Name: Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin, C. elegans kullanarak dopamin nöron dejenerasyonu testiyle Parkinson hastalığı potansiyel genlerini nasıl doğrulayacağınızı. Bu yöntem, nörodejeneratif süreçleri araştırmak için etkili bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir

A. İfade Plazmid İnşaat İki plazmid gerekli doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir (plazmid marker araştırma toplum içinde genellikle mevcut olmasına rağmen). Deneysel Plazmid <ol><li> Ilgi doku / hücre tipi olarak ifade edilir bir yararlanıcı seçin; DA taşıyıcı (Pdat 1) Bu durumda, organizatörü kullanılır. Bu ifade plazmid recombinational klonlama 1 organizatörü ilgi downstream herhangi bir gen ekleme sağlamak için bir Invitrogen Gateway sisteminin uyumlu hedef vektör (pDEST-DAT-1) olarak yaratılmıştır. </li><li> Ilgi genin cDNA Gateway att B recombinational dizisi içeren primerler kullanılarak amplifiye. Amplifiye cDNA ilk giriş vektörü oluşturmak için donör vektör pDONR201 içine recombined ve sonra E. coli suşu DH5α dönüştü. Başarılı rekombinantlar ve DNA mini hazırlık izolasyon seçimi takiben, giriş vektörü ifade plazmid yaratmak için pDEST-DAT-1 hedef vektör recombined. Recombinational klonlama Ayrıntılar Invitrogen Ağ Geçidi manuel veya Caldwell ve ark mevcuttur. 5. </li></ol> Plazmid Seçilebilir Marker Plazmid bir transgenik işaretleyici bariz bir doku floresan protein ifadesi itici bir yararlanıcı bir vektör oluşur. Bu özel prosedür, unc-54 organizatörü sürücüler vücut duvarı kas kiraz protein ekspresyonu (: kiraz Nokt-54). Mikroenjeksiyon yoluyla Transgenik C. elegans B. Üretimi Bkz: vallahi ilgili makale <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833</a> C. Genetik DA nörodejenerasyon Analizi için haçlar <ol><li> Worms standart prosedürler kullanarak 6 yetiştirilmektedir. </li><li> 10 Pdat-1: α-syn; Pdat-1: 3-4 aşama L4 transgenik çift cinsiyetli bir çiftleşme tabağa GFP erkeklerde 1, 2 (: gen X ve Nokt-54: Pdat-1 ifade: kiraz) . Bu oluşturulan üç ayrı istikrarlı hatları her biri için ayrı ayrı yapılmalıdır. İki gün sonra, erkek çıkarın. </li><li> F1 nesil kontrol edin; birkaç erkek döl varsa, çiftleşme başarılı oldu. </li><li> Her çapraz 5 hermafrodit L4 hayvanlar dışarı Clone sergi hem Pdat-1: GFP floresan işaretleyici (erkek ebeveyninizden miras) ve Nokt-54: kiraz floresan vücut duvarı kas işaretleyici (hermafrodit ebeveyn miras). Klonlanmış hayvanların henüz plakası üzerinde bulunan erkek hayvanlar ile evlendirilen olduğunu sağlamak için L4 aşamasında olması gerekir. Onları kendi kendine çapraz ve F2 döl üretmek izin ver. </li><li> 3. adımda üretilen F2 hayvanların klonlanmış. Özellikle, transfer ~ kendi bireysel plakaları hem flüoresan işaretleyiciler sergi 5-10 hayvanlar. Ekran hayvanların ifade DA nöronlar GFP ve bazı hayvanların% 100 vücut duvarı kas hücrelerinde ifade kiraz plakaları için F3 nesil. Bu hayvanlar Pdat-1 için homozigot olacak: α-syn; Pdat-1:: GFP geninin stably yeni oluşturulan transgen (gen X) iletimi sırasında. </li></ol> D. dopaminerjik Nöron