Name: Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Öğrenin fare embriyolarından erken hematopoietik kök hücre izolasyonu için mikro-disseksiyon ve akış sitometri tekniklerini. Bu yöntem araştırmacılara saf hücre popülasyonları elde etmede yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diseksiyon ve izolasyon fare yolk kesesi ve aort-gonad-mesonephros bölgenin erken hematopoetik kök hücrelerin <ol><li> Başlamadan önce, prosedürü için gerekli tüm reaktifler ve araçlar için önemlidir: <ul><li> Makas </li><li> Forseps, büyüklüğü 4 ve cerrahi sınıf kıvrık uçlu forseps, büyüklüğü 5 / 45 (isteğe bağlı) </li><li> Şırınga ile 30 insülin iğnesi </li><li> 35mm ve 100mm Petri kapları </li><li> PBS% 10 ve% 20 fetal sığır serumu </li><li> ve son olarak, kollajenaz </li></ul></li><li> Diseksiyonu başlamak için, biz yazılan anlayışı 10.5 gün hamile bir kadın rahim boynuzları hasat gerekir. </li><li> Hayvanlar onaylanmış prosedürlere göre ötenazi. Biz, karbon dioksit boğulma, servikal dislokasyon kullanın. </li><li> Kadın karnı etanol ile ıslak ve cilt makas açıldı. </li><li> Forseps ile cilde Holding, periton ek kesikler açmak için yapılır. </li><li> Karın açılır ve rahim boynuzları görüntülenebilmekte. Uterin boynuz tutmak için forseps kullanarak, her distal uç ve iki boynuz tüketim merkezi kesti. </li><li> Uterus boynuzları sonra rahim dokuları temizlemek için% 10 FBS ile soğuk PBS içeren bir Petri kabındaki yerleştirilir. </li><li> Boyutu 4 forseps kullanarak ve mikroskop altında çalışan, yavaşça plasenta ponksiyon dikkatli olmak, her embriyo konseptus etrafında endometrial doku kaldırmak. </li><li> Kaldırılır sonra, embriyolar soğuk PBS ve% 10 FBS ile taze bir tabak içinde yerleştirilir. </li><li> Plasental doku embriyonun kendi noktada plasenta uzak embriyo kaplı yolk sac kesmek için forseps kullanarak yolk sac kaplı ortaya çıkarmak için dikkatlice çıkarın. Vitellin arterler, ve göbek kordonu bir kısmını içeren yolk kesesi embriyo hafifçe uzak alay ve disosiasyon için buz üzerinde bir kenara olabilir. </li><li> Embriyo% 10 FBS PBS minimal düzeyde küçük bir Petri kabı taşınır yeterli embriyo ıslak ama çok fazla değil. Plaka Diseksiyon sırasında yavaş yavaş, güvenli bir şekilde embriyo tutmak, ajite ise optimal düzeyde embriyo sabit tutmak. </li><li> Ön ayakları üstünde ve arka ayaklarının altında kesim tarafından embriyonun alt ve üst kısımları kaldırmak için kullanılan 30 gauge iğne, geçin. Kesme aletleri gibi iğneler kullanarak aşina olmak biraz pratik sürebilir. Iğneler geçerek tekrarlanan küçük kesimler kullanarak bir yöntem, baskın yapılan iğne baskın olmayan elle tutulur bir kesim kılavuzu olarak hareket etmek bir iğne ile doku disseke. </li><li> Embriyonun dorsal kısmını çıkarın. Bu Somitlerin içeren bir dokudur. Aorta (kırmızı çizgi) herhangi bir Knicks önlemek için yeterli bir mesafe kalarak en dorsal doku yavaşça kesip. Kesme aort, kan kaybı ve kolayca yerini görselleştirmek için yetersizlik neden olacaktır. Yine iğne ile küçük kesikler hassas kesim yeri korumak için