Name: İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemiyle farklılaşma süreçlerini ve epigenetik düzenlemeleri nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, kök hücre biyolojisinde protein-DNA etkileşimlerini analiz etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sunulan çalışma FS California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) hibe (RS1-00.477-1) tarafından desteklenmektedir

Çözülme ES hücrelerinin (Video Öne değil) ES hücrelerinin% 10 DMSO içeren ortamda dondurulur. DMSO ES hücrelerinin farklılaşması uyarabilir, bu gün geç hücreleri çözünmesi mümkün olabilir ve böylece artık DMSO etkilerini en aza indirmek için ertesi sabah orta değiştirmek için. <ol><li> 6-iyi bir doku kültürü en az 15 dakika süreyle% 0,1 jelatin ile plaka ve levha hücrelere hemen önce aspire Coat. </li><li> Çözülme ES hücreleri 37 ° C su banyosunda (yaklaşık 5 x 10 6 hücre, bir konfluent 6-iyi eşdeğer) ve prewarmed ES hücre orta içine 10 ml seyreltik. </li><li> Pelet, bir tezgah üstü klinik santrifüj 1000 rpm&#39;de 10 dakika boyunca iplik hücreleri. </li><li> 10 ml 37 ° C prewarmed orta orta ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Transferi hücre 6 plaka süspansiyon ve 37 büyümeye ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör. </li><li> Ertesi gün, ölü hücreler ve artık DMSO kaldırmak için, orta değiştirin. </li></ol> Passage genişlemesi ve ES hücre kültürleri ES hücrelerinin 2 / 3 gün rutin olarak her geçişli, ve orta alternatif gün değiştirilir. Böylece, ES hücreleri günlük dikkat gerektirir. Bizim tecrübelerimize göre, besleyici bağımsız ES hücrelerinin hızla büyümeye ve hızlı bir şekilde sarı dönüm, orta asitlenir. Hücreleri (her gün değişen medya ya da çok düşük bir seyreltme hücreler Pasajlanması) orta asitlenir izin vermek totipotency garanti edilemez sonra, aşırı farklılaşması ve hücre ölümünü tetikler, hücrelerin krizi geçirmesi neden olacaktır. Hücreleri izdiham ulaşmadan büyük öbekler oluşturacak ve bu yığınlara içinde hücreler ayırt veya ölecek gibi çok düşük bir yoğunlukta, geçiş sırasında hücrelerin yetersiz dağılım, ya da düzensiz kaplama Kaplama hücreleri, benzer sorunlara yol açabilir. Germline iletim enjeksiyon zaman sağlıklı görünse bile, kötü muamele edilmiş hücreler önemli ölçüde azaltmıştır. <ol><li> Bir hücre konfluent 6 plaka orta aspirat ve hücrelerin uzak pipetleme, 2-3 ml 37 ° C prewarmed PBS ile yıkayın. </li><li> 1 1 ml × hücreler küçük öbekler halinde eşit dağılmış kadar 3-4 dakika veya tripsin çözüm hücreleri Kapak. </li><li> Tripsin inaktive orta 1 ml ekleyin. </li><li> Taze jelatinize 6 plaka tripsinize hücreleri ve plaka hücreleri (genellikle kuyu 2 / 5) toplayın. </li></ol> Donma ES hücreleri <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi konfluent 6-iyi bir plaka Trypsinize (yaklaşık 1 × 10 7 hücreleri). </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca orta ve pelet 9 ml tripsinize hücreleri toplayın. </li><li> 1 ml taze hazırlanmış dondurma orta, orta ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire edin. Iki cryotubes içine kısım hücre 0,5 ml. </li><li> Şişeleri Freeze -80 ° C gecelik ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen transfer. </li></ol> ChIP-on-chip PROSEDÜRÜ Immunoprecipitation <ol><li> Formaldehit crosslinking hücreleri (süspansiyon hücreleri için) <ol><li> Her immunoprecipitation için 1 x 10 8 hücre - 5 x 10 7 kullanın. </li><li> % 1 konsantrasyonda hücre süspansiyonu taze Formaldehit ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika Formaldehit Çözüm hücreleri