıkarın ve kültür 6 gün 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze DC medya ile bu sesi yerine. İsterseniz, dendritik hücreler sitokinler veya toll-benzeri reseptör ligandlar kullanılarak olgunlaşması için teşvik edilebilir. Video, DC&#39;ler 5 ng / ml CpG gecede stimülasyonu ile olgunlaştı. Dendritik hücreler Harvest DC kültür, komple (Şekil 2). Hücreler, süspansiyon ve gevşek plaka yapıştırılır hem de olacaktır. Yapıştırılabilen hücreleri, doku kültürü kazıyıcı ile çanak kazıma ve PBS ile durulama silinebilir. Hücrelerinin toplam sayısı, hafta süren kültür ve farklılaşma dönemi sırasında 5-8 kat artacak, bu nedenle, 1-1,6 x 10 6 hücre / mL hasat bekliyoruz . <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Şekil 2" width="407" height="358" /> Şekil 2 Reaktifler <ol><li> DC medya <ol><li> RPMI-1640 ile desteklenmiş medya: </li><li> % 10 fetal sığır serumu </li><li> 100 IU / ml penisilin </li><li> 100 mg / ml streptomisin </li><li> % 1 L-glutamin </li><li> 0,1% 2-mercaptoethanol </li><li> 1X non-esansiyel amino asitler </li><li> 1x sodyum piruvat </li></ol></li><li> GM-CSF Rekombinant fare <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, katalog no. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DC&#39;ler doğal ve adaptif immün etkileşimlerin çalışmalar için yararlı olur ve bir aşı vektörü olarak istihdam edilebilir. Bu video, in vitro olarak izole etmek ve kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için adımlar göstermiştir. Kültür dönemini takiben, bu hücrelerin mikroskobik hem olarak yapışık genellikle dendritler sahip hücreler, ve yapışmaz yuvarlak hücreler görüntülendi olabilir. DC&#39;lerin antijen ile darbeli antijen sunumu için manipüle veya sitokin üretimi ve sitokinlerin ve / veya toll-benzeri reseptör ligandla...

<table><tbody><tr><td>rekombinant fare GM-CSF</td><td>Reaktif</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri kültür

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritik hücreler (DC) doğal ve adaptif immün mekanizmaları ve enfeksiyona karşı erken yanıt arasındaki etkileşimleri incelemek için sık sık kullanılır. Bu hücreler sunan en güçlü antijen olduğundan, DC&#39;lere giderek antijen-spesifik immün yanıtlarının indüksiyonu çalışma bir aşı vektörü olarak kullanılan ediliyor. Bu video, biz, bir donör fare tibiaları ve femur hasat, kemik iliği işleme ve in vitro DC&#39;ler ayırt prosedürü göstermektedir. Uyarılmasını takiben DC&#39;ler değişim özellikleri: olgun DC&#39;ler antijen sunumu ve etkileşim CD4 + ve CD8 + T hücreleri yeteneğine ise immatür dendritik hücreler, güçlü fagositlerdir. Bu değişiklik, fonksiyonel aktivite uyarılması ile hücre yüzey belirteçleri ve sitokin üretimi karşılık gelir. Birçok ajanlar olgun DC&#39;ler, sitokinler ve toll-benzeri reseptör ligandlar dahil etmek için kullanılabilir. Bu video, CpG ya da sahte tedavi ile bir gecede uyarılmasını takiben, iki eş-uyarıcı moleküller, CD86 ve CD40, sitokin, IL-12 ekspresyonu akım sitometri karşılaştırmalar göstermektedir. Farklılaşma sonra, DC&#39;ler daha bir aşı vektörü olarak kullanılmak üzere manipüle edilebilir ya da in vitro antijen-spesifik immün yanıt oluşturmak için peptid veya proteinleri kullanarak darbeli, ya da rekombinant viral vektörler kullanılarak transduced.

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Miyeloid dendritik hücreler (DC'ler), doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık mekanizmaları arasındaki etkileşimleri ve ...'ya verilen erken yanıtı incelemek için sıklıkla kullanılır.

Benim adım Jeanette Boudreaux ve bugün size kemik iliği öncüllerinden myeloid dendritik hücrelerin kültüre edilmesi adımlarını anlatmak istiyorum. Myeloid DC soyu, doğal ve adaptif bağışıklık etkileşimi çalışmaları için giderek daha fazla önem kazanmakta ve aynı zamanda aşı geliştirme için bir platform olarak kullanımı artmaktadır. Bugün size öncül hücrelerin izole edilmesi, kültüre alınması ve dendritik hücrelere farklılaştırılması adımlarını göstereceğiz.Ardından, hücrelerin olgunlaşma öncesi ve sonrası akış sitometrik analizini size göstereceğim. Toll benzeri reseptör ligandı ile hücreler kültür süresince in vitro ortamda çoğalırlar, bu nedenle sıfırıncı günde ekmiş olduğunuz öncül hücrelere kıyasla toplam hücre sayısında yaklaşık beş ila sekiz katlık bir artış görmeyi bekleyin. Bugün size göstereceğim prosedürler açık bir laboratuvar tezgahında uygulamalı olarak gösterilecektir, ancak steriliteyi korumak için kültürlerinizi biyolojik güvenlik kabini veya laminar akışlı kabin içerisinde yapmanızı öneririm.Başlamak için, PBS ile doldurulmuş 25 gauge iğneli 10 mil bir şırıngaya, bir çift kavisli forsepe, bir çift düz forsepeye, keskin makaslara ve kemikleri kesmek için kullanılabi

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bu videoda, yaygın lenfoid progenitör hücrelerden (CLP'ler) plazmositoid dendritik hücreler (pDC'ler) oluşturmak için bir in vitro test gösterilmektedir. Saflaştırılmış CLP'lerin Fms benzeri tirozin kinaz-3 ligandı (FL) varlığında γ ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesi üzerine, CLP'ler, varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan yapışmayan pDC'lere farklılaşır.

Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Olgunlaşmamış dendritik hücreler, bağışıklık ve tolerans arasındaki dengeyi düzenlemek için seçici olarak tolerojenik veya olgun dendritik hücrelere farklılaştırılabilir. Bu çalışma, metabolik fenotiplerde farklılık gösteren olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücrelerden (moDC'ler), in vitro tolerojenik ve olgun moDC'lerden üretmek için bir araç sunmaktadır.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Keşfedin fare kemik iliği öncü hücrelerinden miyeloid dendritik hücreleri farklılaştırma yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve aşı geliştirme çalışmalarında hücre morfolojisi ve fenotip analizi için kullanılır.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Daha fazla video keşfet