Analizi <ol><li> Her üç satır yukarıda oluşturduğumuz yeni bir plaka, yanı sıra Pdat-1 hazırlayın: α-syn; Pdat-1: GFP yalnız gerginlik. Yetişkinliğe büyümesine izin verin. </li><li> Her satırı 30-40 transgenik yetişkin taze bir tabağa aktarın. , 20 º C&#39;de 4 saat embriyolar koymak için izin ver </li><li> Yetişkinler çıkarın. L4 aşamaya ulaşmak kadar embriyoların 20 º C&#39;de 3-4 gün geliştirmeye izin verir. </li><li> 0.04 mg / ml 5-floro-2&#39;-dezoksiuridin (FUDR) içeren bir plaka ~ 100 transgenik L4 hayvanlar seçin. DNA sentezinin inhibisyonu yoluyla yeni nesil bu nükleotid analog blok gelişimi, böylece deney hayvanları 7 ezici bir döl önler. Işığa duyarlı olduğundan ışık FUDR plakaları koruyun. </li><li> Yetişkin hayvanların yumurtlama sonrasında çeşitli gün analiz edilecektir. Ampirik olarak analiz uygun gün belirlenir. Örneğin, biz tespit ettik% 77,% 87 ve% 90 Pdat-1: α-syn Pdat-1: GFP hayvanlar sırasıyla, dejenere DA nöronları gün 6, 7 ve 10 yazılan gelişimi sergilerler. Bu nedenle, biz ilgi transgen nörodejenerasyon geliştirmek olabileceğini tahmin, biz günde 6 ve 7 / veya analiz eder. Aynı şekilde, 7 ve 10 gün nörodejenerasyon bastırmak olabilir transgenlerin analiz edilecektir. </li><li> 4 taze agaroz pedleri (mikroenjeksiyon agar pedleri aksine, bu taze kullanılan ve kurumasına izin verilmez) olun. Çapında bir parça bant iki mikroskop lamı ayarlayın; bant eşdeğer kalın pedler için ayırıcı olarak hizmet vermektedir. Üçüncü Lay(üç ayak yerleştirilmiş) bankta aralarında kaydırın. Merkezi slayt erimiş agaroz bir damla koyun ve hızlı bir şekilde dik ve her üç slayt boyunca, agaroz üstüne başka bir slayt yatıyordu. Ped kullanmak için hazır olana kadar birlikte iki slayt bırakarak, birkaç ek pedleri olun. </li><li> Solucan DA nöronları analiz etmek için, 22 x 30 mm cam kapak 3 mM levamizol (anestezi) 6 ul damla yerleştirin. Agaroz ped üzerine kapak cam invert sonra, açılan (10 30 dışında ekstra atılır) 40 yetişkin hayvanların seçin. Diğer çizgilerin her biri için yineleyin. </li><li> Puan Epifloresans ve FITC veya GFP görselleştirme sağlayan bir filtre küp ile bir bileşik mikroskop kullanılarak her CEP ve ADE nöron varlığı için hat başına 30 hayvan. GFP HYQ filtre küp (Chroma Teknolojisi) bağışlamak kullanın. Ekli puanlama kağıda kayıt verileri. Wild-tip hayvanlar tam 4 CEP GFP floresan ve 2 ADE nöronlar koruyacaktır. DA nöronların kaybı sergileyen bireysel hayvanlar olmayan WT veya &quot;dejenere&quot; olarak attı. Aynı şekilde, dejenerasyon ölçüde her hayvanın yanı sıra nüfus olarak kaybedilen toplam nöron sayarak atılır. </li><li> Analizi (deneme satır başına başına 30 daha fazla hayvan) 2 kez daha tekrarlayın. Analizler üç tur solucanlar, yabani tip DA nöronların sergileyerek toplam sayısı ortalaması alınır. Analitik nöro için istatiksel analizi daha sonra kontrolü solucanlar (: α-syn; Pdat-1: Pdat-1: GFP) karşılaştırmak için öğrenci en t-testi (p &lt;0.05) kullanılarak gerçekleştirilir. Suşları ile DA nöronların aşırı-ifade aday genler . </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