kuluçkaya. </li><li> Formaldehit gidermek için 1 / 10 hacmi 1,25 M glisin ekleyin. </li><li> 10 ml 1x PBS ile iki kez hücreleri durulayın. </li><li> Havuz, 50 ml konik tüpler hücreler ve 4 5 dakika 700g spin ° C Lizis Buffer 1.5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp hücrelerin aktarın. </li></ol></li><li> Flash-freeze üç kez sıvı nitrojen içinde hücre ve hücreler kırmak için bir doku değirmeni kullanın. Hücreleri çapraz bağlı, onlar -80 ° C süresiz dondurularak saklanmalıdır. </li></ol> (Adımlar 4 ° C yapılır) manyetik boncuk hazırlanması <ol><li> 1,5 ml düşük tutma mikrotüp Dynal boncuk 50 ul ekleyin. Immunoprecipitation her boncuk 1 tüp ayarlayın. 1 ml Blok Çözüm ekleyin. </li><li> Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Manyetik rafa yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 15 saniye almalıdır Boncuk toplamak için yardımcı olmak üzere iki kez rafa tersine çevirin. Pipet ile süpernatantı. </li><li> Hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit çıkarmadan 1 ml Blok Çözüm ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk boncuk eşit olarak 10-20 kat ya kadar veya tekrar süspansiyon haline getirin. (Adım 2) Yukarıdaki gibi boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. </li><li> Adım 3, bir kez daha, 1.5 ml Blok Çözüm boncuk yıkayın. </li><li> 750 ul Blok Çözüm boncuk süspanse edin ve 10 mikrogram antikor ekleyin. Rotator, ya da bir gecede, 6 saat, en az 4 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Boncuk üç t yıkayınAdım 3 açıklandığı gibi, 1 ml Blok Çözüm IME&#39;ler. </li></ol> Hücre sonication <ol><li> Sonication için borular ° C ve transfer hücreleri -80 dondurulmuş hücre pelletleri çıkarın. Şu anda sonication için standart bir polupropylene altında, 15 ml konik tüpü kullanmayı tercih. Biz 5 ml işareti de iki adet tüp kesme ve üst yarısında atın. Kurarken Tüpler parafilm veya tüp kap ile karşılanabilir. </li><li> Sonikatör probu üzerinde yaklaşık 0.5-1.0 cm tüp alt oturur mikrofuge&#39;de tüp raf, pozisyon tüp kullanma. Prob merkezli ve tüp kenarlarına temas etmediği dikkat edin. (Probe konumlandırma çözüm köpükler olsun ya da olmasın sonication sırasında etkileyebilir. Tipik olarak, köpük sonicated DNA kötü makaslanmış olacağını gösterir.) </li><li> Süspansiyon 20 sn boyunca 6 kez sonikasyon Örnekleri sonication sırasında bir buz-su banyosunda tutulmalıdır. Başlangıçta 0 olan çıkış gücü, köpük azaltmak ve ilk patlama sırasında nihai güç elle artırmak için. (Köpük önemli varsa, tüm kabarcıklar hiçbir köpük kabarcıkları bırakarak, tüm malzeme yumuşak tabanda takip 20.000 g de santrifüj tarafından kaldırılmış olabilir.) </li><li> Spin 20.000 g de 10 dakika 4 ° C pelet enkaz ve 1.5 ml tüp hasat süpernatantı. </li><li> Giriş DNA gibi her örnekten 50 ul hücre lizat kaydedin. -20 ° C&#39;de muhafaza Sonikasyon lizat toplu başına en az bir giriş DNA kısım tutulmalıdır. Sonication ve parça boyutları ortaya çıkan dağılım etkileri etkileri sadece çapraz ters ve DNA saflaştırılması sonra kontrol edilebilir unutmayın. </li></ol> Kromatin immunoprecipitation <ol><li> Hücre sonication 1 x 10 8 hücre, son hacim 1 ml (Bu manyetik boncuk, Adım 6 hazırlanması 50 ul antikor / manyetik boncuk karışımı 4 adım - 5 x 10 7 kromatin-eşdeğer miktarda ekle Lizis Tampon, hiç) ile ayarlamak mümkündür. 4 rotator gece inkübe ° C </li></ol> Yıkama <ol><li> Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Raf yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 20 sn olmalıdır Tüm boncuk toplamak yardımcı olmak için iki kez rafa tersine çevirin. Örnekleri arasında değişen ipuçları, pipet ile süpernatantı. </li><li> Her tüpe 1 ml Lizis Tampon ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk ekleyin. 