Name: Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Öğrenin, kemirgen yeni doğanlardan primer orta beyin dopamin hücre kültürleri oluşturma yöntemini. Bu teknik, dopamin salınım kinetiğini incelemek ve sinirbilim araştırmaları için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DK065872 (AKP), Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Smith Aile Vakfı Ödülü (AKP), F31 DA023760 (BMG, ENP) ve P30 NS047243 Tufts (Neuroscience Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Kültür Önceki Hazırlık Not: ** Glial hücreler çoğalmalı ve yemekleri alt kapağı var, böylece önceden iyi kaplanmış olmalıdır. , Atipik ya da deneysel genetik bir arka plan ile fareler için, genotip açısından glial ve nöronal kültürlerin maç emin olun. Not: diseksiyonu ** 1-7 gün önce, taze nöronal orta hazırlamak ve 2ml yemekler glial orta yerine. Not: ** diseksiyon bir gün önce, aşağıdaki öğeleri gecede UV ışık altında sol gerekir: <ul><li> 4 diseksiyonu plakalar </li><li> Bir mikro-manyetik karıştırıcı ile 2 disosiasyon şişeleri </li><li> 2 flakon kapaklar (2 küçük delikler üst dürttü) </li><li> Slayt halkalar (70% EtOH kat) Spread - kutusu da açık bırakın </li><li> EN AZ 2 tam kutu sarı (10-200μl) pipet uçları </li><li> 1 kutu (100-1000μl) mavi pipet uçları </li></ul> Kültür Günü Not: * GECELİK UV İÇİN dışında kaldı ANYTHING TOUCH İÇİN EMİN OLUN! Kaputun altında steril bir ortamda bakımı çok önemlidir. 1) Set Up: Not: ** papain çözüm olmak için tüm dondurulmuş maddeler kenara koyun. <ol><li> % 70 EtOH Temizlik forseps. Her ucu steril bir sarı pipetlemeyin ucu ile kaplayın. Kendi kutusunda steril slayt yüzük yerleştirmek için kullanın. </li><li> Sıcak plaka: <ol><li> 1000ml beher 500-600ml dH 2 O ve büyük bir manyetik karıştırıcı çubuk dolu bir başlık altında bir mini-magnetic/hot tabak koyun. </li><li> Beher, su seviyesinin hemen üzerinde plastik bir disk yerleştirin. </li><li> Strafor disk küçük bir delik termometre kaydırın. Isı çevirmeli ihtiyacı biraz 2 &#39;nin üzerinde olması (34 ° C geçici bir) ve heyecan arama ~ 5-6 olmalıdır. </li></ol></li><li> PBS: <ol><li> Hazırlayın ve steril PBS (4-6 ml steril korumak için emin olun 15 15ml steril tüpler doldurmak. tekniği). </li><li> Kaputun yanında buz üzerinde tüpler ve stok şişe yerleştirin. </li></ol></li><li> Carbogen: <ol><li> Break yarısında 5ml stripette ve bir lastik tıpa ile itin stripette ucu stoper geniş ucunu dışarı taşacak. </li><li> 400-500ml dH 2 O (stripette kırık ucu IN dH 2 O olmalıdır) 500ml cam şişe içinde stoper yerleştirin. </li><li> Balonun yan açılışında bir tüp bağlayın. </li><li> Sarı bir pipet ucu kapalı kesin ve tüp sonunda (kesme yüzü dışarı bakacak şekilde) bağlayın. Carbogen tankı 5ml stripette ucu bağlayın. </li></ol></li><li> Papain sol&#39;n hazırlayın: <ol><li> * Dikkatli steril teknik kullanın. </li><li> 50ml steril bir tüp içinde karıştırın. </li></ol></li><li> Filtre ayrışma şişenin içine papain sol&#39;n: <ol><li> 25ml stripette (OR yer 20ml bir piston şırınga ucu yeni bir 0.2μm şırınga filtresi aracılığıyla Steriflip filtrasyon ünitesi ve disosiasyon flakon transfer kullanın. piston kaldırmak ve tüm şırıngaya papain sol&#39;n aktarmak için bir stripette (25ml) kullanabilirsiniz. </li><li> Filtre ayrışma şişenin içine). </li><li> Flakon kapağı, steril bir şırınga eklemek kap delikten ve şırınga tabanına 0.2μm steril bir şırınga filtre takmak. </li><li> Filtre ve parafilm bu yer carbogen bağlayın. Strafor disk / tutucu flakon yerleştirin. * Mikro-manyetik karıştırıcı hareket edilmelidir. * Gaz şişenin içine ZORUNLU. * Sıcaklık 34 stabilize ZORUNLU ° C </li></ol></li><li> Diseksiyon