Name: Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Öğrenin tiger salamander retinasında tam hücre voltaj kelepçesi kayıtları yapmayı. Bu yöntem görsel uyaranlara sinaptik akımları incelemek için kullanılır ve retinal fizyoloji araştırmalarında güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çözümler <ul><li> Ganglion hücreleri için intrasellüler çözüm (mM): 100 K-glukonat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 Hepes, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mcM Sulforhodamine B (boyama), pH = 7.4 için ayarlanabilir KOH </li><li> Bipolar hücreler (mM) Hücre içi çözüm: 90 K-glukonat, 8 KCl 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 Hepes, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mcM Sulforhodamine B (boyama), pH = 7.4 ayarlanabilir KOH </li><li> Ekstrasellüler Ringer solüsyonu (mM): NaCl 112, 5 Glikoz, 5 Hepes, NaOH ile pH = 7.75 ayarlanabilir 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2,. Çözümün oksijenasyon gerekli değildir. </li></ul> Kayıt odaları hazırlayın Bizim kayıt odası, başka bir yapıştırıcı kesip küçük silikon blokları doku dilimleri için istikrarı sağlamak için yerleştirilir iyi hangi bir yapıştırıcı ile bir mikroskop lamı oluşur. Retina dilimleri Hazırlanması Fotoreseptörlerin beyazlatma önlemek için, diseksiyon, kızılötesi veya loş kırmızı ışık yürütülmektedir. Bir çubuk yolu yanıtları kayıt ilgilenen ise, sadece kızılötesi ışık (IR diseksiyon mikroskobu ve hiçbir oda ışığı Ek IR gözlük mikroskop altında yapmadı işlemleri için kullanılmalıdır) kullanılmalıdır. Ağırlıklı olarak, koni ışık yanıtları, loş kırmızı oda ışık veya kırmızı bir flaş ışığı kayıt ilgilenen kullanılabilir. Ancak, mikroskop, hala IR Okülerin olmalıdır. Fotoreseptör giriş deneme için alakasız ise, prosedürleri düzenli bir mikroskop kullanılarak, normal oda ışığında yürütülen olabilir. <ol><li> , Iyi bir yapıştırıcı, silikon ile iki mikroskop slaytlar hazırlayın: (filtre iterek her slaytta silikon gres iki paralel grup (yaklaşık 0,5 cm arayla) ve dikdörtgen bir parça filtre kağıdı slayt bir tarafta yer, hem de yağ bantları geçiş iyi slayt bağlı olduğu, böylece bir jilet parçası olan kağıt) </li><li> Hayvan sonra dekapite ve çift pithed, 30 dakika boyunca bir buz banyosunda yerleştirilir: kurulan protokolleri göre bir semender Kurban. </li><li> Semender kafa göz çıkarın ve bir parça kağıt mendil diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile ıslatılmış </li><li> Gözün bağ dokusu çıkarın </li><li> Korneada küçük bir kesi yapmak için jilet kullanın. </li><li> Boyunca makasla göz ekini çıkarırken forseps ile kornea kesmek tutun </li><li> Forseps ile lensi çıkarın </li><li> Forseps ile iris tutun ve iris kaldırmak için ora serrata boyunca kesim </li><li> Göz yuvası iki dikdörtgen parçalar halinde Kes </li><li> (Çok dikkatli bir şekilde aşağı iterken parça düzleştirmek için emin olun) adet Pick up ve filtre kağıdı IT sklera yan yerde </li><li> Yavaşça filtresi kağıt bağlı olması gereken, retina kapalı sklerasına kaldırın </li><li> Hızla de buz gibi soğuk Ringer solüsyonu </li><li> Ikinci parça için de tekrarlayın. </li><li> 200-300μm geniş bir dilim kesmek için özel yapılmış dilimleyici yerleştirilen bir jilet kullanın. </li><li> Forseps bir çift kullanın, filtre kağıdı yan dilim almak için, retina katmanları görünür hale gelir, böylece onları ters çevirin ve vakum gres bantlar yer </li><li> Hasarsız görünüyor ve retina katmanları (büyütme yeterince yüksek değildir katmanları tek bazı katmanlama tanıyabilir ancak dilim genellikle yeterince iyi, bazen diseksiyon mikroskop altında görmek zor gösteren yatay bantlar gösteren bir dilim seçin. dik mikroskop altında incelendi) sonra dilim kullanmak konusunda nihai karar, ancak yapılır. Iki slaytlar arasındaki Zil köprü inşa kayıt odası slayt Move it </li><li> Slice (ganglion hücreleri ve fotoreseptör aynı zamanda odak noktası olmalıdır) eğik olmayacak şekilde filtre kağıdı, kauçuk bloklar kayıt odasında karşı itilir emin olun. </li></ol> Kayıt