hayati önem taşımaktadır. </li><li> Uzak görünümü dışında ekstra doku itin ve tekrar knicking olmadan, mümkün olduğunca aort yakın olarak kesme, ventral doku kesmek için embriyo turn around. Keser, en uygun yerden çok uzakta AGM izole bir kez silinebilir mevcut olan karın dokuları, neden olacaktır. </li><li> Embriyonun plaka karşı aşağı dorsal tarafına veya arkasına yerleştirin. Hafifçe yanlardan aşağı iterek ve gonadal sırtlar yer görselleştirme açık embriyo Şevli. Bunlar aortanın her iki tarafta tüp benzeri yapılar olarak off-center biraz bulunmaktadır. </li><li> Daha önce olduğu gibi aynı kesim teknikleri kullanarak, aşırı yan dokuları kaldırarak diseksiyonu tamamlayın. Embriyo yan dokusu çıkarıldıktan sonra, daha sonra embriyo kalan yan doku çıkarmak için baş aşağı açıktır. </li><li> Bu noktada, AGM, aort ya da gonadlar yaralanma olmadan iğne ile kolayca çıkarılabilecek olan herhangi bir aşırı doku denetlenir. Arıtma için sadece birkaç hücre yüzey belirteçleri güveniyor beri kök hücre popülasyonu daha iyi izolasyon olası sonuç olarak çok daha fazla olarak kaldırılıyor. </li><li> Kıvrık uçlu forseps kullanarak, yavaşça disosiasyon için hazır olana kadar soğuk PBS içinde% 10 FBS ile her AGM ve yer kadar kepçe. </li></ol> Bölünmeler ve FACS Analizi <ol><li> Ayrı tüplerde doku, ilk etapta sarısı keseler ve AGMs ayırmak. </li><li> Pelet dokular kısaca Spin ve% 10 FBS ile PBS atın. </li><li> Dokuların yeterince karşılamak için yeterli hacmi ile,% 20 FBS PBS içinde% 0.25 kollajenaz doku tekrar </li><li> 37 derece dokuların inkübe edin. 25-30 dakika, yumurta sarısı keseler AGMs ve 35-40mins. </li><li> Inkübasyon sonunda, dokular hafifçe yukarı pipet ve tek hücre süspansiyonları aşağı disosiasyon. </li><li> Dokuların aşırı PBS wi yıkayınth% 10 FBS, pelet% 10 FBS ile taze steril PBS içinde hücre ve tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> FACS analizi için, hücreler üreticinin tavsiyelerine göre lekeli. Biz flow sitometri gerçekleştirmek için BD Biosciences bir FACSAria kullanın. Embriyonik hücreler boyutu ve kırılganlık nedeniyle, sıralama diyafram, biz de laboratuvarda çalışma, yetişkin hematopoetik hücreler daha büyük bir çap için ayarlanır. Aynı şekilde, basınç yetişkin hematopoetik hücreler tarafından gerekli koşulları daha az olacak şekilde ayarlanır. Örneğin, FACSAria sıralama, meme büyüklüğü 100 mikron ve sıralama basıncı 30 psi olacaktır olacaktır. </li><li> Belirteçlerinin cKit, CD34 ve CD41 ifade üçlü pozitif hücrelerin kök hücre analizleri için, izole edilir ve yumurta sarısı kesesi ve çift pozitif (cKit, CD34) sıralanmış FACS üzerinden AGM izole edilmiştir. Tipik bir komplo bu gibi görünecektir: cKit pozitif hücreler CD34 ve CD41 aynı anda veya tek tek analiz edilir. Genellikle hücreler pozitif popülasyonlarının bir alt kümesi olarak bulunan kök hücre nüfusu ile her bir belirteç için pozitif bir tonlama gösterir. Bu araziler ortalama 100-300 hücreleri yolk kesesi ve başına AGM ile iyi bir hücre verimi elde etmiş olduğunu bize göstermektedir. </li></ol>