Dopamin nöronlarının yaşa bağlı kayıp, Parkinson hastalığının bir klinik özelliğidir ve alfa-sinüklein adı verilen bir protein birikimi veya misfolding ile ilişkili bulunmuştur. Burada C dopaminerjik nöronlar, floresan transgen üzerinden, etiket nasıl göstermek elegans ve bu hücrelerin coexpressing insan alfa-sinüklein Parkinson hastalığında görülen nörodejenerasyon taklit. Bu video, büyüme, genetik geçişi, montaj ve nörodejenerasyon ya da geliştirmek veya yaşlanma boyunca nöro-genetik faktörleri değerlendirmek ama...

<table><tbody ><tr ><td >Agaroz</td ><td >Ultrapure</td ><td >Invitrogen</td ><td >15510-027</td ><td></td </tr><tr ><td >Lameller 20x30 mm</td ><td></td ><td >Fisher Scientific</td ><td >12-548-5A</td ><td></td </tr><tr ><td >Mikroskop Lamları</td ><td >Sade, 3x1&quot;</td ><td >Fisher Scientific</td ><td >12-549</td ><td></td </tr><tr ><td >Floresan özellikli Diseksiyon</td ><td >Mikroskobu</td ><td >Nikon Instruments</td ><td >SMZ800</td ><td></td </tr><tr ><td >Diseksiyon</td ><td >Mikroskobu</td ><td >Nikon Instruments</td ><td >SMZ645</td ><td></td </tr><tr ><td >Epifloresan</td ><td >Mikroskop</td ><td >Nikon Instruments</td ><td >Model E-800</td ><td></td </tr><tr ><td >Filtre Küpü, GFP HYQ</td ><td >Endow Bandpass</td ><td >Chroma Technology Corp.</td ><td></td ><td></td </tr></tbody></table>

potansiyel parkinson hastalığı genler doğrulama için c. elegans dopamin nöron dejenerasyonu testi uygulama

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Parkinson hastalığı (PH) tanı ve tedavi gelişmeler, risk altındaki populasyonlarda hale yatkınlık faktörleri hakkında bilgi bağımlı. PD ile ilişkili yeni bir genetik faktörleri belirlemek için çalışırken sürecinde, bilim adamları, aday genler, polimorfizmleri ve önemli ilerlemeler temsil eden proteinler birçok listeler oluşturulur, ancak bu yol açar mekanistik tanımsız kalır. Bizim işimiz böyle listelere basit bir hayvan modeli sisteminin avantajlarını istismar ederek önemli ölçüde daralması doğru hedeflenmektedir. Insanlar milyarlarca nöron olmasına rağmen, mikroskopik tür solucanın Caenorhabditis elegans tam 302 var ve bunların sadece sekiz hemaphrodites üretmek dopamin (DA). İfade bir insan gen dozaj ve yaşa bağımlı nörodejenerasyon C. elegans DA nöronlar sonuçları PD-ilişkili protein, alfa-sinüklein kodlama. DA nöronların insan alfa-sinüklein ifade Worms isogenic ve DA taşıyıcı organizatörü (Pdat 1) altında GFP ve insan alfa-sinüklein ifade. GFP varlığı kolayca görüntülenebilmekte, bu hayvanlar DA nörodejenerasyon için bir marker olarak hizmet vermektedir. Biz başlangıçta alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon torsinA, moleküler şaperon aktivite 1 ile bir protein tarafından bu hayvanlar kurtarıldı olabileceğini gösterdi. Ayrıca, aday PD-ilişkili genlerin sonra C. elegans DA nöronların aşırı ifade edildi alfa-sinüklein misfolding assay kullanarak büyük ölçekli RNAi tarama çabaları ile laboratuvar belirlemiştir. Biz alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon 2 kurtardı beş yedi genlerin PD temsil önemli aday modülatörleri test olduğunu belirledi. Ayrıca, alfa-sinüklein bağımlı toksisite sitotoksisite geliştirmek veya bastırmak genler için bir okuma olarak kullanılmasını sağlayan Lindquist Lab (vallahi bu konuda) maya ekranlarında sahne aldı. Biz daha sonra C. elegans alfa-sinüklein indüklenen nörodejenerasyon tahlil maya aday genler incelenecek ve başarılı bir şekilde bu hedeflere 3, 4 çok valide . Metodoloji Pdat-1 promotör kontrolü altında aday gen cDNAs recombinational klonlama kullanarak C. elegans DA nöron spesifik ifade vektör nesil içerir. Bu plazmid sonra başarılı bir dönüşüm için seçilebilir bir işaret ile birlikte, wild-tip (N2) solucanlar microinjected. DA nöronları aday proteini üreten Çoklu istikrarlı transgenik çizgiler yaşlanma boyunca, hayvan ve bireysel nöron düzeyinde hem de elde edilen ve daha sonra bağımsız olarak geçti ve alfa-sinüklein dejeneratif gerginlik içine nörodejenerasyon açısından değerlendirildi.

Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Parkinson hastalığının (PH) tanı ve tedavisindeki iyileştirmeler, popülasyonları ... hale getiren yatkınlık faktörleri hakkındaki bilgiye bağlıdır.

Caldwell Laboratuvarı'nda, yani diğer adıyla Worm Shack'te, C. elegans'taki nörolojik hastalık mekanizmaları üzerine çalışıyoruz. Verimli deneylerle geçen uzun bir günün ardından, kendimizi bazı rekreasyonel aktivitelerle ödüllendiriyoruz. Merhaba, ben Adam Knight; Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü, Caldwell Laboratuvarı'nda lisans öğrencisiyim.Bugün, ben ve diğerleri C. elegans'ta dopamin nöron dejenerasyonu analizi nasıl yapılır göstereceğiz. Dopamin nörodejeneratif bir solucan suşunu, aday hastalık ilişkili genleri ve dopamin nöronlarını aşırı ifade eden transgenik suşlarla çaprazlayacağım. Merhaba, ben Caldwell Lab'da yüksek lisans öğrencisi Adam Harrington.Bugün size dopamin nöron analizleri için transgenik solucanların nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Merhaba, ben lisansüstü öğrencisi Shu Amichi. Burada size, CEP ve AID olarak adlandırılan C. elegans dopamin nöronlarının nasıl analiz edileceğini göstereceğim.Genel olarak, dopamin nöronlarında sadece GFP ekspres eden solucanlar hücre ölümü sergilemezler. Ancak, CLE varlığında, bunları ve yaşa bağlı nörodejenerasyonu gözlemleyeceksiniz. Bu analiz kullanılarak, bir transgenin CLE kaynaklı toksisiteyi artırıp artıramayacağını veya baskılayıp baskılayamayacağını belirlemek için dopamin nöronlarında ko-eksprese edilmesi sağlanabilir. Öyleyse hadi başlayalım.Dopamin nöron analizini gerçekleştirmeden önce, öncelikle uygun GaN suşlarını çaprazlamalı ve hem alphas nucle ve GFP'yi dopamin nörona özgü dat one promotörü kontrolünde eksprese eden sekiz adet mill'i çiftleşme plakasına yerleştirmeliyiz. Şimdi, ilgi duyulan aday genimizin dopamin nörona özgü ekspresyonunun yanı sıra DS red two floresan seçilebilir işaretçisinin vücut duvarı kas hücresi ekspresyonunu sergileyen iki adet L4 evresi transgenik ca afrodit ekleyin. Her bir transgen konstrüktü için üç stabil transgenik hat oluşturduğumuzu belirtmek önemlidir.Bu nedenle, bu genetik çaprazlama oluşturulan üç ayrı stabil hattın her biri için bireysel olarak gerçekleştirilmelidir. İki gün sonra erkekleri çıkarın ve ek iki ila üç gün sonra imha edin. F1 neslini inceleyin.Çeşitli erkek döl bulunmaktadır ve çiftleşme başarılı geçmiştir. Ardından, erkek ebeveynden kalıtılan GFP floresan belirteci ile hamadi ebeveynden kalıtılan DS red two floresan vücut duvarı kas belirtecinin her ikisini de sergileyen beş Aphrodite L four hayvanını ve her çaprazlamadan dört hayvanı tek tek yeni plakalara aktarın. Aktarılan hayvanların, henüz çiftleşmediklerinden emin olmak için L four evresinde olmaları gerekir.Erkek hayvanlar plakta bulunurken, F2 dölünü üretmek için hayvanların üç ila dört gün boyunca kendi kendilerini döllemelerine izin verin. Şimdi, bunu yapmak için F2 dölünü temizleyin. Her iki sent marker'ı da sergileyen beş ila 10 hayvanı kendi bireysel plakalarına aktarın.Ardından, hayvanların yüzde yüzünün dopamin nöronlarında GFP eksprese ettiği ve bazı hayvanların vücut duvarı kas hücrelerinde DsRed2 floresan markörünü eksprese ettiği plakalar için F3 neslemini tarayın. Bu hayvanlar, alfa-sinüklein ve GFP genleri için homozigot olacak ve yeni oluşturulan transgeni stabil bir şekilde ileteceklerdir. Tarama tamamlandığında, dopaminerjik nöron analizini gerçekleştirmeye hazırız.Nöron analizine başlamak için, önceki adımda belirlenen üç F hayvanından taze bir plaka hazırlayın. Üç transgenik hattın her biri için bir plaka düzenleyin. Ek olarak, kontrol olarak sadece alfa-sinüklein GFP suşunu platlayın ve solucanların yetişkinliğe erişmesini sağlayın.Solucanlar yetişkinliğe ulaştığında, her hattan 30 ila 40 transgenik hayvanı taze bir plakaya aktarın. 