10-20 kat veya boncuk eşit yeniden süspanse kadar - Bu hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit kaldırarak olabilir. Boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. Yıkar arasında değişen ipuçları, bu yıkama 5 kez daha tekrarlayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi 1 ml IP1 Tampon, boncuk, 6 kez yıkayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi, 1 ml IP2 Tampon boncuk 6 kez yıkayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi 1 ml TE 8.0 Buffer, boncuk, 6 kez yıkayın. </li><li> Spin 960g az 3 dakika 4 ° C ve herhangi bir kalıntı TE Tampon kaldırmak. </li></ol> Elüsyon <ol><li> Tüpler 15 dakika süreyle 65 ° C su banyosunda inkübe boncuk Elüsyon Tampon ve Zehir malzeme 210 ul ekleyin. Kısaca Vorteks her 2 dk. Bu kuluçka eluat kurtarma geliştirmemize yardımcı olabilecek 30 dakika gibi uzun olarak uzatılabilir. </li><li> G oda sıcaklığında 1 dakika 16.000 boncuk aşağı spin. </li><li> 200 ul süpernatant çıkarın ve yeni bir tüpe transfer. Malzeme -20 ° C&#39;de dondurulmuş ve geceleme saklanabilir. </li></ol> Çapraz bağ ters <ol><li> 6 saat ve en fazla 15 saat (daha uzun çapraz ters genellikle mikroarray analizi artan gürültü sonucu) bir en az 65 ° C&#39;de inkübe Elüsyon, Adım 3 immunoprecipitation DNA çapraz Ters . Bu kuluçka tüp eşit olarak ısıtılır ve oluşan az yoğunlaşma yoktur, böylece bir fırında yapılabilir. </li><li> Sonication sonra saklıdır giriş DNA (Adım 13) 50 ul çözülme, 150 ul (3 cilt) elüsyon tampon ve karışımı ekleyin. 65 ° C çapraz bağ ters Adım 1 inkübe edilmesiyle bu giriş DNA çapraz Ters. Bu noktadan itibaren, her tüp immunoprecipitation veya giriş DNA sonraki adımlarda işlem için ayrı bir tüp veya numune olarak kabul edilir. </li></ol> Arıtma DNA <ol><li> 8 ul 10 mg ml-1 RNaseA (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon), tersini tüp birkaç kez karıştırın ve 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe </li><li> 20 mg ml-1 proteinaz K (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon) ve tersini tüp birkaç kez ve inkübe 55 ° C karışımı 2 saat 4 ul ekle </li><li> Kloroform: 400 ul fenol izoamil alkol (P: C: IA), girdap ve 2 ml Ağır Phaselock tüp (Eppendorf tarafından sağlanan yönergeleri izleyin) ile ayrı fazlar. </li><li> P: C: IA çözüm eski veya düşük pH, degr olacakDNA mikroarray analiz geçerli hedeflerin tespiti ve zarar gürültü neden adation. </li><li> 16 ul 5M NaCl (200 mM) son konsantrasyon) ve 1.5 20 μ ul ul-1 glikojen (30 mikrogram toplam) içeren yeni bir santrifüj tüpüne sulu tabaka transfer </li><li> 800 ul EtOH ekleyin. -80 -20 ° C veya 30 dak ° C gece boyunca inkübe </li><li> 10 dakika 20.000 g Spin 4 ° C pelet DNA. % 80 EtOH 500 ul ekleyerek tekrar süspansiyon pelet vorteks ve 4 az 5 dakika boyunca 20.000 g tekrar iplik ° C pelet yıkayın </li><li> Kalan% 80 EtOH çıkarın. Kalan herhangi bir sıvı toplamak ve pelet kaçınarak, bir pipetteman sıvı kaldırmak için kısaca tüpler dönerler. Tüpler hava pelet sadece kuru hale gelene kadar kurumasını bekleyin: pelet hala nemli bir görünüm saklamalıdır. 