hazırlık: <ol><li> Kaputun altında diseksiyon mikroskobu getirin. </li><li> Tüm diseksiyon aletleri, alüminyum folyo Lay% 70 EtOH ile sprey, aşırı kapalı dökün ve kurumaya kaputun altında bırakın. </li></ol></li><li> Nöronal orta hazırlayın: <ol><li> Inkübatör taze nöronal orta 30ml bırakın. </li></ol></li><li> 1 büyük alüminyum folyo kare ve 12 küçük kareler yerleştirin. Alüminyum folyo ile baş kesme makası bırakın. Küçük bir strafor kutu buzlu su ile doldurun ve kaput tüm dışında bırakın. </li><li> Hazırlık anestezi (0.075ml ketamin ve 0.075ml xzylazine). </li><li> 100 plaka yavrular için en az 12 (P0-P2) alın. Fareler için, bütün çöp için bir genotip maç olduğundan emin olun. Genotipi bilinmeyen ise, ayrı bir kapta her yavru plaka hücreleri, fare numaraları doğru kayıtları tutmak ve onları maç hücre kültürü yemekleri ve glial substrat genetik arka plan hücre kültürleri tektip olduğundan emin olun. </li></ol> 2) Diseksiyon <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyonu ile ilk hayvan anestezisi. Hayvan sedasyon gösterir ve tail-flick testi yanıt vermiyor; 30 saniye (hipotermik kadar) buz koyun. Küçük bir alüminyum folyo kare, decap durulayınprogram akreditasyonunun makas, ve% 70 EtOH ile baş. </li><li> Başını kesmek, kafa alüminyum folyo kare üzerine düşebilir ve kaputun altında taşımak için izin verir. 15ml tüp içine buz gibi soğuk PBS bir beyin yavaşça çıkarın. Sonraki beyin çıkarırken geri buz tüpü yerleştirin. </li><li> Buz üzerinde 3 beyinleri vardır kadar bu ilk adımları tekrarlayın. Mikroskop altında ilk diseksiyon tabağa 3 beyin ve PBS dökün. Beynin ilgili bölümüne (MCM) çıkarın ve papain sol&#39;n segmentleri koymak için transfer pipetlemeyin kullanabilirsiniz. Ilk bölümler içeri Sayacı başlat </li><li> Tüm beyinleri papain sindirilir kadar önceki 3 adımları tekrarlayın. Sindirim için ortalama süresi 2 saat olmalıdır. Ilk bölümleri son olanları içeri zaman yaklaşık 1 saat olacak Fark bölmek deneyin. </li><li> * Sindirim sırasında: <ol><li> Banyo sıcaklığı 34 olduğundan emin olun ° C </li><li> Alanlar, ilk bakışta heyecan bar yapışabilir, ama zaman geçtikçe yaymak olmalıdır. Yoksa, flakonun alt dokunun. </li></ol></li></ol> 3) ezerek toz haline getirme: <ol><li> Bir transfer pipet kullanarak, steril bir 15ml tüp (aşırı papain sol&#39;n önlemek için deneyin) beynin bölümleri aktarmak ve onları inkübatör ısıtılmış glial orta 2ml 3 kez YIKAMA. Tüp içinde glial medya koyduktan sonra, bölümleri segmentler bozmadan yerleşmek ve sonra dikkatle mümkün olduğu kadar çok sol&#39;n kaldırmak için izin verir. Kontaminasyonu önlemek için pipetler değiştirin! ** Kaldırılır sol&#39;n tutmayın. </li><li> Taze bir transfer pipet kullanarak glial medya 2ml triturations başlar. Karışım 25 kez (hava kabarcıkları kiralanmasından önlemek) ve undissociated segmentleri yerleşmek kadar tüp 3 dakika oturup bekleyin. Altındaki segmentleri bozmadan mümkün olduğunca sol&#39;n TUTUN ve kaldırmak için bir transfer pipet kullanın. Yeni bir (steril) 15m tüp süpernatant tutun. </li><li> 1000μl pipet ve 200μl pipet kullanarak tamamen ayrışmış kadar önceki adımı yineleyin. </li><li> Bir transfer pipeti ile 10 kez Karışım veya hücreler tamamen sol&#39;n yeniden süspanse kadar. </li></ol> 4) Kaplama Hücreler <ol><li> Forseps her ucu kapsayan, steril bir sarı pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir çanak içinde de mümkün olduğunca cam merkezli bir slayt halka bırakın. </li><li> Hemasitometre ve sayım hücre çözümü 10μl koyun. (Önemsiz kitleler hariç tut). </li><li> Hücre sayısı 10 ile çarpın. Bu hücre / ml. Bu sayı 1,000,000-1,500,000 (veya istenilen