İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Merhaba, ben California Üniversitesi Riverside Biyokimya Bölümü'nde Dr. Frank Zawa'nın laboratuvarından Stefan Burani. Bugün size kromatin immünopresipitasyon prosedürünü göstereceğiz. Haydi başlayalım.

Bu prosedür, insan embriyonik kök hücrelerinin formaldehit ile çapraz bağlanmasıyla başlar. Çapraz bağlamadan önce, insan embriyonik kök hücreleri sıvı azottan 37 °C'de beş dakika boyunca çözülür ve ardından besiyeri ile yıkanır. Hücreler daha sonra jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara ekilir ve iki ila üç gün boyunca genişlemeleri sağlanır.

Her bir immünopresipitasyon reaksiyonu için 50 ila 100 milyon hücre ile başlamamız gerekecektir. Hücreler önce izole edilir ve süspansiyon halinde toplanır. Her bir hücre süspansiyonuna %1 konsantrasyonunda taze aldehit eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir.

Ardından, formaldehiti etkisiz hale getirmek için hacmin onda biri oranında 1,25 molar glisin ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ardından 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri pellet şeklinde toplamak için tüpleri bir santrifüjde, 4 °C'de, 1000 RPM hızında beş dakika boyunca döndürün.

Santrifüj işleminden sonra süpernatantı atın ve peleti 1,5 mililitre lizis tamponunda yeniden süspand edin. Son olarak, hücreleri 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreler aktarıldıktan sonra, onları sıvı azot içinde üç kez şok dondurmaya tabi tutun ve ardından parçalamak için bir doku öğütücü kullanın.

Hücreler çapraz bağlandığında, immünopresipitasyon için hazır hale gelirler veya eksi 80 santigrat derecede dondurularak süresiz olarak saklanabilirler. Hücreleri çapraz bağladıktan sonra, bunu gerçekleştirmek için manyetik boncukları hazırlamanız gerekir. Her bir immünopresipitasyon için bir tüp boncuk hazırlamak üzere, 1,5 mililitrelik düşük tutunumlu mikro tüplere 50 mikrolitre DI boncuğu ekleyin.

Ardından bir mililitre bloklama çözeltisi ekleyin. Şimdi dyal boncukları dyal MPC kullanarak toplayın. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin.

Boncukların tüpün kenarında toplanmasını bekleyin. Bu işlem yaklaşık 15 saniye sürmelidir. Boncukların toplanmasına yardımcı olmak için rafı iki kez ters çevirebilirsiniz.

Boncuklar toplandıktan sonra, üst fazı pipetle uzaklaştırabilirsiniz. Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, bir mililitre bloklama çözeltisi ekleyin ve manyetik şeridi raftan çıkarıp rafı ters çevirerek boncukları nazikçe yeniden süspande edin. Tüp hala yerindeyken, bu işlemi 10 ila 20 kez veya boncuklar eşit şekilde dağılana kadar tekrarlayabilirsiniz.

Boncukları daha önce yaptığınız gibi yeniden süspansiyona getirerek toplayın. Toplandıktan sonra, süpernatantı bir pipetle uzaklaştırabilirsiniz. Bu yıkama işlemini 1,5 mililitre bloklama çözeltisi kullanarak tekrarlayın.

İkinci yıkamadan sonra, boncukları 750 µL bloklama çözeltisi içinde tekrar süspanse edebilir ve ardından 10 µg antikor ekleyebilirsiniz. Araştırmamızda, MLL proteinine karşı bir antikor kullanıyoruz; karışımı 4 °C'de minimum altı saat veya gece boyunca bir rotasyon karıştırıcıda inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, gece boyu süren inkübasyonun hemen ardından göstereceğimiz şekilde, çapraz bağlı kromatini sonikasyona tabi tutabilirsiniz.

Antikor çözeltisini uzaklaştırın ve ardından boncukları üç kez yıkayın. Daha önce yaptığınız gibi, boncukları toplamak için manyetik rafı kullanarak bir mililitre lyase tamponu kullanın. Yıkama işlemlerinden sonra, doyurulmuş kromatini eklemeye hazırsınız.

Sonikasyona başlamadan önce, öncelikle dondurulmuş hücre peletlerini -80 °C'den çıkarmanız ve çözünmelerini beklemeniz gerekir. Sonikasyon için 15 ml'lik konik bir tüp hazırlayın. Bu işlem, tüpün 5 ml işaretinden iki parçaya bölünmesi ve üst yarısının atılmasıyla gerçekleştirilir.

Tüpler parafilm veya tüp kapağı ile kapatılabilir. Kurulum sırasında, bir tüp rafı kullanarak tüpü, ator probunun tüp tabanının yaklaşık 0,5 ila 1 cm üzerinde kalacağı şekilde konumlandırın.

Çözeltinin köpürmesini önlemek için probun merkezlendiğinden ve tüpün kenarına temas etmediğinden emin olun. Şimdi süspansiyonu 20 saniyelik altı tur boyunca sonike edin. Köpürmeyi azaltmak için her örnek, sonikasyon turları arasında buzlu su banyosunda tutulmalıdır.