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 70 ul her pelletini tekrar. </li><li> Bu pelet saçınızın aşırı onları tekrar süspansiyon zor, ya da tüp yan uzak pul ve soyma sorumlu yapabilirsiniz. </li><li> İsteğe Bağlı: 15 ul immunoprecipitation örnek ileride kullanmak üzere kaydedin. Bu malzeme mikroarray sonuçları gen-spesifik PCR onay gerçekleştirmek için kullanılır. </li><li> (260 nm) UV absorpsiyon konsantrasyonu sayısal olarak. </li></ol> Not: kütüphane hazırlama ve amplifikasyon dNTP olmadan Sigma 10X Amp Mix modifiye GenomePLex WGA kiti kullanmak da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları izleyin: Kütüphane hazırlık Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. <ol><li> Arıtma DNA, PCR tüp Adım 11 1X Kütüphane Hazırlık Buffer 2 ul DNA örneği 10 ul ekleyin. </li><li> Kütüphane Sabitleme Çözüm 1 ul ekleyin. </li><li> ° C 2 dakika süreyle, santrifüj Vortex iyice pekiştirmek ve 95 termal cycler yer. </li><li> Soğuk, buz üzerinde örnek santrifüj yoluyla santrifüj birleştirmek ve sonra buz dönmek. </li><li> 1 Kütüphane Hazırlık Enzim ul iyice vorteks ve ardından kısa bir süre santrifüj ekleyin. </li><li> Olarak termal cycler ve inkübe Yeri örnek aşağıdaki gibidir: <ul><li> 20 dakika boyunca 16 ° C </li><li> 20 dakika boyunca 24 ° C </li><li> 20 dakika boyunca 37 ° C </li><li> 5 dakika boyunca 75 ° C </li><li> 4 ° C tutun </li></ul></li><li> Termal cycler ve santrifüj kısaca örnekler çıkarın. Örnekler 20 ° C&#39;de üç gün boyunca hemen amplifiye veya saklı olabilir. </li></ol> Amplifikasyon Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. <ol><li> Bir master karışımı aşağıda, Adım 3 ila 15 ul reaksiyon için aşağıdaki reaktifler ekleyerek hazırlanır: <ul><li> 10X Amp Mix 7.5 ul (dNTP olmadan) </li><li> WGA DNA Polimeraz 5.0 ul </li><li> 10 mM dNTP (her biri) hisse senedi (son konsantrasyonu 0.4 mM) 3.0 ul </li><li> Nükleaz içermeyen su ile 75 ul son reaksiyon hacmi getir </li></ul></li><li> Iyice Vortex. Kısaca Santrifüj ve thermocycling başlamak. <ul><li> 3 dakika İlk Denatürasyon 95 ° C </li><li> 14 döngüleri aşağıdaki gibi yapın: </li><li> 15 saniye için bozulurak 94 ° C </li><li> 65 uzatın / Tavlama ° C&#39;de 5 dakika </li></ul> Bisiklet tamamlandıktan sonra, 4 reaksiyonlar korumak analiz veya arıtma için hazır olana kadar ° C veya -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Quiagen üreticinin talimatlarına göre, PCR Arıtma ile DNA ® Kit arındırmak ve UV absorpsiyon (260 nm) konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Kütüphane Hazırlık amplifikasyon döngüsü tekrar yapın, aşağıdaki adaptasyonlar, Amplifikasyon, Adım 2 Adım 1 ile. • parçalanma sürecini başlatmak için yukarıdaki Adım 3, gerekli DNA miktarı ile ilgili olarak: DNA konsantrasyonu mg / ml, örnek 2.5 ul kullanın ve su ile son hacim 10 ul ayarlamak 200-300 civarındadır. DNA konsantrasyonu 50-60 mg / ml civarında ise, 5 ul örnek ve 10 ul son hacim su ile ayarlamak. • Bu ikinci büyütme işlemi, ana karışımı dTTPs ile dNTP, 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP ve 8 mM dTTP ve aynı konsantrasyonu önceki karışımı az 2 mM dUTP de dahil olmak üzere bir karışımı karşılığında. </li><li> UV-vis spektrofotometre kullanarak ölçün DNA (260 nm). Normalde, daha fazla amplifiye DNA 9 mikrogram Her reaksiyon elde edilir. Not: DNA hedefleri etiketleme GeneChip ile yapılır ® Affymetrix WT Çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kit, üreticinin talimatlarına göre aşağıda açıklandığı gibi: </li></ol> Fragment amplifiye hedefleri <ol><li> Hedefin ne tür bir dizi bağlı olarak uygun aşağıdaki tabloyu kullanarak örnekleri Fragment hibrid olacakiçin randomize. Tablo 1. Tek diziler için Parçalanma Mix <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content"> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td class="jove_content"> Çift iplikli DNA 7.5 mikrogram </td></tr><tr><td class="jove_content"> 