teçhizat doku yerleştirmek <ol><li> Kayıt slayt mikroskop altında yerleştirilir ve gravite perfüzyon syste yoluyla Ringer çözümleri ile perfüze </li><li> Hazırlık 10x ve 40x suya daldırma hedefi ile dik bir mikroskop ile görüntülenmiştir. </li><li> Yine, biz sadece fotoreseptörlerin beyazlatma önlemek için kızılötesi ışık kullanır. IR kamera, mikroskop yan bağlantı noktası, bir TV ekranında bağlı eklenir. </li></ol> Görsel Uyarım Görsel uyaranlara Psychtoolbox kullanarak Matlab programlanmış ve mikroskop mikroskop görüntüsü enjektör (MBF biyobilim) kullanarak üst bağlantı noktası üzerinden retina yansıtılıyor. A Bit + + Dijital Video İşlemci (Cambridge Araştırma Sistemleri) 14bit parlaklık ölçeği elde Senkron için kullanılır.veri toplama ile uyaran sunum onize. Bu video kullanılan görsel uyaranlar, iki saniye boyunca sabit bir üniforma arka plan (sunuldu% 100 kontrast, parlak veya koyu bar (width = 460μm). Parlaklık = 8 * 10 4 fotonlar / mm / s, boyutu: 1.84 x 1.38mm). Elektrofizyoloji <ul><li> Mikropipet çektirmenin: Patch elektrotlar borosilikat cam (1.5mm ID 84mm. OD) çekti. Ganglion hücreleri için, dirençler 2 ve 4 Mohms arasında. Bipolar hücreler için, 4 ve 8 Mohms arasında yüksek dirençleri kullanılır. </li><li> Gerilim Kelepçe kayıtları Multiclamp 700A (Moleküler Cihazlar), amplifikatör ve Labview programlanmış laboratuar dahili yazılımı kullanılarak yapılmaktadır. </li><li> İlaçlar bir 8-kanal perfüzyon sistemi yoluyla perfüze. Microperfusion elektrot dilim (kapalı perfüzyon açmak ve doku gözle görülür bir şekilde hareket etmelidir, ancak bir ihtiyacı basıncı dilim filtre kağıdı kopuk haline gelebilir, böylece çok güçlü olmadığını dikkatli olmak) yakın yerleştirilir. Microperfusion deneyler sırasında sürekli kayıt perfüzyon açılması ve kapatılması rahatsız etmediğini (Uyuşturucu ihtiyaç vardır perfüze kontrol çözümü) açık olmalıdır. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Faydaları: <ol><li> Tüm hücre türlerine erişilebilir </li><li> Kolay hücre tiplerinin tanımlanması, özellikle floresan boya elektrot çözüm ise </li><li> Farmakolojik ajanların hedef hücrelere kolaylıkla ulaşabilirsiniz </li><li> Yama klemp tekniği, retina hesaplamaları farklı iyon kanalları rolünü araştırmak için izin verir. Aynı bilgiler, keskin elektrotlar extracelluar başak kayıtları veya kayıtlar yoluyla elde edilemez. </li><li> Bu teknik diğer hayvan modelleri uygulanabilir </li></ol> Dezavantajları...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Patch Clamp Amplifikatörü</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Dik Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>40x, 10x su daldırma objektifi, floresan filtreler ve cıva lambası ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Mikroskop görüntü enjektörü</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-kanallı perfüzyon sistemi</td><td>Mikroperfüzyon</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Dijital Video İşlemcisi</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi Okülerler</td><td>Diğer</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan silikon kuyucuklar</td><td>Diğer</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>20mm çap, 1.0mm derinlik</td></tr><tr><td>Membran Filtreler</td><td>Filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Kapilerler</td><td>Elektrot camı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtreleri</td><td>Filtre</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mm filtreler, .2um Naylon Membran, Polipropilen gövde</td></tr><tr><td>Kızılötesi (IR) kamera</td><td>Mikroskoba monte edilmiş kamera</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7W video kamerası</td></tr><tr><td>Picrotoksin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Striknin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol-4-asetik asit sodyum tuzu</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larval kaplan semenderleri</td><td>Hayvan</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