Başlangıçta güç çıkışını sıfıra ayarlayın ve ardından ilk patlama sırasında gücü manuel olarak nihai seviyeye yükseltin. Bir süre bekledikten sonra, materyali 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından dördü derece Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca 13.000 RPM hızında santrifüjleyin. Bu işlem, kalıntıların çöktürülmesini ve supernatantın toplanmasını sağlar.

SINA'yı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Her örnekten 50 mikrolitre hücre lizatını girdi DNA'sı olarak saklayın. Bu, daha sonra paylaşılan kromatin boyutunu kontrol etmek için kullanılacaktır.

Bu, -20 °C'de saklanabilir. Sonikasyonla parçalanmış lizat her partisi için en az bir girdi DNA alikotu saklanmalıdır. Artık kromatini immün çöktürmeye hazırız.

İlk olarak, önceki adımda toplanan çökelmeden 50 ila 100 milyon hücreye eşdeğer kromatini, daha önce hazırladığımız 50 µL antikor manyetik besleme karışımına ekleyerek nihai hacmi 1 mL'ye tamamlayın. Gerekirse, bu hacim lizis tamponu ile ayarlanabilir; boncukları yeniden süspande etmek için tüpü ters çevirin. Bu karışımı, rotator üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, boncukları dyl MPC kullanarak toplayın ve tüpleri rafa yerleştirerek boncukların tüpün kenarında toplanmasını sağlayın. Bu işlem yaklaşık 20 saniye sürmelidir. Tüm boncukların toplanmasına yardımcı olmak için rafı iki kez sallayın.

Ardından, her örnek arasında uç değiştirerek pipetle çökeltiyi uzaklaştırın. Selanjutnya, boncukları yıkamamız gerekiyor. Bunun için her tüpe bir mililitre lyase tamponu ekleyin ve boncukları nazikçe yeniden süspande edin.

Bu işlem, manyetik şeridin raftan çıkarılması ve tüpler hala yerindeyken rafın yaklaşık 10 ila 20 kez veya boncuklar eşit şekilde yeniden süspanse olana kadar ters çevrilmesiyle yapılabilir. Ardından, manyetik şeridi tekrar yerleştirerek boncukları toplayın. Süpernatanı pipetle uzaklaştırın.

Bu yıkama işlemini üç ila beş kez daha tekrarlayın. Yıkamalar arasında uçları değiştirmeyi unutmayın. Ardından, boncukları az önce açıklandığı gibi bir mililitre IP 1 tamponu ile dört ila altı kez yıkayın.

Ardından, boncukları benzer şekilde bir mililitre IP iki tamponunda dört ila altı kez yıkayın. Son olarak, diğer yıkamalarda olduğu gibi, boncukları bir mililitre pH 8.0 TE tamponunda dört ila altı kez yıkayın. Son yıkamanın ardından TE'yi uzaklaştırın.

Kalıntı TE tamponunu uzaklaştırmak için şimdi 4 °C'de, 3000 RPM hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Boncuklar artık kromatini uzaklaştırmak için elüsyon işlemine hazırdır. İlk olarak, 210 µL elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri 65 °C'lik bir termal karıştırıcıda 800 RPM hızında 15 dakika, elüat geri kazanımını artırmak için ise 30 dakikaya kadar inkübe ederek materyali boncuklardan elüe edin.

Boncukları 13,000 RPM hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası sıcaklıkta, 200 µL süpernatantı uzaklaştırıp yeni bir tüpe aktarın ve ardından 200 µL TE 0.0 ekleyin. Artık örneklerimiz, çöktürülmüş DNA'nın çapraz bağlarını geri çözmek için CROs işlemine hazırdır.

Süpernatanı 65 °C'lik bir su banyosunda minimum altı saat, maksimum on beş saat boyunca inkübe edin. Yoğuşmayı en aza indirmek için bu inkübasyon bir su banyosunda gerçekleştirilebilir. Ardından, 50 µL girdi DNA'sını ekleyin.

Sonikasyondan sonra, eluat ile yapıldığı gibi, 65 degrees Celsius'ta inkübe edilerek bu giriş DNA'sının ters çapraz bağ uzunluğu geri döndürüldü. Artık DNA'yı saflaştırmaya hazırız. DNA daha sonra fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürme teknikleri kullanılarak saflaştırılır ve çöktürülür.

Çöktürülmüş DNA pelletleri suda süspande edilir ve ardından -20 °C'de saklanabilir. Gelecekteki kullanımlar için, saflaştırılmış girdi DNA'sının, parçalanmış kromatin boyutunu kontrol etmek amacıyla bir agaroz jelde yürütülmesi sağlanabilir. İdeal olarak, kromozom 250 ile 750 baz arasında olmalıdır.

Böylece size insan embriyonik kök hücresinden kromatin immünpresipitasyonunun nasıl yapılacağını göstermiş olduk. Bu deneyi gerçekleştirirken, yüksek afiniteli bir antikor, uygun boyut aralığına sahip kromatin ve yüksek stringensli yıkama basamakları kullanmanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.