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> UDG, 10 U / ml 1.5 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> APE 1, 100 U / ml 2,25 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> 48 ul Nükleazlar ücretsiz su </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti Tablo 2. Çok dizi setleri için Parçalanma Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td> Çift iplikli DNA 9 mikrogram </td></tr><tr><td> 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul </td></tr><tr><td> UDG, 10 U / ml 1.5 ul </td></tr><tr><td> APE 1, 100 U / ml 2,25 ul </td></tr><tr><td> 48 Nükleazlar ücretsiz su </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti </li><li> Yukarıdaki iki Tablolar göre parçalanma karışımı ayarlayın. Flick-mix ve tüpler aşağı döndürün. </li><li> Inkübe reaksiyonlar: <ul><li> 1 saat boyunca 37 ° C </li><li> 2 dakika süreyle 93 ° C. </li><li> En az 2 dakika süreyle 4 ° C. </li></ul></li><li> Flick-mix, tüpler aşağı spin ve yeni bir tüp 45 ul örnek aktarmak. </li><li> Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. </li></ol> Etiket parçalanmış çift iplikli DNA <ol><li> Aşağıdaki tabloda açıklandığı gibi çift iplikli DNA Etiketleme Mix hazırlayın: Tablo 3. Çift iplikli DNA Etiketleme Mix Bileşimi <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td> 5X TdT Tampon 12 ul </td></tr><tr><td> TdT 2 ul </td></tr><tr><td> DNA Etiketleme Reaktif, 5 mM 1 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacmi 15 ul </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti </li><li> DNA örnekleri, ti-mix, çift iplikli DNA Etiketleme Mix 15 ul ekleyin ve onları aşağı döndürün. </li><li> Inkübe reaksiyonlar: <ul><li> 37 ° C - 60 dk. </li><li> 10 dakika süreyle 70 ° C. </li><li> 4 ° C en az 2 dk. </li></ul></li><li> Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. </li></ol> Gel-shift analizi <ol><li> % 4 agaroz jel hazırlayın. </li><li> Fragment amplifiye hedefler, Adım 5 ve Etiket parçalanmış çift iplikli DNA, 65 Adım 4 ° C &#39;de 2 dakika süreyle örnekler inkübe edin. </li><li> Ul Streptavidin (1 mg / ml), 10 ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe örnekleri ekleyin. </li><li> Etiketleme ürünlerin shift göç kontrol etmek için% 4 agaroz jel Adım 3 (Jel-shift analizi, Adım 1) örnek çalıştırın. </li></ol> Dizi hibridizasyon &amp; Dizi yıkama University of California Riverside Genomik Merkezi tarafından gerçekleştirilir. Dizi analizi Hesaplamalı analiz yapıldı. TAMPON KOMPOZİSYONLAR: Blok Çözüm: PBS +% 0,5 Bovine Serum Albumin (BSA). Lizis Tamponu: 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA % 1 Triton X-100 % 0.1 SDS 1mm PMSF Final pH 7.5 IP1: Lizis Tampon + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA % 0.5 &#39;NP-40 % 0.5 Sodyum Dioxycholat Final pH 8.0 TE: 10 mM Tris, pH: 7.4 1 mM EDTA Final pH 8.0 Elüsyon Tampon: TE Tampon +% 1 SDS.

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li>
<li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li>
</ol>

Kromatin immunoprecipitation (çip), hücre farklılaşması sırasında kromatin tabanlı işlemler diseksiyon için değerli bir teknik sunmaktadır. Bu yöntemin başarısı için ön koşullar iyi antikor ve antijen ilgi eksikliği kontrol doku veya hücrelerin kromatin durumu. DNA mikroarray teknolojisi, büyük miktarlarda bilgi ChIP birleştirerek elde edilebilir. ChIP sonuçlarının geçerlilik proteinlerin dinamik dernek, protein değişiklikler ve / veya RNA hücre gelişimi sırasında biyolojik süreçlerin yürütülmesi ile bağlantı kurabilirsiniz uygun test sistemlerinin kullanılabilirliğini bağlıdır.