20 °C'de beş saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin. Beş saat sonra hayvanları uzaklaştırın ve atın.Erişkinler, embriyoların 20 °C'de L4 evresine ulaşana kadar üç ila dört gün gelişmesine izin verilir. Ardından, yaklaşık yüz adet transgenik L4 hayvan, 0,04 mg/mL 5-fluorodeoksiuridin içeren bir plakaya alınır.Bu nükleotid analoğu, DNA sentezini inhibe ederek bir sonraki neslin gelişimini önler. FDUR plakaları ışığa duyarlı olduğundan, plakaları örtülü ve tamamen sarılı tutarak ışıktan koruyun. Solucan analizi için bir aug gross pedi hazırlayın.Bunlar taze olarak kullanılır ve kurumalarına izin verilmez. Üzerine boylamasına bir parça bant yapıştırılmış iki mikroskop lamı hazırlayın. Bant, eş kalınlıkta pedler oluşturmak için ara boşluk görevi görür.Tezgaha, aralarına üçüncü bir lam yerleştirin. Konumlandırıldılar. Yan yana üç tane.Erimiş agarın bir damlasını lamın merkezine yerleştirin ve dik açı oluşturacak şekilde başka bir lamı üzerine, ardından tüm üç lamı kapsayacak şekilde yerleştirin. Analiz edilecek örnek sayısına uygun sayıda ek agar pedi hazırlamak için işlemi tekrarlayın. Agar pedleri hazır olduğunda, 22 x 30 milimetrelik bir kapatma camı üzerine altı mikrolitre miktarda üç milimolar, 11 milisolar anestezik damlatın.Damla içerisine 40 adet yetişkin hayvan seçin ve ardından lameli agros pedin üzerine ters çevirerek kapatın. Diğer tüm hatlar için işlemi tekrarlayın. Her bir hat için 30 hayvanı, her bir CEP ve D nöronunun varlığı açısından skorlayın.FITC veya GFP'nin görüntülenmesine olanak tanıyan bir filtre küpüne sahip epi-floresan bir bileşik mikroskop kullanarak, verileri bir değerlendirme formuna kaydetmek için endo G-F-P-H-Y-Q filtre küpü kullanacağız. Yabani tip hayvanlar, tüm dört CEP nöronunda ve iki A DE nöronunda dersler için eksiksiz GFP korurlar. D nöronlarının kaybını gösteren tekil hayvanlar, bilinen yabani tip veya dejenerasyona uğramış olarak skorlanır.Bu nöronlar LG veya GFP kaybı olarak kaydedilir. Benzer şekilde, her bir hayvanda kaybedilen toplam nöronların yanı sıra popülasyon sayımı ile dejenerasyon derecesi puanlanabilir; analiz her seferinde her hat için 30 ek hayvan kullanılarak iki kez daha tekrarlanır.Üç analiz turundan elde edilen, vahşi tip dopamin nöronları sergileyen toplam solucan sayısı ortalaması alınır. Nöroproteksiyon için istatistiksel analiz, 0,05'ten küçük P değeri ile Student's T-testi kullanılarak gerçekleştirilir. Kontrol solucanlarını, dopamin nöronlarında aday genleri aşırı eksprese eden suşlarla karşılaştırmak için, yumurta aşamasından sonraki çeşitli günlerde bu analiz gerçekleştirilir; uygun analiz günleri ampirik olarak belirlenir.Örneğin, alpha CLE artı GFP hayvanlarının sırasıyla gelişim sonrası altıncı, yedinci ve onuncu günlerde %77, %87 ve %90'ının dejenere olmuş dopamin nöronları sergilediğini belirledik. Bu nedenle, ilgili transgenin nörodejenerasyonu artırabileceğini öngörüyorsak, altıncı günde analiz yapacağız. Benzer şekilde, nörodejenerasyonu baskılayabilecek transgenler yedinci ve onuncu günlerde analiz edilecektir.Size, C. elegans'ta dopamin nörodegenerasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken şunları hatırlamanız önemlidir: birincisi, genetik çaprazlamalar sırasında seçim için uygun belirteç kullanın; ikincisi, çaprazlamalar için sağlıklı erkekleri ve L4 evresindeki hermafroditleri kullanın.Ve üçincü olarak, CEP ve a DE nöronlarını dikkatli ve tutarlı bir şekilde skorladığınızdan emin olun. Bu prosedür, alpha alpha CLE kaynaklı nörodejenerasyonu artırabilecek veya baskılayabilecek genetik faktörleri hızla analiz etmenize olanak tanıyacaktır. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

