Name: MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC: (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Keşfedin, besleyici hücre içermeyen koşullarda insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) bakımını ve sürekli pasajlama tekniklerini. Bu yöntem, pluripotentlik değerlendirmesi için immünofloresan mikroskopi kullanarak kök hücre biyolojisi araştırmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.

hESC kültür günlük bakım <ol><li> hESC kültür ortamı, her 24 saatte bir değiştirilmesi gerekir. 4 ° C&#39;de depolanan ES medya stok şişesi, gerekli (6 plaka başına ~ 20ml) çözüm miktarı 50ml şahin tüp içindeki yeri ve bir su banyosunda 37 ° C sıcak çıkarın. Medya ısındı sonra, nihai konsantrasyonu 10 ng 4 saklanan bFGF ° C ekleyin. 4 ° C, kullanımdan hemen sonra geri bFGF stok koy! </li><li> 6 kuyucuğu çıkar ama medya 500μl ~. Girdap enkaz kaldırma için askıya alma kültürü çanak emin olun. BFGF hESC kültür ortamı iyice karıştırılır emin olun ve her bir kuyu için 6 plaka taze medya 3ml ekleyin. Inkübatör plaka geri koyun. </li></ol> Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC Genellikle MEFS üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka 6-kuyucuğu, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma ile Matrigel üzerine 1:3 1:2 bölünmüş olabilir. <ol><li> Matrigel, MEF-klimalı ortam (CM) üzerine yarma hESC pluripotency korumak için kullanılır. MEF-klimalı ortamları önceden yapılır. Ilk gününde, 1.5 × 10 7 γ-ışınlanmış MEFS T75 bir balona numaralı seribaşı . Ikinci gününde, oda sıcaklığında 1 × PBS, pH 7.4 ile MEFS kez yıkanır ve sonra 5ng/ml bFGF ile desteklenmiş ES medya 15ml erlene eklenir. (NOT: MEFS daha küçük veya daha büyük şişeler içine kaplı olabilir ama, hücre yoğunluğu ve ES medya hacmi arasındaki oran sabit olmalıdır.) Balon başka bir 24 saat 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Üçüncü gününde, CM 15ml 5ng/ml bFGF ile desteklenmiş taze ES medya ile toplanır ve değiştirilir. Toplanan CM 4 ° C&#39;de saklanır. MEFS bir kaplama MEF klimalı ortam oluşturmak için 15 × 7 = 105ml birbirini takip eden yedi gün içinde hasat edilir. Yedi gün sonra, tüm CM fraksiyonları birleştirilir, steril, filtreli, aliquoted ve -20 ° C&#39;de saklanan 1 ay boyunca saklanabilir ve kullanılabilir açıklandığı gibi CM medya hazırladı. </li><li> HESC bölme bir gün önce, 4 ° C gecede Çözülme Eppendorf tüpleri Matrigel alikotları koymak (bir kısım Matrigel, 76.2mg içerir ve bu bir adet 6-plaka için gerekli miktarı). Bölme gününde, bir adet 6-plaka çözülmüş Matrigel bir flakon buz üzerinde soğuk DMEM/F12 medya şişe ve 6ml koymak. Matrigel DMEM/F12 ortama aktarın ve iyice karıştırın. 6 plaka her iyi çözüm 1ml ekleyin. Swirl plaka yüzeyinde Matrigel dağıtmak ve bölme hESC önce en az 1 saat süreyle oda sıcaklığında Matrigel kaplı plaka kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> MEFS üzerinde hESC 1 × PBS, pH 7.4 ile bir kez yıkanır. Daha sonra sıcak kollajenaz IV (1mg/ml) 1ml 6-plaka her kuyuya ilave edilir ve plaka 37 inkübe ° C&#39;de 5-10 dakika. </li><li> Her kuyuya bFGF olmadan ES medya 1ml ekleyin. Tabak kapatın kök hücreler uçurmak için 1 ml pipet kullanın. 50ml şahin tüpe hESC ve ölü MEFS kümeleri içeren tüm medya toplayın. MEFS süpernatantı asılı kalırken hESC kümeleri tüpün alt kısmındaki bir granüle böylece hücrelerin büyük öbekler 5-10 dakika razı olsun. Süpernatantı atın ve 5 dakika boyunca 200 gr oda sıcaklığında santrifüj bFGF eksik ES medyayı kullanarak hESC pelet resuspending yıkayın. </li><li> Matrigel plakalar üzerinde kök hücreler plaka için, ilk önce oda sıcaklığında DMEM/F12 (iyi ortalama 1 ml) ve ortalama 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyerek Matrigel plakaları ile yıkayın. Yığınları düzgün ve boyut olarak küçük olana kadar 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı birkaç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacim pelletini tekrar. Kısım Matrigel plaka üzerinde de ortalama 0.5 ml süspansiyon. Matrigel koloninin yoğunluğu MEFS olağan bölerek yoğunluğu kolonilerin daha yüksek olduğunu unutmayın. 37 ° C doku kültürü inkübatör tabak koyun. </li><li> Matrigel üzerinde hESC korumak için, 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM medya 4-5 gün kadar her 24 saatte bir değiştirilir. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Bu video nasıl geçit hESC MEF plakalardan besleyici, hücre Matrigel plakaları göstermektedir. Matrigel koloninin yoğunluğu MEFS olağan bölerek yoğunluğu kolonilerin daha yüksek olduğunu unutmayın. Ekim-4 ve SSEA-4, hESC pluripotency belirteçleri, immünofloresan boyaması ve mikroskobu veya flow sitometri besleyici-kültür koşullarında farklılaşmamış bir devlet hESC bakım onaylamak için ihtiyaç vardır.