yoğunluk) Böl. Bu çanak ortalama eklemek için ul sayısıdır. </li><li> Uygun ul / çanak eklemek gibi merkez her yemeğin yüzük slayt pipet kullanın. Hafifçe Plaka ve HER yemek için ipuçları geçiş. </li><li> 100μl (seyreltilmiş, GDNF sol&#39;n) her yemeğin slayt halka içine ekleyin. </li><li> Şu anda, inkübatör tepsileri ve soğuk oda nöronal orta getirmek. </li><li> Hücreleri gecede yerleşmek için izin ver. </li><li> Ertesi gün: kaldır halkaları (HER yemek için forseps ipuçları kapsayan yeni steril pipet uçları kullanarak) </li></ol> 5) Mitotik inhibisyonu: BİR SONRAKİ GÜN <ol><li> 1.8 ml steril MEM 200μl FDU stok ekleyerek 1000X stok 1:10 FDU alikotları sulandırınız. </li><li> Her yemeğin dışında halka 20μl seyreltilmiş FDU sol&#39;n ekleyin. Pipet uçları sık sık değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek. * Bir sonraki 7-10 gün için mümkün olduğunca az yemekler Rahatsız. Enfekte yemekleri için kontrol edin ve herhangi bir enfeksiyonun ilk belirtileri enfekte yemekleri kaldırmak. Kültürler 3 hafta içinde test etmek için hazırız. </li></ol> MEDYA / ÇÖZÜMLER Nöronal Orta (200ml için) Yıkar / öğütme için kullanmadan önce bir gecede şişeler glia klimalı ** En iyi <table style="width: 435px; height: 231px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> BSA% 5 </td><td> 0.5 g </td><td> Fraksiyon V </td></tr><tr><td> MEM sıvı </td><td> 94.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> DMEM sıvı </td><td> 80.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> F-12 sıvı </td><td> 20.0 ml </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glikoz 45% sıvı </td><td> 1.50 ml </td><td> Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Glutamin 200mm </td><td> 0.5 ml </td><td> Aliquotted Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Diporzio Conc. </td><td> 2.0 ml </td><td> Sigma çözümü </td></tr><tr><td> Sıvı Katalaz </td><td> 0.1 ml </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M Kynurenic asit </td><td> 200μl </td><td> 1N NaOH </td></tr><tr><td> HCL 5N </td><td> 50 ul </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Bir 250m maddeler (BSA son gider) ile birleştirinl plastik şişe. </li><li> Filtre, etiket ve buzdolabına kaldırın. </li></ol> Kynurenic Asit (FW = 189.2) 0,5 M = 94.6mg/ml 200μl STERİL alikotları 756.8mgKA/8ml 1N NaOH ve pipet: 8 ml stok olun DiPorzio Medya A) DiPorzio Conc. Hisse Senetleri: <table style="width: 620px; height: 251px;" border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> İHTİYACINIZ </td><td colspan="3"> Birleştirmek </td><td colspan="3"> Alliquot </td></tr><tr><td> Katkı </td><td> Çözücü </td><td> Tüp </td><td> Miktar </td><td> ml </td><td> ml / tüp </td><td> Kons. </td><td> Miktar </td><td> # Aliq. </td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 20mm HCL (1) </td><td> plastik </td><td> 250mg şişe </td><td> 10 </td><td> 1 </td><td> 25mg/ml </td><td> 25mg </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Hank </td><td></td><td> 500mg şişe </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 100mg/ml </td><td> 100mg </td><td> 5 </td></tr><tr><td> SOD </td><td> Hank </td><td></td><td> 70mg şişe </td><td> 14 </td><td> 1 </td><td> 5mg/ml </td><td> 5mg </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Hank </td><td></td><td> 50mg </td><td> 3 </td><td> 0,12 </td><td> 20mg/ml </td><td> 2.4mg </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Na 2 SeO 3 </td><td> Hank </td><td></td><td> 0.104mg </td><td> 10 </td><td> 0,5 </td><td> 10μg/ml </td><td> 5.2μg </td><td> 20 </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 10mM NaOH </td><td></td><td> 2mg </td><td> 10 </td><td> 0,1 </td><td> 0.20mg/ml </td><td> 0mg </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 100% EtOH </td><td> Cam </td><td> 12.5mg </td><td> 10 </td><td> 0,05 </td><td> 1.25mg/ml </td><td> Pipetlemeyin kullanın. </td><td></td></tr><tr><td> Kortizol </td><td> 100% EtOH </td><td> Cam </td><td> 20mg </td><td> 10 </td><td> 0,02 </td><td> 2.00mg / ml </td><td> Pipetlemeyin kullanın. </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 20mm HCl = 41.5μl kons. HCl/25ml. </li><li> 1mg/ml stok yapın ve 10ml için 104μl ekleyin. </li></ol> B) DiPorzio Medya Stok: <table style="width: 618px; height: 211px;" border="0"><tbody><tr><td> Katkı </td><td> Miktarı (ml) </td><td> Miktarı (ml) X2 </td><td> Final Conc. mg / ml </td><td> Final Conc. Molarite </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0,05 </td><td> 0,1 </td><td> 0,06 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Kortizol </td><td> 0,02 </td><td> 0,04 </td><td> 0,04 </td><td> 125nM </td></tr><tr><td> Hank BSS </td><td> 6,21 </td><td> 12,42 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnsülin </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 25 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 SeO 3 </td><td> 0,5 </td><td> 1 </td><td> 0,01 </td><td> 30nm </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 0,1 </td><td> 0,2 </td><td> 0,02 </td><td> 30nm </td></tr><tr><td> SOD </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 5 </td><td></td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 0,12 </td><td> 0,24 </td><td> 2,4 </td><td> 15nM </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 15ml steril tüp polipropilen, progesteron ve kortizol eklemek için kullanın. (Tüp EtOH sıvı aspire için çok dikkatli olmak, yarım ve yerde yarı yolda bozuldu 5ml stripette pipetlemeyin Kimwipes ile güvenli bir şekilde tutun ve sonra ucu getirmek: EtOH buharlaşma hızı, bir aspiratör pipetlemeyin ve vakum kullanın. tüp tarafında bulunan 500μl işareti. </li><li> Yukarıdaki grafikte göründükleri sırayla sonraki alikotları ekleyin. </li><li> Sol&#39;n bulutlu yapar insülin, eklenmesinden sonra, pH nötralize etmek için 1N NaOH 20μl ekleyin. Sol&#39;n sarı, pembe ve hemen açık gitmek gerekir. AYRICA, transferin yanı sıra sonra, hemen pH nötralize ve Çökelek oluşumunu önlemek için, 1N NaOH 20μl ekleyin. </li><li> 5 alikotları (tek parti) bir serolojik pipetlemeyin ve bölme içine 10ml çizin. </li><li> Store @ -20 ° C </li><li> 2 toplu bir seferde yapabilir. </li></ol> Disosiyasyon Medya A. Papain (1 şişe): ** Sağ diseksiyon önce kaplama güne hazırlayın. <table style="width: 536px; height: 156px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Tutar &lt;/ Strong&gt; </td><td> (Notlar) Final Conc. </td></tr><tr><td> Sistein Su </td><td> 7.8mL </td><td> 1mm sistein </td></tr><tr><td> Papain </td><td> Şişe (* 190μl değişir. 44.0mg/ml) </td><td> 20 adet / ml (toplam 400 adet sol&#39;n 20ml değerinde) </td></tr><tr><td> H &amp; B kons. </td><td> 2mL </td><td></td></tr><tr><td> Carbogen </td><td> % 95 O2 +% 5 CO2 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 5N </td><td> 10μl </td><td></td></tr><tr><td> % 0.5 fenol kırmızısı </td><td> 20μl </td><td> % 0.001 &#39; </td></tr><tr><td> 0.5M Kynurenate </td><td> 10μl </td><td> (1N NaOH) 0.5mm </td></tr></tbody></table><ol><li> İLK sistein su papain ekleyin. </li><li> H &amp; B kons. Kynurenate, HCl ve fenol kırmızısı ekleyin. </li><li> Disosiasyon flakon içine Filtresi (set-up yönde açıklandığı gibi) ve carbogen bağlanmak. </li></ol> B. H &amp; B Konsantre (5X 100 ml): <table style="width: 583px; height: 