Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Bugün size patch clamp kayıtları için kaplan semenderinden retinal kesitlerin nasıl hazırlanacağını göstereceğim. İlk olarak, iki tür mikroskop lamı hazırlayacağım. Sıvı odacıkları olarak kullanabilmek için üzerlerine yapışkanlı bir kuyu eklenmiş lamlar kullanıyoruz.

İlk lamın üzerine, vakum gresiyle iki paralel şerit oluşturuyorum. Ardından biraz filtre kağıdı alıp bunları dikdörtgen parçalar halinde kesiyorum. Şimdi bu parçalardan birini gres raylarının üzerine yerleştiriyor ve lama iyice yapıştığından emin olmak için aşağıya doğru bastırıyorum.

Aynı işlemi diğer parça için de yapıyorum. İkinci tür slaytlara küçük kauçuk bloklar yapıştırılmıştır. Şimdilik, blokların arasına biraz vakum gresi ekliyorum; ayrıca doku dilimleyiciye yeni bir jilet parçası yerleştiriyorum.

Son olarak, diseksiyon sırasında ihtiyacım olacak olan iki çift pens, bir adet makas ve ışıkla uyarılan akımları kaydetmek için gözü kafadan çıkarmaya yarayan aletleri hazırlıyorum. Diseksiyon IR ışığı altında gerçekleştirilmelidir, ancak gösterim amaçlı olarak şu an ışık altında çalışacağım. İlk olarak gözü çıkarıp, buz gibi soğuk ringer solüsyonu ile nemlendirdiğim bir parça peçete üzerine, mikroskop altında yerleştiriyorum.

Ardından, göze zarar vermeyeceğinden emin olmak için göz küresindeki fazla bağ dokusunu temizlerim. Her zaman yüzey boyunca kesim yaparım. Mikroskop altında gördüğünüz şey budur.

Sırada, korneada küçük bir yarık açmak için bir jilet kullanıyorum. Bunu yapmak için, jiletin kenarını korneaya doğru bastırırken gözü pensle sabit tutuyorum. Ardından, lensi çıkarmak için makasla lensi alırken korneayı pensle tutuyorum.

Pensle lense kolayca erişebilmek için göz çukurunun kenarlarına biraz baskı uyguluyorum. Ardından irisi çıkarıyorum. Sadece göz çukuru kalana kadar aura serato boyunca kesim yaparken irisi pensle tutuyorum.

Ardından, I kubbesini iki dikdörtgen parçaya ayırırım. Önce ortadan ikiye bölerim ve ardından üst ile alt kenarları düzeltirim. Şimdi, daha önce hazırladığım lamlardan birini alırım, bir I kubbesi parçasını kaldırır ve retina tarafı aşağı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştiririm.

Ardından, lam üzerinde yalnızca retina kalacak şekilde bu sklerayı yukarı çekerim. Bundan sonra, solüsyonu hızlıca hazneye eklerim. İşlemi ikinci retina parçası için tekrarlayalım.

Ancak bu sefer, retinayı filtre kağıdının üzerine yerleştirirken mikroskop altından izleyebilirsiniz. Sklera üzerine dikkatlice bastırmak için sol elimdeki penseti kullanıyorum. Son olarak, retinayı 200 ila 300 mikrometre genişliğinde dilimler halinde kesiyorum.

Ardından, deneylerimde kullanmak üzere bir kesit seçiyorum. Uygun bir kesit belirlemek için, retinanın katmanlarını görebilmek amacıyla kesitleri 90 derece döndürmem gerekiyor. Hasar görmemiş görünen ve farklı katmanları belirten belirgin yatay bantlar gösteren bir kesit seçiyorum.

Lamları birinden diğerine taşımak için bir Ringer köprüsü oluşturuyorum ve ardından lamları dikkatlice solüsyon üzerinden hareket ettiriyorum. Kesiti yerleştirdiğimde, filtre kağıdının cama karşı dikey konumlanması için onu kauçuk bloklara doğru itiyorum. Artık patch clamp kaydı için hazırım.

Hücre içi çözeltiyi, bir günde gerçekte ihtiyaç duyacağımız miktarda çözmek için dondurucuda küçük porsiyonlar halinde saklıyoruz. Elektrotları doldurmadan önce, elektrot ucunu tıkayabilecek küçük partikülleri temizlemek için çözeltiyi filtreliyoruz. Ganglion hücrelerinden kayıt almak için patch elektrotlar borosilikat kapiler camdan çekilmektedir.

Elektrot dirençlerini iki ile dört mega ohm arasında oluşturacak bir ayar seçiyorum. Elektrotları doldururken, elektrot ucunda hava kabarcığı kalmadığından emin olmak istiyorum. Parmağınızla cama hafifçe vurmak, kabarcıkların giderilmesine yardımcı olur.

Bu, kafa aşamasına bağlı olan elektrot tutucudur. Elektro roller, gümüş klorür tel içerir. Bu, niga köprülü toprak elektrodudur.