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reaktif</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reaktif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reaktif</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin </td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Reaktif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 antikoru</td><td>Reaktif</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;erythrin Konjuge Fare IgG3</td><td>Reaktif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC konjuge anti-tavşan IgG</td><td>Reaktif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

mefs matrigel 2 matrigel üzerine mefs yarma hesc:

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Bu video MEF plakaları geçiş hESC nasıl fare embriyonik fibroblast besleyici hücre ücretsiz Matrigel plakaları (MEF) besleyici hücreler, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir.

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 2

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreleri üzerinde nasıl büyütüleceğini ve hESC'lerin MEF'den nasıl pasajlanacağını göstermektedir...

İnsan embriyonik kök hücre kültürünü sürdürmek için, kültür medyumunun her 24 saatte bir değiştirilmesi gerekir. Bunun için, dört °C'de saklanan bir embriyonik kök hücre medyum stok şişesi ile başlayın. Genellikle altı kuyucuk başına yaklaşık 20 mL olan gerekli çözelti miktarını alın.Çok kuyucuklu plakayı hazırlayın ve bu miktarı 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın; ardından tüpü ve içeriğini bir su banyosunda 37 °C'ye kadar ısıtın. Besiyeri ısındığında, 4 °C'de saklanmış olan FGF'yi nihai konsantrasyonu 10 ng/mL olacak şekilde ekleyin. BFGF stok çözeltisini kullanımdan hemen sonra tekrar 4 °C'ye koymayı unutmadığınızdan emin olun.İnsan amox kök hücre kültür medyumundaki BFGF'nin iyice karıştırıldığından emin olun. Ardından, her kuyucukta yaklaşık 500 microliters kalacak şekilde medyumun tamamını uzaklaştırın. Sonrasında, altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna üç mililitre taze medyum ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin.İnsan embriyonik kök hücrelerinin ONM'ler üzerinde nasıl kültüre edileceğini gösterdiğimize göre, şimdi onları matrigel'e nasıl aktaracağınızı göstereceğiz. ONM'lerde büyütülen insan embriyonik kök hücrelerini matrigel'e bölmek için, mes üzerindeki konfluen bir altı kuyucuklu kök hücre plakasıyla başlarız; bunlar matrigel içeren altı kuyucuklu plakalara bir e iki veya bir e üç oranında bölünebilir.Bu işlem, kuyucukların ayırma işleminden dört ila beş gün sonra tekrar konfluans haline gelmesini sağlayacaktır. İnsan embriyonik kök hücrelerini matrigel üzerine ayırırken, pluripotensiyi korumak için meth kondisyonlu besiyeri kullanın; meth kondisyonlu besiyeri önceden hazırlanır. Bu işlem, büyüyen bir meth kültüründen yedi gün boyunca her gün, mililitre başına beş nanogram BFGF ile desteklenmiş besiyerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir; uzaklaştırılan meth kondisyonlu besiyerinin yerine embriyonik kök hücre besiyeri kullanılır.Her gün. Met kondisyonlu ortam, toplandıktan ve dondurularak saklandıktan sonra en fazla bir ay boyunca kullanılmalıdır. İnsan embriyonik kök hücresi bölme işleminin bir gün öncesinde, EOR tüplerindeki matrigel alikotlarını gece boyunca