<table><tbody><tr><td>Poteinase-K</td><td>Reaktif</td><td>Roche Group</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase-A</td><td>Reaktif</td><td>Fermentas</td><td>#EN0531</td><td></td></tr><tr><td>formaldehit %37</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>FX040-13</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Reaktif</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenol:kloroform:izoamil alkol</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>SA, fraksiyon V</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>9410</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Reaktif</td><td>JT Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>Lityum klorür</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>5910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Reaktif</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>Deoksikolik asit, sodyum tuzu</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Reaktif</td><td>Applichem</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, protein A</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>100.02D</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, protein G</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Düşük Tutunmalı Mikrotüpler, Xtreme</td><td>Diğer</td><td>Phenix Research Products</td><td>MAX-815S</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 2.0 ml</td><td>Reaktif</td><td>Eppendorf</td><td>955154037</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan embriyonik kök hücre kromatin immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Küçük bir kök hücre sayısı, metazoan organizmaların hücre sayısız fonksiyonel ve yapısal karmaşıklığı ortaya çıkar. Kendini yenileme ve hemen hemen her hücre tipi 1 ayırt etmek için bir kök hücre sağlar multipotency: Kök hücreler, iki temel özellikleri ile karakterize edilir . Farklılaşmış hücre ilerlemesini kök hücre faaliyetleri kurmak ve korumak hücre tipine özgü gen ekspresyonu multipotency, yapısal ve morfolojik değişiklikler ve hiyerarşik faaliyet transkripsiyon faktörleri ve sinyal molekülleri kaybı ile karakterizedir. Moleküler düzeyde, hücre farklılaşması, kromatin yapısı ve kompozisyon dinamik değişiklikleri içerir ve bu dinamik değişimler algılama, kök hücre ve hücre farklılaşması süreci 2,3 fonksiyonel özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Kromatin oluşturan yüksek oranda sıkıştırılmış bir DNA-protein kompleksi proteinleri ile hücre paketi, özellikle kromozomal DNA histon 4. Stemcellness ve hücre farklılaşması gibi epigenetik faktörler, histon türevleri ve transkripsiyon faktörleri 2,3,5 gibi düzenleyici proteinlerin belirli dizilerin varlığı ile korele edilmiştir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) varlığı RNA, proteinler ve kromatin 6,7 protein değişiklikler izlemek için değerli bir yöntem sağlar. Farklı hücre tipleri kromatin karşılaştırma, hücre farklılaşması sırasında meydana gelen protein kromatin dernekler dinamik değişimlere aydınlatmak. Kromatin immunoprecipitation in vivo çapraz bağlı kromatin arıtma içerir. Izole kromatin enzimatik sindirim veya mekanik güç ile daha küçük parçalara azalır. Kromatin parçaları, protein ya da protein ve DNA değişiklikleri hedef spesifik antikorların kullanarak çöktürülür. Çöktürülmüş DNA veya RNA saflaştırılmış ve PCR veya DNA mikroarray tabanlı deneyleri için bir şablon olarak kullanılır. Başarılı bir ChIP için önkoşullar istenen antijen ve hedef molekülü ifade kontrol hücrelerin kromatin durumu yüksek kaliteli antikorlar. ChIP proteinler, protein ve RNA değişiklikler ve özel hedef DNA ile RNA varlığı ilişkilidir ve outread aracının seçimine bağlı olarak, belirli hedef genlerin ya da bütün bir genom bağlamında hedef moleküller arasındaki ilişkiyi algılar. Proteinlerin hücrelerin ayırt kromatin dağılımı karşılaştırma hücrelerinin bir hücre boyunca ilerlemesi ile denk kromatin kompozisyon dinamik değişiklikleri aydınlatmak.

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Metazoon organizmalardaki sayısız hücrenin fonksiyonel ve yapısal karmaşıklığı, az sayıda kök hücreden kaynaklanmaktadır. Kök hücreler...

