Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Caldwell Laboratuvarı, diğer adıyla Worm Shack'te, deniz zarafetindeki nörolojik hastalık mekanizmalarını inceliyoruz. Ve verimli deneylerle geçen uzun bir günün ardından, kendimizi bazı eğlence aktiviteleriyle ödüllendiriyoruz. Merhaba, ben Adam Knight, Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Calwell Laboratuvarı'ndan lisans öğrencisiyim.

Bugün, ben ve diğerleri, C Elegants'ta bir dopamin nöron dejenerasyon testinin nasıl yapılacağını göstereceğiz. Aday hastalıkla ilgili genleri ve dopamin nöronlarını aşırı eksprese eden transgenik suşlarla bir dopamin nörodejeneratif solucan türünü geçeceğim. Merhaba, ben Adam Harrington, Caldwell Laboratuvarı'nda yüksek lisans öğrencisiyim.

Bugün size dopamin nöron analizi için transgenik solucanları nasıl kuracağınızı göstereceğim. Merhaba, ben Shu Amichi ve yüksek lisans öğrencisiyim. Burada size, ceps ve yardımcılar olarak adlandırılan C zarafetindeki dopamin nöronlarınıza nasıl gireceğinizi göstereceğim.

Genel olarak, dopamin nöronlarında sadece GFP eksprese eden solucanlar hücre ölümü göstermezler. Bununla birlikte, CLE varlığında, bunları ve yaşa bağlı nörodejenerasyonu gözlemleyeceksiniz Bu testi kullanarak, CLE kaynaklı toksisiteyi artırıp artıramayacağını veya baskılayıp baskılayamayacağını belirlemek için dopamin nöronlarında bir transgen birlikte eksprese edilebilir. Öyleyse başlayalım.

Dopamin nöron analizini gerçekleştirmeden önce, dopamin nöronuna özgü promotör dat one'ın kontrolü altında hem alfa çekirdeğini hem de GFP'yi eksprese eden sekiz değirmeni çiftleşme plakasına yerleştirmeye başlamak için önce uygun GaN suşlarını çaprazlamalıyız. Şimdi, ilgilendiğimiz aday genin dopamin nöron spesifik ekspresyonunu sergileyen iki L dört aşamalı transgenik kafrodit ve ayrıca DS kırmızı iki floresan seçilebilir markörün vücut duvarı kas hücresi ekspresyonunu ekleyin. Her transgen yapısı için üç kararlı transgenik hat oluşturduğumuza dikkat etmek önemlidir.

Dolayısıyla bu genetik çaprazlama, oluşturulan üç ayrı kararlı çizginin her biri için ayrı ayrı gerçekleştirilmelidir. İki gün sonra, iki ila üç gün daha sonra erkekleri çıkarın ve atın. F1 neslini inceleyin.

Birkaç erkek döl var ve çiftleşme başarılı oldu. Daha sonra, hem erkek ebeveynden miras alınan GFP floresan markörü hem de hamadi ebeveyninden miras alınan DS kırmızı iki floresan vücut duvarı kas markörü sergileyen her çaprazlamadan dört hayvanı Afrodit L'den beşi ayrı ayrı yeni plakalara aktarın. Transfer edilen hayvanların, henüz M it'e sahip olmadıklarından emin olmak için L dört aşamasında olmaları gerekir.

Tabakta erkek hayvanlar varken, F iki döl üretmek için hayvanların üç ila dört gün boyunca kendi kendine döllenmesine izin verin. Şimdi bunu yapmak için F iki dölünü temizleyin. Her iki yüzde işaretini de sergileyen beş ila 10 hayvanı kendi plakalarına aktarın.

Daha sonra, hayvanların yüzde yüzünün dopamin nöronlarında GFP'yi eksprese ettiği ve bazı hayvanların DS kırmızısı, iki floresan işaretleyici ve vücut duvarı kas hücrelerini eksprese ettiği plakalar için F üç neslini tarayın. Bu hayvanlar, alfa sinüklein ve GFP genleri için homozigot olacak ve ayrıca yeni oluşturulan transgeni kararlı bir şekilde iletecektir. Tarama tamamlandıktan sonra dopaminerjik nöron analizini yapmaya hazırız.

Nöron analizine başlamak için, önceki adımda tanımlanan F üç hayvandan oluşan yeni bir tabak hazırlayın. Üç transgenik hattın her biri için bir plaka ayarlayın. Ek olarak, alfa-sinüklein GFP tek başına bir kontrol olarak solucanların yetişkinliğe kadar büyümesine izin verir.