243px;" border="0"><tbody><tr><td> Malzemeler </td><td> MW </td><td> Powder/50ml H 2 O </td><td> Kons. (M) </td><td> Birleştirin (ml) </td><td> Final Conc. (MM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 11,699 g </td><td> 4 </td><td> 14,5 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 3,728 g </td><td> 1 </td><td> 2,7 </td><td> 5,4 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 4.2 g </td><td> 1 </td><td> 13 </td><td> 26 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 * H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 6,90 g </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 120,38 </td><td> 6,019 g </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EDTA (ED2 SS) </td><td> 292 </td><td> Sigma% 5 (make 5g/100ml stok) </td><td> 0,134 </td><td> 0,3722 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 180 </td><td> Sigma 45% </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TC H 2 O </td><td></td><td></td><td></td><td> 62,93 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Miktarlarda stok çözümleri birleştirin. </li><li> 4ml alikotları içine bölün. </li><li> Kısım papain ekledikten sonra sistein su ekleyin. </li></ol> C. Sistein Su (1X bir 157.5ml): <table style="width: 644px; height: 137px;" border="0"><tbody><tr><td> Malzemeler </td><td> MW </td><td> Bileşenleri Toz (mg) </td><td> H 2 O (ml) </td><td> Stok Conc (mM) </td><td> Birleştirin (ml) </td><td> Final Conc. (MM) </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 147,2 </td><td> 736 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> 0,6 </td><td> 1.9mM </td></tr><tr><td> Sistein </td><td> 121,7 </td><td> (1.5) </td><td> 24 </td><td> 20mm (0.02M) </td><td> 10 </td><td> 1.27mM (0.88) </td></tr><tr><td> TC su </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 146,9 </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> Ve 4, 0,5 M CaCl2 stok sol&#39;n tutmak ° C </li><li> Sistein bir kullanım sol&#39;n olun ve diğer maddeler ile birleşerek </li><li> 4 mağaza 15.75 ml ve 10 alikotları içine Böl ° C </li></ol> GDNF Hazırlık <ol><li> Kısım hazırlık: <ol><li> 2.4mL steril deiyonize su, 5μg GDNF steril, liyofilize pelet çözülür. Bu GDNF sol&#39;n = 2.08μg/mL konsantrasyon. </li><li> 2.08μg/mL GDNF sol&#39;n steril cryovials 76.9μl alikotları içine dağıtın. Bu = 160ng vialde. </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza </li></ol></li><li> Kültürlere Ek: <ol><li> Her 8 yemekler için 1 kısım çözülme. </li><li> 723.1μl nöronal medya / kısım ekleyerek kısım sulandırınız. Bu 160ng/800μl GDNF bir sol&#39;n yapacaktır. </li><li> Bu sol&#39;n ml başına 10ng GDNF son bir konsantrasyon için her çanak orta 2mL 100μl ekleyin. </li></ol></li></ol> FDU Hazırlık FDU-sol&#39;n 1000X Stok: <table style="width: 564px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td><td> (Notlar) Final Conc. </td></tr><tr><td> Üridin </td><td> 247 mg </td><td> 16,5 mg / ml </td></tr><tr><td> 5-FDU (5 fluorodeoxyuridine) </td><td> 100 mg (şişe) </td><td>6.7 mg / ml </td></tr><tr><td> TC Su </td><td> 15 ml </td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> 15 ml 16,5 mg / ml üridin biraz üzerinde olun. </li><li> 6.7 mg / ml sol&#39;n FDU, 15 ml üridin sol&#39;n FDU 100 mg şişe ekleyin. </li><li> -20 ° C 200μl alikotları ve donma içine Böl </li></ol> Kullanım sulandırınız: <ol><li> Non-nöronal hücrelerin büyümesini engeller. 1.8 ml MEM 200μl stok ekleyerek 1000X stok 01:10 sulandırınız. </li><li> 20μl seyreltilmiş FDU her yemeğin dışında halka ekleyin. Sık sık pipetlemeyin ipuçları değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek. </li></ol>

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

Burada açıklanan yöntemler, aksi bir sistemik veya in vivo yaklaşım mevcut değildir merkezi dopamin nöronlar morfolojik ve nörokimyasal özellikleri ince çözümü için izin .

Malzemeler protokol metninde yer almaktadır.

kemirgen yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin hücre kültürleri

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

Beyin başka sistemik girişi, izolasyon dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için, dopamin nöronlar primer hücre kültürleri oluşturma yeteneği sağlar. Bizim laboratuvarda, karbon fiber amperometri, kantitatif PCR ve immünhistokimya kullanarak dopamin ilgili genler ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri yanı sıra dopamin salınımını kinetiğini değerlendirmek için bu nöronların kullanın. Biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin üretmek nasıl Bu videoda, size gösteriyor. Bu süreç kortikal glial astrositler kaplama, klima glial substrat nöronal hücre kültür ortamı, yenidoğanlarda Ortabeyin diseksiyonu, sindirim, ekstraksiyon ve dopamin nöronlarının kaplama ve nörotrofik faktörlerin eklenmesi de dahil olmak üzere birkaç adım içerir hücre sağkalım sağlamak. Böyle bir hazırlık için uygun uygulamalar elektrofizyoloji, immünhistokimya, kantitatif PCR, video mikroskobu (yani, plazma zarı ile gerçek-zamanlı veziküler füzyon), hücre canlılığı deneyleri ve diğer toksikolojik ekranları içerir.