Merhaba, ben California Üniversitesi Riverside Biyokimya Bölümü'nde Dr. Frank Zawa'nın laboratuvarından Stefan Burani. Bugün size kromatin immünopresipitasyon prosedürünü göstereceğiz. Haydi başlayalım.Bu prosedür, insan embriyonik kök hücrelerinin formaldehit ile çapraz bağlanmasıyla başlar. Çapraz bağlamadan önce, insan embriyonik kök hücreleri sıvı azottan 37 °C'de beş dakika boyunca çözülür ve ardından besiyeri ile yıkanır. Hücreler daha sonra jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara ekilir ve iki ila üç gün boyunca genişlemeleri sağlanır.Her bir immünopresipitasyon reaksiyonu için 50 ila 100 milyon hücre ile başlamamız gerekecektir. Hücreler önce izole edilir ve süspansiyon halinde toplanır. Her bir hücre süspansiyonuna %1 konsantrasyonunda taze aldehit eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir.Ardından, formaldehiti etkisiz hale getirmek için hacmin onda biri oranında 1,25 molar glisin ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ardından 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri pellet şeklinde toplamak için tüpleri bir santrifüjde, 4 °C'de, 1000 RPM hızında beş dakika boyunca döndürün.Santrifüj işleminden sonra süpernatantı atın ve peleti 1,5 mililitre lizis tamponunda yeniden süspand edin. Son olarak, hücreleri 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreler aktarıldıktan sonra, onları sıvı azot içinde üç kez şok dondurmaya tabi tutun ve ardından parçalamak için bir doku öğütücü kullanın.Hücreler çapraz bağlandığında, immünopresipitasyon için hazır hale gelirler veya eksi 80 santigrat derecede dondurularak süresiz olarak saklanabilirler. Hücreleri çapraz bağladıktan sonra, bunu gerçekleştirmek için manyetik boncukları hazırlamanız gerekir. Her bir immünopresipitasyon için bir tüp boncuk hazırlamak üzere, 1,5 mililitrelik düşük tutunumlu mikro tüplere 50 mikrolitre DI boncuğu ekleyin.Ardından bir mililitre bloklama çözeltisi ekleyin. Şimdi dyal boncukları dyal MPC kullanarak toplayın. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin.Boncukların tüpün kenarında toplanmasını bekleyin. Bu işlem yaklaşık 15 saniye sürmelidir. Boncukların toplanmasına yardımcı olmak için rafı iki kez ters çevirebilirsiniz.Boncuklar toplandıktan sonra, üst fazı pipetle uzaklaştırabilirsiniz. Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, bir mililitre bloklama çözeltisi ekleyin ve manyetik şeridi raftan çıkarıp rafı ters çevirerek boncukları nazikçe yeniden süspande edin. Tüp hala yerindeyken, bu işlemi 10 ila 20 kez veya boncuklar eşit şekilde dağılana kadar tekrarlayabilirsiniz.Boncukları daha önce yaptığınız gibi yeniden süspansiyona getirerek toplayın. Toplandıktan sonra, süpernatantı bir pipetle uzaklaştırabilirsiniz. Bu yıkama işlemini 1,5 mililitre bloklama çözeltisi kullanarak tekrarlayın.İkinci yıkamadan sonra, boncukları 750 µL bloklama çözeltisi içinde tekrar süspanse edebilir ve ardından 10 µg antikor ekleyebilirsiniz. Araştırmamızda, MLL proteinine karşı bir antikor kullanıyoruz; karışımı 4 °C'de minimum altı saat veya gece boyunca bir rotasyon karıştırıcıda inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, gece boyu süren inkübasyonun hemen ardından göstereceğimiz şekilde, çapraz bağlı kromatini sonikasyona tabi tutabilirsiniz.Antikor çözeltisini uzaklaştırın ve ardından boncukları üç kez yıkayın. Daha önce yaptığınız gibi, boncukları toplamak için manyetik rafı kullanarak bir mililitre lyase tamponu kullanın. Yıkama işlemlerinden sonra, doyurulmuş kromatini eklemeye hazırsınız.Sonikasyona başlamadan önce, öncelikle dondurulmuş hücre peletlerini -80 °C'den çıkarmanız ve çözünmelerini beklemeniz gerekir. Sonikasyon için 15 ml'lik konik bir tüp hazırlayın. Bu işlem, tüpün 5 ml işaretinden iki parçaya bölünmesi ve üst yarısının atılmasıyla gerçekleştirilir.Tüpler parafilm veya tüp kapağı ile kapatılabilir. Kurulum sırasında, bir tüp rafı kullanarak tüpü, ator probunun tüp tabanının yaklaşık 0,5 ila 1 cm üzerinde kalacağı şekilde konumlandırın.Çözeltinin köpürmesini önlemek için probun merkezlendiğinden ve tüpün kenarına temas etmediğinden emin olun. Şimdi süspansiyonu 20 saniyelik altı tur boyunca sonike edin. Köpürmeyi azaltmak için her örnek, sonikasyon turları arasında buzlu su banyosunda tutulmalıdır.Başlangıçta güç çıkışını sıfıra ayarlayın ve ardından ilk patlama sırasında gücü manuel olarak nihai seviyeye yükseltin. Bir süre bekledikten sonra, materyali 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından dördü derece Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca 13.000 RPM hızında santrifüjleyin. Bu işlem, kalıntıların çöktürülmesini ve supernatantın toplanmasını sağlar.SINA'yı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Her örnekten 50 mikrolitre hücre lizatını girdi DNA'sı olarak saklayın. Bu, daha sonra paylaşılan kromatin boyutunu kontrol etmek için kullanılacaktır.Bu, -20 °C'de saklanabilir. Sonikasyonla parçalanmış lizat her partisi için en az bir girdi DNA alikotu saklanmalıdır. Artık kromatini immün çöktürmeye hazırız.