çözünmeleri için -20 °C'den 4 °C'ye taşıyoruz.Bir alikot, bir adet altılı kuyucuklu plak için gereken miktar olan iki miligram matri gel içerir. Ayırma gününde, çözülmüş matri gel viallerinden birini alın.Her altılı kuyucuk plakası için her flakonu altı mililitre soğuk D-M-E-M-F 12 besiyeri ile karıştırın. Bunu buz üzerinde tutmayı unutmayın. Çözeltiden bir mililitreyi altılı kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin.Ardından, matrigeli yüzeye yaymak için plakayı dairesel hareketlerle sallayın ve insan embriyonik kök hücrelerini ayırmadan önce matrigel kaplı plakayı oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. İnsan embriyonik kök hücrelerini ayırmadan önce, MES üzerindeki kök hücreleri bir kez XPBS pH 7.4 ile yıkayın. Sonra, ayırma işlemi yapacağınız her bir kuyucuğa 1 mg/mL konsantrasyonunda bir mililitre ılık kollajenaz dört ekleyin ve ardından plakayı 37 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa bFGF içermeyen bir mililitre embriyonik kök hücre medyumu ekleyin. Kök hücreleri plakadan uzaklaştırmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Kök hücre kümelerini ve ölü mezleri içeren tüm medyumu 15 mililitrelik bir falcon tüpüne toplayın. Kök hücre kümeleri tüpün dibinde bir pelet oluştururken mezlerin süspansiyon halinde kalması için büyük hücre kümelerinin beş dakika boyunca çökmesini bekleyin.Hücreler çökmüş göründüğünde, süpernatantı atın ve embriyonik kök hücre peletini yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. BFGF içermeyen embriyonik kök hücre medyası kullanarak, oda sıcaklığında 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler santrifüj edilirken, plakaları kuyu başına 1 ml oda sıcaklığındaki D-M-E-M-F 12 ile yıkayarak ve 10 ng/ml ile desteklenmiş 2,5 ml kondisyonlu medya ekleyerek kök hücre ekimi için matrigel plakalarını hazırlayabiliriz.Santrifüj sonrası kuyu başına BFGF. Peleti, 10 ng/mL BFGF ile desteklenmiş uygun hacimdeki meth kondisyonlu medyumda yeniden süspanse edin; hücre topakları homojen hale gelip boyutları küçülene kadar hücre süspansiyonunu pipetle birkaç kez çekip boşaltın.Ardından, final hacmi her kuyucuk için 3 ml olacak şekilde, matrigel plakadaki kuyucuklara süspansiyondan 0,5 mililitre씩 paylaştırın. Matrigel için, hücreler eklendikten sonraki standart pasajlama işlemlerine kıyasla daha yüksek bir koloni yoğunluğu kullanırız. Plakayı 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.İnsan embriyonik kök hücrelerini matrigel ortamında sürdürmek için, 10 ng/mL bFGF ile desteklenmiş besiyeri dört ila beş güne kadar her 24 saatte bir değiştirilir.İnsan embriyonik kök hücreleri, matrigel üzerindeki ilk pasajdan sonra genellikle kalıntı miktarlarda MEF ile kontamine olur; matrigelden matrigele yapılan ikinci pasaj, kök hücre kültürünü kontamine eden besleyici hücrelerin tüm izlerini tamamen ortadan kaldıracaktır.

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm...

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Keşfedin, besleyici hücre içermeyen koşullarda insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) bakımını ve sürekli pasajlama tekniklerini. Bu yöntem, pluripotentlik değerlendirmesi için immünofloresan mikroskopi kullanarak kök hücre biyolojisi araştırmalarına olanak tanır.

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

Daha fazla video keşfet