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Dopamin nöronlarının primer hücre kültürlerinin oluşturulabilmesi, dopamin nöronlarının presinaptik özelliklerinin izole bir şekilde incelenmesine olanak tanır...

Merhaba, ben Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Farmakoloji ve Deneysel Terapötikler bölümündeki Emmanuel Pothos Laboratuvarı'ndan Lauren Frank. Ben de Emmanuel Pothos. Bugün size, yeni doğmuş kemirgenlerden primer orta beyin dopamin hücresi kültürleri oluşturma prosedürünü göstereceğiz.Bu prosedür; araçların ve reaktiflerin hazırlanması, P0 ile P2 arasındaki kemirgen beyinlerinin orta beyninin diseke edilmesi, beyin segmentlerinin tatil edilmesi ve disosiye edilen nöronların ekilmesi adımlarını içermektedir. Haydi başlayalım.Bu prosedürde, dopamin nöron kültürü oluşturulmadan iki ila üç hafta önce gerçekleştirilmesi gereken bir dizi hazırlık adımı bulunmaktadır; glial hücrelerin çoğalması ve kapların tabanını kaplaması için yeterli zaman tanıyan ekim işlemi önceden yapılmalıdır. Primer dopamin nöronlar, primer nöronal hücre kültürü işleminin bir ila yedi gün öncesinde, tek katmanlı glial hücrelerin üzerine kültüre edilecektir. AC kültürü yapmadan bir gün önce, glial hücrelerdeki besiyeri uzaklaştırılmalı ve yerine iki mililitre taze nöronal besiyeri eklenmelidir; disseksiyon aletleri hariç tüm malzemeler, 12 disseksiyon plakası da dahil olmak üzere, UV ışığı kullanılarak sterili

primary-dissociated-midbrain-dopamine-cell-cultures-from-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

Bu video, fare embriyonik beyin dokusundan dopaminerjik nöronların yetiştirilmesi için bir yöntemi özetlemektedir. İşlem, orta beynin proteolitik bir enzim ile tedavi edilmesini, hücrelerin ayrılmasını ve büyümeleri ve uzun süreli yaşayabilirlikleri için antibiyotiklerle besin açısından zengin bir ortamda polimer kaplı lameller üzerinde kültürlenmesini içerir.

Fare Embriyonik Beyin Dokusundan Dopaminerjik Nöronların Kültürlenmesi ve Bakımı

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, alfa-sinüklein önceden oluşturulmuş fibrillerle önceden tedavi edilmiş embriyonik fare dopamin nöronlarında alfa-sinüklein birikimini ölçme sürecini göstermektedir. İmmünofloresan kullanarak alfa-sinüklein agregatları içeren dopamin nöronlarını sabitleme, boyama ve nicelik belirleme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Primer Embriyonik Fare Dopamin Nöronlarında Alfa-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminerjik nöronlar beyinde hayati bir düzenleyici rol oynar. Kayıpları Parkinson hastalığı ile ilişkilidir. Bu videoda, embriyonik fare mezensefalondan merkezi dopaminerjik nöronların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu tür kültürler, bu nöronların çeşitli streslere karşı aşırı savunmasızlığını incelemek için yararlıdır.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Burada, birincil fare dopamin nöronlarında nöronal α-sinüklein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sıyoruz. Nöronlarda fosforial α-sinüklein agregaları önceden oluşan α-sinüklein fibrilleri ile indüklenir. İmmünfloresan etiketli hücrelerin otomatik görüntülemesi ve tarafsız görüntü analizi, bu sağlam protokolü α-sinüklein birikimini engelleyen ilaçların orta-yüksek iş akışı taraması için uygun hale getirilmiştir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

Öğrenin, kemirgen yeni doğanlardan primer orta beyin dopamin hücre kültürleri oluşturma yöntemini. Bu teknik, dopamin salınım kinetiğini incelemek ve sinirbilim araştırmaları için değerli bir model sunar.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Daha fazla video keşfet