İlk olarak, önceki adımda toplanan çökelmeden 50 ila 100 milyon hücreye eşdeğer kromatini, daha önce hazırladığımız 50 µL antikor manyetik besleme karışımına ekleyerek nihai hacmi 1 mL'ye tamamlayın. Gerekirse, bu hacim lizis tamponu ile ayarlanabilir; boncukları yeniden süspande etmek için tüpü ters çevirin. Bu karışımı, rotator üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, boncukları dyl MPC kullanarak toplayın ve tüpleri rafa yerleştirerek boncukların tüpün kenarında toplanmasını sağlayın. Bu işlem yaklaşık 20 saniye sürmelidir. Tüm boncukların toplanmasına yardımcı olmak için rafı iki kez sallayın.Ardından, her örnek arasında uç değiştirerek pipetle çökeltiyi uzaklaştırın. Selanjutnya, boncukları yıkamamız gerekiyor. Bunun için her tüpe bir mililitre lyase tamponu ekleyin ve boncukları nazikçe yeniden süspande edin.Bu işlem, manyetik şeridin raftan çıkarılması ve tüpler hala yerindeyken rafın yaklaşık 10 ila 20 kez veya boncuklar eşit şekilde yeniden süspanse olana kadar ters çevrilmesiyle yapılabilir. Ardından, manyetik şeridi tekrar yerleştirerek boncukları toplayın. Süpernatanı pipetle uzaklaştırın.Bu yıkama işlemini üç ila beş kez daha tekrarlayın. Yıkamalar arasında uçları değiştirmeyi unutmayın. Ardından, boncukları az önce açıklandığı gibi bir mililitre IP 1 tamponu ile dört ila altı kez yıkayın.Ardından, boncukları benzer şekilde bir mililitre IP iki tamponunda dört ila altı kez yıkayın. Son olarak, diğer yıkamalarda olduğu gibi, boncukları bir mililitre pH 8.0 TE tamponunda dört ila altı kez yıkayın. Son yıkamanın ardından TE'yi uzaklaştırın.Kalıntı TE tamponunu uzaklaştırmak için şimdi 4 °C'de, 3000 RPM hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Boncuklar artık kromatini uzaklaştırmak için elüsyon işlemine hazırdır. İlk olarak, 210 µL elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri 65 °C'lik bir termal karıştırıcıda 800 RPM hızında 15 dakika, elüat geri kazanımını artırmak için ise 30 dakikaya kadar inkübe ederek materyali boncuklardan elüe edin.Boncukları 13,000 RPM hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası sıcaklıkta, 200 µL süpernatantı uzaklaştırıp yeni bir tüpe aktarın ve ardından 200 µL TE 0.0 ekleyin. Artık örneklerimiz, çöktürülmüş DNA'nın çapraz bağlarını geri çözmek için CROs işlemine hazırdır.Süpernatanı 65 °C'lik bir su banyosunda minimum altı saat, maksimum on beş saat boyunca inkübe edin. Yoğuşmayı en aza indirmek için bu inkübasyon bir su banyosunda gerçekleştirilebilir. Ardından, 50 µL girdi DNA'sını ekleyin.Sonikasyondan sonra, eluat ile yapıldığı gibi, 65 degrees Celsius'ta inkübe edilerek bu giriş DNA'sının ters çapraz bağ uzunluğu geri döndürüldü. Artık DNA'yı saflaştırmaya hazırız. DNA daha sonra fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürme teknikleri kullanılarak saflaştırılır ve çöktürülür.Çöktürülmüş DNA pelletleri suda süspande edilir ve ardından -20 °C'de saklanabilir. Gelecekteki kullanımlar için, saflaştırılmış girdi DNA'sının, parçalanmış kromatin boyutunu kontrol etmek amacıyla bir agaroz jelde yürütülmesi sağlanabilir. İdeal olarak, kromozom 250 ile 750 baz arasında olmalıdır.Böylece size insan embriyonik kök hücresinden kromatin immünpresipitasyonunun nasıl yapılacağını göstermiş olduk. Bu deneyi gerçekleştirirken, yüksek afiniteli bir antikor, uygun boyut aralığına sahip kromatin ve yüksek stringensli yıkama basamakları kullanmanız önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

chromatin-immunoprecipitation-from-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) yöntemiyle farklılaşma süreçlerini ve epigenetik düzenlemeleri nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, kök hücre biyolojisinde protein-DNA etkileşimlerini analiz etmek için kullanılır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Daha fazla video keşfet