Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

Bugün size, patch clamp kayıtları için kaplan semenderinden retinal dilimlerin nasıl hazırlanacağını göstereceğim. İlk olarak, iki çeşit mikroskop lamı hazırlayacağım. Sıvı odaları olarak kullanabilmek için üzerlerinde yapışkan bir kuyu bulunan lamlar kullanıyoruz.

İlk lamın üzerine, vakum gresinden paralel iki şerit sürüyorum. Ardından, biraz filtre kağıdını alıp dikdörtgen parçalar halinde kesiyorum. Şimdi, bu parçalardan birini gres raylarının üzerine yerleştiriyorum ve lam üzerine iyice yapıştığından emin olmak için üzerine bastırıyorum.

Diğer parça için de aynısını yapıyorum. İkinci tür lamların üzerinde yapıştırılmış küçük kauçuk bloklar bulunur. Şimdilik blokların arasına biraz vakum gresi sürüyorum; ayrıca doku dilimleyiciye yeni bir jilet parçası yerleştiriyorum.

Son olarak, diseksiyon sırasında ihtiyaç duyacağım araçları; iki çift pens, bir makas ve ışıkla uyarılmış akımları kaydetmek için gözü kafadan çıkarmaya yarayan bir aleti hazırlıyorum. Diseksiyon IR ışığı altında gerçekleştirilmelidir, ancak gösterim amaçlı olarak şu an ışık altında çalışacağım. İlk olarak gözü çıkarıyorum ve buz gibi soğuk ringer solüsyonu ile nemlendirdiğim bir parça doku kağıdı üzerine, mikroskop altında yerleştiriyorum.

Ardından, göze zarar vermeyeceğinden emin olmak için göz küresindeki fazla bağ dokusunu temizlerim. Kesme işlemini her zaman yüzey boyunca yaparım. Mikroskop altında gördüğünüz görüntü budur.

Ardından, korneada küçük bir kesik oluşturmak için bir jilet kullanırım. Bunu yapmak için, jiletin kenarını korneaya doğru bastırırken forseps ile gözü aşağıda tutarım. Daha sonra, lensi çıkarmak için korneayı forseps ile tutarak makasla uzaklaştırırım.

Pensle lense kolayca erişebilmek için göz çukurunun kenarlarına biraz baskı uyguluyorum. Ardından irisi çıkarıyorum. Sadece göz çukuru kalana kadar aura serato boyunca keserken irisi pensle tutuyorum.

Ardından I kabını iki dikdörtgen parçaya ayırıyorum. Önce ortadan ikiye kesiyorum ve ardından üst ve alt kenarlarını düzeltiyorum. Şimdi daha önce hazırladığım lamlardan birini alıyorum, bir parça I kabını tutup retina tarafı aşağı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştiriyorum.

Ardından, lam üzerinde yalnızca retina kalacak şekilde bu sklera tabakasını yukarı çekerim. Bundan sonra, hazneye hızlıca çözeltimizi eklerim. İşlemi ikinci retina parçası için tekrarlayalım.

Ancak bu kez, retinayı filtre kağıdına yerleştirirken mikroskop altından izleyebilirsiniz. Sklera üzerine dikkatlice bastırmak için sol elimdeki pensi kullanıyorum. Son olarak, retinayı 200 ila 300 mikrometre genişliğinde dilimler halinde kesiyorum.

Ardından, deneylerimde kullanmak üzere bir kesit seçiyorum. Uygun bir kesit seçebilmek için, retinanın katmanlarını görebilmek amacıyla kesitleri 90 derece döndürmem gerekiyor. Hasarsız görünen ve farklı katmanları belirten belirgin yatay bantlar gösteren bir kesit seçiyorum.

Lamları birinden diğerine taşımak için bir ringer köprüsü oluşturuyorum ve ardından lamları çözelti üzerinden dikkatlice hareket ettiriyorum. Kesiti yerleştirdiğimde, filtre kağıdı cama karşı dikey konumlanacak şekilde onu kauçuk bloklara doğru itiyorum. Artık patch clamp kaydı için hazırım.

Hücre içi çözeltiyi, tek bir günde yalnızca gerçekte ihtiyaç duyduğumuz miktarı çözebilmek için dondurucuda küçük porsiyonlar halinde saklıyoruz. Elektrotları doldurmadan önce, elektrot ucunu tıkayabilecek küçük partikülleri temizlemek amacıyla çözeltiyi filtreliyoruz. Ganglion hücrelerinden kayıt yapmak için patch elektrotlar, borosilikat kapiler camdan çekilerek hazırlanır.

İki ile dört megaohm arasında elektrot dirençleri oluşturacak bir ayar seçiyorum. Elektrotları doldururken, elektrot ucunda hava kabarcığı kalmadığından emin olmak istiyorum. Cama parmağınızla hafifçe vurmak, kabarcıkların giderilmesine yardımcı olur.

Bu, kafa aşamasına bağlı elektrot tutucudur. Elektrot silindiri bir gümüş klorür tel içerir. Bu, niga köprüsüne sahip toprak elektrodudur.