işık tam hücreli kayıtlar retina dilim uyarıcı synaptic akımlar uyarılmış

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Biz sinaptik devre retina temelini görsel bilgi işlem çalışma tüm hücre yama klemp tekniği kullanır. Bu video, retina dilim hazırlanmasında tek tek hücrelerin ışık uyarılmış akımları tüm hücre kayıtları gerçekleştirme süreci boyunca size rehberlik edecektir. Biz bir hayvan modeli olarak su kaplan semender kullanın. Biz göz diseksiyonu anlatarak başlamak ve elektrofizyolojik kayıtlar için dilimleri nasıl monte edilir göstermek. Dilim kayıt odasına yerleştirildikten sonra, biz, tüm hücre gerilimi kelepçe kayıtları nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir. Daha sonra ışık uyarılmış akım tepkiler üzerine görsel uyaranlara dilim fotoreseptörlerin proje. 8-kanal perfüzyon sistemi bizi hızla farklı ajanlar arasında geçiş yapmanıza olanak tanır bu sayede kayıt sırasında, farmakolojik ajanların dilim serpmek. Retina dilim hazırlık yaygın bir bütün montaj hazırlanmasında erişilebilir değil amacrine veya bipolar hücreleri, özellikle çalışma retina yama kelepçe kayıtları için kullanılır.

Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Retinadaki görsel bilgi işlemenin temelini oluşturan sinaptik devreleri incelemek için tüm hücre yama kenetleme (whole-cell patch clamp) tekniğini kullanıyoruz. Bu videoda, ...

Bugün size patch clamp kayıtları için kaplan semenderinden retinal kesitlerin nasıl hazırlanacağını göstereceğim. İlk olarak, iki tür mikroskop lamı hazırlayacağım. Sıvı odacıkları olarak kullanabilmek için üzerlerine yapışkanlı bir kuyu eklenmiş lamlar kullanıyoruz.İlk lamın üzerine, vakum gresiyle iki paralel şerit oluşturuyorum. Ardından biraz filtre kağıdı alıp bunları dikdörtgen parçalar halinde kesiyorum. Şimdi bu parçalardan birini gres raylarının üzerine yerleştiriyor ve lama iyice yapıştığından emin olmak için aşağıya doğru bastırıyorum.Aynı işlemi diğer parça için de yapıyorum. İkinci tür slaytlara küçük kauçuk bloklar yapıştırılmıştır. Şimdilik, blokların arasına biraz vakum gresi ekliyorum; ayrıca doku dilimleyiciye yeni bir jilet parçası yerleştiriyorum.Son olarak, diseksiyon sırasında ihtiyacım olacak olan iki çift pens, bir adet makas ve ışıkla uyarılan akımları kaydetmek için gözü kafadan çıkarmaya yarayan aletleri hazırlıyorum. Diseksiyon IR ışığı altında gerçekleştirilmelidir, ancak gösterim amaçlı olarak şu an ışık altında çalışacağım. İlk olarak gözü çıkarıp, buz gibi soğuk ringer solüsyonu ile nemlendirdiğim bir parça peçete üzerine, mikroskop altında yerleştir

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Video, fare beyin dilimlerindeki retinogenikülat ve kortikojenikülat sinapsların elektrofizyolojik kaydını açıklar. Dorsal lateral genikülat çekirdeği (dLGN) içeren dilimler bir kayıt odasına yerleştirilir. Retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) uyarmak ve retinogenikülat sinapsları araştırmak için optik kanal üzerine veya kortikal nöronları uyarmak ve kortikogenikülat sinapsları araştırmak için nükleus reticularis talami'ye uyarıcı bir pipet yerleştirilir. Stimülasyon üzerine, RGC'ler ve...

Fare Beyin Dilimlerinde Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinapsların Elektrofizyolojik Bir Çalışması

Bu video, karanlığa uyarlanmış bir fare retina dokusu dilimi hazırlığında ışıkla uyarılan post-sinaptik yanıtların kaydını göstermektedir. Retina dilimi bir kayıt odasına yerleştirilir ve bir retinal ganglion hücresi ile elektriksel süreklilik sağlamak için bir kayıt pipeti kullanılır. Pipet tarafından kaydedilen ganglion hücrelerinde uyarıcı post-sinaptik potansiyeller oluşturmak için ışık darbeleri uygulanır.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Burada, lateral genikulat çekirdeğini içeren akut beyin dilimleri ve retinogeniculate ve kortikogeniculate sinenler fonksiyonunun elektrofizyolojik incelenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, aynı akut beyin dilimleri içinde yüksek salınımı ve düşük salınımı olasılığı ile sinaps incelemek için etkili bir yol sağlar.

Retinogeniculate ve Kortikogeniculate SYNAPSE fonksiyonunun elektrofizyolojik Incelemeleri

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Öğrenin tiger salamander retinasında tam hücre voltaj kelepçesi kayıtları yapmayı. Bu yöntem görsel uyaranlara sinaptik akımları incelemek için kullanılır ve retinal fizyoloji araştırmalarında güvenilir bir yaklaşım sunar.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Daha fazla video keşfet