murin yolk sac ve agm erken hematopoetik kök hücre İzolasyonu

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Fare embriyo, erken hematopoez yolk kesesi ve aort-gonad-mesonephros bölge içeren birden fazla organlar, aynı anda oluşur. Bu bölgeler embriyoların kan sisteminin kurulması çok önemlidir ve fetal karaciğer bonemarrow yetişkin kök hücrelerin gelişmesi ve daha sonra kök hücrelerin nihai hareketi sağlar. Erken hematopoietik kök hücreler, bu organların akım sitometrik sıralayarak daha saf bir nüfusa elde etmek için embriyonun mikrodiseksiyon yoluyla izole edilebilir. Bu kök hücre popülasyonlarının fetal ve yetişkin kök hücre havuzu nasıl katkıda belirsizliğini koruyor. Ayrıca, laboratuvar erken kök hücreler işlevsel, fetal ve yetişkin hematopoetik kök hücreler nasıl farklı inceler. Ayrıca, laboratuvar türlü hematopoietik kök hücrelerin farklı popülasyonlar ve çeşitli genetik modelleri bağlamında işlevsel rolü test. Koloni testleri ve kemik iliği nakli: Bu videoda, biz, sık kullandığınız ve aynı zamanda bu nadir nüfusun izole tipik bir FACS plotfter sonuçlarını göstermek mikro diseksiyon prosedürü göstermektedir, fonksiyonel testlerinin de dahil olmak üzere çeşitli gerçekleştirmek mümkündür.

Bu video yolk kesesi ve aort-gonad mesonephros bölge embriyolardan mikro incelemek ve hematopoietik kök hücreler sıralamak için flow sitometri kullanmak nasıl gösterir.

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Fare embriyosunda erken hematopoez; vitellus kesesi ve aorta-gonad-mezonefros bölgesi dahil olmak üzere birden fazla organda eş zamanlı olarak gerçekleşir. Bunlar...

Fare embriyosunda erken hematopoez; vitellus kesesi, aorta gonad-mezonefros (AGM) bölgesi dahil olmak üzere birden fazla organda eş zamanlı olarak gerçekleşir. Daha da önemlisi, erken hematopoetik kök hücreler, embriyonun mikrodiseksiyonu ve ardından daha saf bir popülasyon elde etmek için akış sitometrik sıralama yöntemiyle bu organlardan izole edilebilir.Bu videoda, yaygın olarak kullandığımız mikrodissection prosedürünü uygulamalı olarak gösterecek ve tipik bir faks grafiğinin sonuçlarını sunacağız. Merhaba, ben Dr. Gary Gilland'ın laboratuvarından, Howard Hughes Medical Institute ve Brigham and Women's Hospital Tıp Bölümü'nden Kelly Morgan; eğitimimi Erasmus University Medical Center Rotterdam'da Elaine Dza ile tamamladım. Bugün size, vitellus kesesi ve aortik dorsal meznef bölgesi (AGM) üzerinden erken hematopoetik kök hücreleri elde etmek için kullanılan embriyonik disseksiyon prosedürünü göstereceğim. Ve ben de Michael Care.Yine Go Lab'den. Size FACS kullanarak GM ve vitellus hücrelerinden HSC'ler için tek hücre süspansiyonlarının nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Bu prosedür, E 10,5 embriyolardan erken hematopoetik organların diseksiyonunu, dokuların disosiasyonunu ve hem

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, insan bağışıklık sistemi (HIS) fareleri oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak insan kordon kanı buffy coat hücrelerinden izole edilir. CD34+ HSC'ler, sitokinlerle zenginleştirilmiş ve kriyoprezervasyonlu bir büyüme ortamında genişletilir. Son olarak, çözülmüş HSC'ler, HIS fare modelini oluşturmak için immün yetmezliği olan bir fare yavrusuna enjekte edilir.

İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Bu çalışma, vasküler duvarda yerleşik CD34+ kök hücrelerin (CD34+ VW-SC'ler) izolasyonu, kültürü ve fonksiyonel tayini için stabil ve verimli bir yöntem oluşturmuştur. Bu takip etmesi kolay ve zaman açısından etkin izolasyon yöntemi, kardiyovasküler hastalıklarda yer alan potansiyel mekanizmaları incelemek için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir.

Farelerden Vasküler Duvarda Yerleşik CD34+ Kök Hücrelerin İmmünomanyetik İzolasyonu

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Öğrenin fare embriyolarından erken hematopoietik kök hücre izolasyonu için mikro-disseksiyon ve akış sitometri tekniklerini. Bu yöntem araştırmacılara saf hücre popülasyonları elde etmede yardımcı olur.

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet