Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Merhaba, ben Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Farmakoloji ve Deneysel Terapötikler bölümündeki Emmanuel Pothos Laboratuvarı'ndan Lauren Frank. Ben de Emmanuel Pothos. Bugün size, yeni doğmuş kemirgenlerden primer orta beyin dopamin hücresi kültürleri oluşturma prosedürünü göstereceğiz.

Bu prosedür; araçların ve reaktiflerin hazırlanması, P0 ile P2 arasındaki kemirgen beyinlerinin orta beyninin diseke edilmesi, beyin segmentlerinin tatil edilmesi ve disosiye edilen nöronların ekilmesi adımlarını içermektedir. Haydi başlayalım.

Bu prosedürde, dopamin nöron kültürü oluşturulmadan iki ila üç hafta önce gerçekleştirilmesi gereken bir dizi hazırlık adımı bulunmaktadır; glial hücrelerin çoğalması ve kapların tabanını kaplaması için yeterli zaman tanıyan ekim işlemi önceden yapılmalıdır. Primer dopamin nöronlar, primer nöronal hücre kültürü işleminin bir ila yedi gün öncesinde, tek katmanlı glial hücrelerin üzerine kültüre edilecektir. AC kültürü yapmadan bir gün önce, glial hücrelerdeki besiyeri uzaklaştırılmalı ve yerine iki mililitre taze nöronal besiyeri eklenmelidir; disseksiyon aletleri hariç tüm malzemeler, 12 disseksiyon plakası da dahil olmak üzere, UV ışığı kullanılarak sterilize edilmelidir.

Mikro manyetik karıştırıcı çubuk içeren iki adet disosyasyon tüpü. Üst kısımlarında iki küçük delik açılmış iki adet tüp kapağı. Yayılmış sürgü halkaları.

Ve lam halkası kutusunun açık bırakıldığından emin olun. Tüm bu araçlar, kültürleme gününde işleme başlanmadan önce %70 etanol ile kaplanır. İlk olarak, primer nöron çözeltisini ayrıştırmak için kullanılacak pepane çözeltisinin tüm bileşenlerini dondurucudan çıkarın ve çözülmelerini bekleyin.

Sindirimi gerçekleştirmek için bir beher sudaki suyu 34 °C'ye ısıtacak şekilde bir ısıtıcı tabla kurun ve pepane solüsyonunun oksijenasyonu için karbogenle doyurulmuş su hazırlayın. Sindirim sırasında, diseksiyon öncesinde beyinlerin yıkanması için her biri dört ila altı mililitre steril PBS ile doldurulmuş 15 steril tüp hazırlanarak buz üzerine yerleştirilir. 20 ila 30 mililitre taze nöronal medyum ayrılıp inkübatöre yerleştirilir.

Ardından, pepane solüsyonunu filtrelemek için steril bir çevirmeli filtrasyon ünitesi kullanılarak disosiyasyon tüpü hazırlanır ve solüsyon, 25 mililitrelik bir şırınga ile disosiyasyon tüpüne aktarılır. Tüpün kapağını kapatın, kapağa bir delik açarak steril bir şırınga yerleştirin ve bunu 0,2 mikronluk bir filtreye bağlayın. Karbogeni filtreye bağlayın ve parafilm ile sabitleyin. Tüpü strafor diskine yerleştirin.

Disosyasyon tüpü yerleştirildikten sonra, manyetik karıştırıcının hareket ettiğinden emin olun. Gaz tüpün içine girmekte ve sıcaklık 34 °C değerinde sabitlenmiş durumdadır. Diseksiyon mikroskobu çeker ocağa getirilir ve diseksiyon aletleri alüminyum folyo üzerine dizilir.

Ardından, bir adet büyük alüminyum folyo karesi ve 12 adet daha küçük kare hazırlayın. Alüminyum folyoyla yapılacak kafaları kesme işlemi için bir makas bırakın. Çeker ocak dışına buzlu su içeren bir strafor kutu yerleştirin.

Ardından, 0,075 mililitre ketamin ve 0,075 mililitre xylazine karışımından oluşan anesteziyi hazırlayın. Daha sonra, 23 milimetrelik cam kuyucuklu 135 milimetrelik plaklar için en az 12 adet P0 ile P2 arasındaki yavru fare temin edin. Fareler için tüm batının genotipinin eşleştiğinden emin olun.

Genotip bilinmiyorsa, her hayvandan alınan hücrelerin ayrı kaplara ekilmesi ve hücrelerin daha sonraki genotipleme sonuçlarıyla eşleştirilmesi için doğru kayıtların tutulması gerekecektir. Diseksiyona başlamak için, ilk hayvanı intraperitonal ketamin Xylazine enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Hayvan kuyruk çekme testine yanıt vermediğinde, hipotermik olana kadar 30 saniye boyunca buzlu suya yerleştirin.

Ardından, diseksiyon sırasında beyin dokusunun kontamine olmasını önlemek için bir küçük alüminyum folyo karesini, ensektomy makasını ve hayvan başını %70 etanol ile durulayın, makasla başı kesin, başın alüminyum folyo karesinin üzerine düşmesini sağlayın ve folyoyu çeker ocak altına taşıyın. Önce küçük makasla deriyi keserek kafatası açığa çıkardıktan sonra beyni nazikçe çıkarın. Kafatasının çevresini 360 derece kesin.