İşte perfüzyon pipeti. Bu pipet, sekiz kanallı bir mikro perfüzyon sistemine bağlıdır. Ana perfüzyon yer çekimi ile sağlanır; bu nedenle sistem, sadece Wingers ile doldurulmuş bir şişeden ibarettir ve solüsyon bu tüp aracılığıyla kayıt odasına akar.

Karanlıkta kayıt yapabilmek için mikroskobun yan portuna, bir TV ekranına bağlı olan bir IR kamera yerleştirdim. Üst porta ise retinaya görsel uyaranlar yansıtmamı sağlayan bir görüntü projektörü bağladım. Ve son olarak, patch clamp amplifikatörü.

Şimdi retinal dilimi mikroskobun altına yerleştiriyorum ve ana perfüzyonu kurmak için banyo içerisine toprak elektrodunu ekliyorum. Ardından, gravite perfüzyon sisteminden gelen tüpü ekliyorum. Diğer taraftaki cam tüp, sıvı seviyesini sabit tutan vakum emiş sistemine bağlıdır.

Ayrıca bir vakum tüpünün elektrot omuzuna bağlı olduğundan emin oluyorum. Ardından, mikro perfüzyon pipetini konumlandırıyorum. Pipeti, mikroskop objektifiyle birlikte banyoya indiriyorum.

Kesite yaklaştığımda, solüsyonun kesite çarpması için onu biraz geri çekerim. Perfüzyonu açtığımda, burada olduğu gibi kesitin hafifçe hareket ettiğini görmem gerekir. Şimdi kayıt yapılacak uygun bir hücre arayalım.

Kesitin alt kısmında yer alan ganglion hücrelerini arıyoruz. Şimdi, elektrodu banyoya sokmadan önce hazırlıyorum ve bir miktar pozitif basınç uyguluyorum. Elektrodu mikroskop altında bulduğumda, bir hücreyi patch etmek için elektrodu kesitin hemen üzerine kadar indiriyorum.

40 x objektife geçiş yaptım. Şimdi taban akımını sıfırlıyorum ve elektrot direncini kontrol ediyorum. Sızdırmazlık testi, elektrot ile hücre arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlayıp sağlamadığımı görmeme yardımcı olan 10 milivoltluk pulslardan oluşan bir dizidir.

Şimdi elektrodumu hedef hücrenin üzerine indiriyorum. Hücre gövdesinde hafif bir çöküntü gördüğümde, tüpteki pozitif basıncı bırakarak sıkı bir sızdırmazlık sağlıyorum. Direnç şu an çok yüksek olduğu için akım izi düz görünmektedir.

Küçük sıçramalar, elektrottan kaynaklanan kapasitans artefaktlarıdır. Bunlar bu şekilde kompanse edilebilir, böylece artık giderilmişlerdir. Şimdi hücreye girmeyi deneyeceğim.

Bunu yapmak için, elektrot omuza bağlı tüpe dikkatlice küçük vakum darbeleri uyguluyorum ve her şey yolunda giderse, akım izinin şu şekilde değiştiğini görürsünüz. Şu an gördüğünüz spike'lar membran kapasitansı tarafından etkilenmektedir ve bunlar için kompanzasyon yapılabilir; şu anki preparat karanlıkta hazırlanmış bir preparattır. Bakalım ışıkla uyarılan yanıtları kaydedip kaydedemeyeceğiz.

Osiloskopta gördüğünüz iz, -60 milivolt seviyesinde voltaj klemplenmiş bir ganglion hücresinin akım yanıtıdır. Kullandığımız ışık uyaranları, sabit ve tekdüze bir arka plan üzerinde sunulan parlak ve karanlık çubuklardır. Laboratuvarımızın kullandığı yazılım, tek bir denemenin tüm kaydını göstermektedir.

Bunun, karanlık bir çubuğun başlangıcına ve parlak bir çubuğun bitişine yanıt veren bir "off" hücresi olduğu görülebilir. Üstteki beyaz çizgi, uyarının süresini göstermektedir. Artık farklı farmakolojik ajanların perfüze edildiği deneyler gerçekleştirebiliriz.

Örneğin, GABAerjik ve Gly sinerjik inhibisyonu bloke edebiliriz. Bir dakikadan kısa bir süre bekledikten sonra, genellikle ilacın etkilerini burada görmeye başlayabiliriz. Yanıt daha güçlü ve daha uzun süreli hale geldi.

Retinal kesit hazırlama yöntemi, retinadaki farklı hücrelerden sinaptik akımların kaydedilmesi için yaygın olarak kullanılmıştır ve elektrot çözeltisine floresan bir boya eklenirse, hücre tipi kolayca doğrulanabilir. Anatomik olarak, burada hayvan modeli olarak larval TGA semenderi kullanılmıştır. Semenderlerin soğukkanlı hayvanlar olması ve büyük retinal hücrelere sahip olması avantajlı kayıt koşulları sağlar, ancak aynı teknik memeli preparatlarına da uygulanabilir.