application-c-elegans-dopamine-neuron-degeneration-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Genel olarak Parkinson hastalığı, hareket bozuklukları, hassas ve güvenilir bir davranış testleri yeni potansiyel terapötikler test etmek için gereklidir. Burada, nigrostriatal sistemine zarar derecelerine ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı duyarlı olan fareler için duyu testler yönetilebilir bir pil açıklanmaktadır.

Parkinson Hastalığı Fare Modeller Duyusal Motor Fonksiyon Değerlendirilmesi

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Lipoksijenaz (LOX) izozimler nöroinflamatuarasyonu ve nörodejenerasyonu artırabilecek veya azaltabilecek ürünler üretebilir. Gen-çevre etkileşimi çalışması LOX izozime özgü etkileri tanımlayabilir. İki LOX izozim eksikliği olan transgenik çizgilerde nigrostriatal hasarın 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) modelinin kullanılması, LOX izozimlerinin dopaminerjik bütünlük ve inflamasyona katkısının karşılaştırılmasını sağlar.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Burada, MouseWalker aparatının sıçanların artan boyutuna ve ağırlığına uyum sağlayacak şekilde yeniden tasarlanmasıyla inşa edilen RatWalker sistemini tanımlıyoruz. Bu sistem, yürüyüş parametrelerini izlemek ve ölçmek için hayal kırıklığına uğramış toplam dahili yansıma (FTIR), yüksek hızlı video yakalama ve açık erişimli analiz yazılımı kullanır.

Parkinson Hastalığının Genetik Sıçan Modelinde Yürüme Analizi için RatWalker Sisteminin Uygulanması

Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

Bu protokol, genç RAC1/CED-10 mutant Caenorhabditis elegans'ta niceliksel bir dışkılama testini detaylandırır ve prodromal Parkinson hastalığı evrelerini incelemek için basit bir model sunar. Diğer hayvan modellerinin sınırlamalarını aşar ve erken Parkinson patolojisini hedefleyen terapötik stratejilerin test edilmesini kolaylaştırır.

Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 mutantlarında Gastrointestinal Motilite'nin Erken Parkinson Hastalığını Araştırmak İçin Bir Araç Olarak Değerlendirilmesi

Ole Isacson bir özlü, Parkinson Kullanıcı hastalığı genel, nedenleri, tedavi stratejileri ve Parkinson araştırma gelişmeler verir.

Ole Isacson: Parkinson Hastalığı İçin Yeni Tedaviler

Öğrenin, C. elegans kullanarak dopamin nöron dejenerasyonu testiyle Parkinson hastalığı potansiyel genlerini nasıl doğrulayacağınızı. Bu yöntem, nörodejeneratif süreçleri araştırmak için etkili bir model sunar.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Daha fazla video keşfet