Ardından, kafatası kapağını pensetle soyarak çıkarın. Beyni küçük bir spatula yardımıyla kafatasından kaldırın ve buzlu PBS içeren 15 milliliter tüpüne yerleştirin. Bir sonraki beyni çıkarmadan önce tüpü tekrar buza koyun.

Buz üzerinde ayrı tüplerde üç beyin elde edene kadar diseksiyonları tekrarlayın. Bir beyini ve PBS'yi ilk diseksiyon kabına boşaltın. Mikroskop altında, bıçağın keskin kalması için beyni yastık görevi görecek bir sill guard yapıştırıcı platform üzerine yerleştirin.

Segmentleri pepain çözeltisine aktarmadan önce yıkamak için bir transfer pipeti kullanarak segmentleri taze PBS içeren bir tüpe yerleştirin. İlk segmentler yerleştirildiğinde bir zamanlayıcıyı başlatın ve tüm beyinler papain içinde sindirilene kadar diseksiyonlara devam edin.

İlk beyin segmentleri yaklaşık bir saat boyunca sindirilmiş olacaktır. Son segmentler eklendiğinde, sindirim sürecinin bir saat daha devam etmesine izin verin. Pepane banyosundaki sıcaklığın 34 °C'de sabitlendiğinden emin olun.

Titrasyon adımına başlamak için, beyin segmentlerini steril bir 15 mililitrelik tüpe yerleştirmek üzere bir transfer pipeti kullanın. Fazla pepane solüsyonunu taşımaktan kaçınmaya çalışın. Ancak, bu durum gerçekleşirse, fazla pepaneyi uzaklaştırın.

Ardından, inkübatörden alınan iki mililitre ısıtılmış nöronal ortam ekleyerek segmentleri yıkayın. Segmentlerin çökmesini bekleyin ve ardından segmentleri rahatsız etmeden solüsyonun mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın. Toplamda üç yıkama gerçekleştirin.

Kontaminasyonu önlemek için her yıkama arasında pipetleri değiştirmeyi ve her seferinde yeni bir pipet transferi kullanmayı unutmayın. İterasyonlara iki mililitre nöronal medya ile başlayın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek 25 kez triture edin.

Ardından, ilişkilendirilmemiş segmentlerin üç dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Alttaki segmentleri rahatsız etmeden, mümkün olduğunca fazla süpernatant toplamak için bir transfer pipeti kullanın. Süpernatantı yeni, steril bir 15 mililitrelik tüpte saklayın.

Önce 1000 µL'lik, ardından 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak önceki adımı tekrarlayın; bu işlemin ardından segmentler gözle tamamen ayrışmış görünmelidir. Tüm işlemlerden elde edilen süpernatan aynı 15 mL'lik tüpe toplanır. Hücreleri ekime hazır hale getirmek için, sayım öncesinde homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek amacıyla hücreler bir transfer pipetiyle son olarak 10 kez altüst edilir.

Forsepslerin her bir ucunu kapatacak şekilde steril sarı pipet ucu kullanın. Bir lam halkasını, cam yüzeye mümkün olduğunca merkezli olacak şekilde dikkatlice bırakın. Her bir kapta, bu halkalar nöronların ekileceği kültür kabı içindeki bir alanı izole etmek için kullanılacaktır.

Pipet ucunu kullanarak her bir kabın merkez kuyusunun üzerine halkaları kaydırın. Ardından, uygun hacimdeki hücreleri nazikçe kaba ekleyin. Hücreleri, kaba daha önce yerleştirdiğiniz halkanın merkezine ekleyin.

Her kap için uçları değiştirmeyi unutmayın. Ardından, nöronların proliferasyonuna yardımcı olmak için her kabın halkasının dış kısmına mümkün olduğunca yakın bir yere 100 µL seyreltilmiş GDNF çözeltisi ekleyin. Sonrasında, glial hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için halkanın dışına mitoz inhibitörü fluoro dioxine veya FDU eklenir.

Pipet uçları genellikle inkübatöre geri konur ve hücrelerin gece boyunca çökmesine izin verilir; ertesi gün steril pipet uçları kullanılarak penslerin uçları kapatılır, halkalar çıkarılır, kaplar inkübatöre geri konur ve deney zamanı gelene kadar mümkün olduğunca az rahatsız edilir. Kaplar olası kontaminasyonlar için günlük olarak kontrol edilmeli ve kontaminasyon gözlemlenirse sorunlu kaplar derhal uzaklaştırılmalıdır. Kültürler üç hafta içinde elektrofizyoloji, moleküler biyoloji deneyleri ve immünosito kimya için kullanıma hazır hale gelir.

Hücreler ekildikten sonra, kültürdeki hücrelerin bazı temsili örneklerine bakalım. Burada, 14 gün önce ekilmiş bir primer kültüre bakıyoruz. Bu, hücre gövdelerinin belirgin olduğu ve bunlardan uzanan uzantıların görülebildiği iyi bir kültür örneğidir.

Ek olarak, kapta herhangi bir enfeksiyona işaret edecek küf veya fungal büyümenin olmadığını kontrol edin. Kemirgen neonatlarından primer disosiye orta beyin dopamin hücresi kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken; steril bir ortamın korunduğundan emin olmak, yalnızca P0 ile P2 arasındaki neonatları kullanmak, glial kondisyonlu medya ile glial substratlar üzerine ekim yapmak ve tutarlı bir ekim yoğunluğu sağlamak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.