Solucanlar yetişkinliğe ulaştığında, her hattan 30 ila 40 transgenik hayvanı taze bir tabağa aktarın. 20 santigrat derecede beş saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin. Beş saat sonra çıkarın ve atın.

Yetişkinler, embriyoların L dört aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede üç ila dört gün boyunca gelişmesine izin verir. Daha sonra, mililitre başına 0.04 miligram beş floro içeren bir plakaya yaklaşık yüz transgenik L dört hayvan seçin. İki deoksi üridin.

Bu nükleotid analogu, DNA sentezinin inhibisyonu yoluyla bir sonraki neslin gelişmesini önler. FDUR plakaları ışığa duyarlı olduğundan, plakaları kapalı ve tam olarak sarılmış halde tutarak ışıktan koruyun. Solucan analizi için brüt ped yapın.

Bunlar taze olarak kullanılır ve kurumasına izin verilmez. Üzerlerinde bir parça bant bulunan iki mikroskop lamı yerleştirin. Boyuna. Bant, eşit kalınlıktaki pedler için bir ara parça görevi görür.

Tezgahın üzerine aralarına üçüncü bir slayt koyun. Konumlanmışlar. Üç yan yana.

Orta tarafa bir damla erimiş arus koyun ve hızlı bir şekilde agrosun üzerine dik olarak iki ve üç slaydın üzerine başka bir slayt yerleştirin. Analiz edilecek numune sayısı için gerektiği kadar birkaç ek ped yapmak için tekrarlayın. Burgu pedleri hazır olduğunda, 22 x 30 milimetrelik bir kapak camına altı mikrolitrelik üç milimolar, 11 mil testere ve anestezik damlatın.

Damlanın içine 40 yetişkin hayvan seçin ve ardından kapak camını agros pedinin üzerine ters çevirin. Diğer satırların her biri için tekrarlayın. Her bir CEP ve bir D nöronunun varlığı için satır başına 30 hayvan puanlayın.

FITC veya GFP'nin görselleştirilmesine izin veren bir filtre küpünde epi floresanslı bir bileşik mikroskop kullanarak, bir puanlama sayfasında bir endo G-F-P-H-Y-Q filtre küpü kayıt verisi kullanacağız. Yabani tip hayvanlar, dört CEP nöronunun tümünde ve iki A DE nöronunda dersler için tam GFP'yi korur. D nöronlarının kaybını sergileyen bireysel hayvanlar, bilinen vahşi tip veya dejenere olarak puanlanır.

Bu nöronlar LG veya GFP kaybı olarak kaydedilir. Benzer şekilde, dejenerasyonun derecesi, her bir hayvanda kaybedilen toplam nöronlar sayılarak puanlanabilir ve popülasyon analizi iki kez daha tekrarlar. Deneme başına hat başına 30 daha fazla hayvan kullanmak.

Üç analiz turundan vahşi tip dopamin nöronları sergileyen toplam solucan sayısının ortalaması alınır. Nöroproteksiyon için istatistiksel analiz daha sonra öğrencinin 0.05'ten küçük T-testi P değeri kullanılarak gerçekleştirilir. Kontrol solucanları ile dopamin nöronlarında aday genleri aşırı eksprese eden suşları karşılaştırmak için bu analizi yumurta şeridini takip eden çeşitli günlerde, uygun analiz günlerinin ampirik olarak belirlenmesi gerekir.

Örneğin, alfa CLE artı GFP hayvanlarının %77'sinin %87'sinin ve %90'ının, gelişimden sonra sırasıyla altıncı, yedi ve 10. günlerde dejenere dopamin nöronları sergilediğini belirledik. Bu nedenle, ilgilenilen transgenin nörodejenerasyonu artırabileceğini tahmin edersek, altıncı günde analiz edeceğiz. Benzer şekilde, nörodejenerasyonu baskılayabilecek transgen, yedinci ve 10. günlerde analiz edilecektir.

Size deniz zarafetinde bir dopamin nörodejenerasyon testinin nasıl yapıldığını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, genetik çaprazlamalar sırasında seçim için uygun işaretleyiciyi kullanmayı unutmamak önemlidir. İki, sağlıklı erkekler ve haçlar için L dört HEDI kullanın.

Ve üçüncüsü, CEP ve DE nöronlarını dikkatli ve tutarlı bir şekilde puanladığınızdan emin olun. Bu prosedür, alfa alfa CLE'nin neden olduğu nörodejenerasyonu artırabilecek veya baskılayabilecek genetik faktörü hızlı bir şekilde test etmenizi sağlayacaktır. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.