İşte perfüzyon pipeti. Bu pipet, sekiz kanallı bir mikro perfüzyon sistemine bağlıdır. Ana perfüzyon yerçekimi ile gerçekleşmektedir; bu nedenle sadece wingers ile dolu bir şişe bulunur ve solüsyon bu tüpten geçerek kayıt haznesine akar.

Karanlıkta kayıt yapabilmek için mikroskobun yan portuna, bir TV ekranına bağlı olan bir IR kamera yerleştirdim. Üst porta ise retinaya görsel uyaranlar yansıtmamı sağlayan bir görüntü projektörü bağladım. Ve son olarak, patch clamp amplifikatörü.

Şimdi retinal kesiti mikroskobun altına yerleştiriyorum ve ana perfüzyonu kurmak için banyoya toprak elektrodunu ekliyorum. Ardından, yer çekimi perfüzyon sisteminden gelen tüpü ekleyin. Diğer taraftaki cam tüp, sıvı seviyesini sabit tutan vakum emişine bağlıdır.

Ayrıca, vakum tüpünün elektro-omzağa bağlı olduğundan emin olurum. Ardından, mikroperfüzyon pipetini konumlandırırım. Pipeti, mikroskop objektifi ile birlikte banyonun içine indiririm.

Kesite yaklaştığımda, solüsyonun kesite temas etmesi için onu biraz geri çekerim. Perfüzyonu başlattığımda, burada olduğu gibi kesitin hafifçe hareket ettiğini görmem gerekir. Şimdi kayıt yapılacak uygun bir hücre arayalım.

Kesitin alt kısmında yer alan ganglion hücrelerini arıyoruz. Şimdi, elektrodu banyoya sokmadan önce hazırlıyorum ve biraz pozitif basınç uyguluyorum. Mikroskop altında elektrodu bulduğumda, bir hücreye patch yapmak için onu kesitin hemen üzerine kadar indiriyorum.

40 x objektife geçiş yaptım. Şimdi temel akımı sıfırlıyorum ve elektrot direncini kontrol ediyorum. Sızdırmazlık testi, elektrot ile hücre arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlayıp sağlamadığımı görmeme yardımcı olan 10 milivoltluk bir dizi impulstan oluşur.

Şimdi elektrodumu hedef hücrenin üzerine indiriyorum. Hücre gövdesinde bir çöküntü gördüğümde, tüpteki pozitif basıncı serbest bırakarak sıkı bir sızdırmazlık sağlıyorum. Direnç şu an o kadar yüksek ki akım izi düz görünmektedir.

Küçük sıçramalar elektrottan kaynaklanan kapasitans artefaktlarıdır. Bunlar şu şekilde kompanse edilebilir, böylece artık yoklar. Şimdi hücre içine girmeyi deneyeceğim.

Bunu yapmak için, elektrot omuza bağlı tüpe dikkatlice küçük vakum darbeleri uyguluyorum ve eğer her şey yolunda giderse, akım izinin şu şekilde değiştiğini görürsünüz. Şu an gördüğünüz spike'lar membran kapasitansı ile etkileşime girmiştir ve bunlar için telafi işlemi yapılabilir; şu anki preparat karanlıkta hazırlanmış bir preparattır. Işıkla uyarılan yanıtlar kaydedip kaydedemeyeceğimize bakalım.

Osiloskopta gördüğünüz iz, -60 mV değerinde voltaj klemplenmiş bir ganglion hücresinin akım yanıtıdır. Kullandığımız ışık stimülasyonları, sabit ve tekdüze bir arka plan üzerinde sunulan parlak ve karanlık çubuklardır. Laboratuvarımızın kullandığı yazılım, tek bir denemenin tüm kaydını göstermektedir.

Bunun, karanlık bir çubuğun başlangıcına ve parlak bir çubuğun bitişine yanıt veren bir "kapalı" (off) hücre olduğu görülebilir. Üstteki beyaz çizgi, stimulusun süresini belirtmektedir. Artık farklı farmakolojik ajanların perfüze edildiği deneyler gerçekleştirebiliriz.

Örneğin, GABAerjik ve Gly sinerjik inhibisyonu bloke edebiliriz. Bir dakikadan kısa bir süre bekledikten sonra, genellikle ilacın etkilerini burada görmeye başlayabiliriz. Yanıt daha güçlü ve daha uzun süreli hale geldi.

Retinal kesit hazırlama yöntemi, retinadaki farklı hücrelerden sinaptik akımların kaydedilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır ve elektrot çözeltisine floresan bir boya eklenirse, hücre tipi kolayca doğrulanabilmektedir. Anatomik olarak, burada hayvan modeli olarak larval TGA semenderi kullanılmıştır. Semenderlerin soğukkanlı hayvanlar olması ve büyük retinal hücrelere sahip olması avantajlı kayıt koşulları sağlamaktadır, ancak aynı teknik memeli preparatlarına da uygulanabilir.