C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

Merhaba, ben Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Caldwell Laboratuvarı'ndan Cody Locke. Ben Kyle Lee; size solucanların dış karbonat (outta carb) ve PTZ maruziyet analizleri için nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Ben Bernard Tu ve size dış karbonat (out carb) analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.

Ben Kaylin Berry, C. elegans videolarından sorumluyum. Bu sunumda, anlatımı gerçekleştirerek PTZ maruziyet analizini uygulamalı olarak göstereceğim. Bugün meslektaşlarım ve ben, bir dizi temsilci mutant suşu kullanarak, PTZ ve Aldicarb maruziyeti sonrası epilepsi C. elegans modeli ile sinaptik iletim mutantlarının nasıl karakterize edileceğini göstereceğiz.

Öyleyse başlayalım. Kyle Lee, bugün prosedürün ilk gününde ALD karbon analizlerinin hazırlanışını göstererek bizi başlatacak. Her bir genotipten ve her bir tekrardan, ikinci gün yapılacak ALD karbon analizleri için en az 30 adet genç yetişkin evre solucanın hazır olduğundan emin olun.

Bir deneycinin, besin kaynağı olarak e coli OP 50 ile ekilmiş, fungusit içermeyen taze NGM plaklarına 50 veya daha fazla L4 evresindeki solucanı seçmesi en iyisidir. Solucanları tutarlı ve uygun bir sıcaklıkta 12 ila 24 saat boyunca büyütün. 20 °C ile 22 °C arası en idealidir, ancak 25 °C de kabul edilebilir.

İkinci günde, Al Decarb ve %70 etanol ile 100 millimolar'lık bir stok çözelti hazırlayın ve uygun miktardaki Al Decarb'ı NGM plaklarına yayın. 7,5 mililitre NGM içeren 60 milimetrelik havalandırmasız Petri plaklarına, 100 millimolar'lık Al Decarb çözeltisinden 37,5 mikrolitre ekleyerek tutarlı bir şekilde 0,5 millimolar Al Decarb kullanıyoruz. Al Decarb plaklarının oda sıcaklığında yaklaşık 30 ila 60 dakika boyunca kurumasına izin verin.

Plakalar kuruduktan sonra kapakları çatlatmaya gerek yoktur. Her bir alde carb plağının merkezine eşit hacimlerde e coli ekleyin ve 30 ila 60 dakika daha kurutun. Oda sıcaklığında, genellikle 25 µL e coli OP 50 ekliyoruz.

Bu hacimdeki OP 50, solucanların aşırı kalabalıklaşmadan plakanın merkezindeki küçük bir noktada kalmasını sağlayacak yeterli büyüklükte bir besin alanı oluşturur. Besin alanı kuruduğunda, albakarb analizlerine geçiniz. ALD karb analizlerinin subjektif doğası nedeniyle, deneylerin körleme yöntemle yürütülmesi şiddetle tavsiye edilir.

Bunu yapmak için, ana deneycinin bir meslektaşı, analiz edilecek solucanları içeren orijinal plakaları yeniden etiketler veya zamanlayıcıyı başlatmadan hemen önce solucanları orijinal plakalardan cipher alde carb plakalara aktarabilir. Plakalar hazırlandıktan sonra, analiz aşamasına geçilecektir; analize başlamak için felçli solucanların sayısı sayılır.

Akut al decarb kaynaklı felci tanımlamak için iki ana yaklaşım vardır. İlk yaklaşım, felci farenks pompalama hareketinin durmasıyla tanımlar. Bu video notunda, ekranın sağ tarafında solucan farenksinin lümeni içinde yer alan koyu renkli bir yapı görülmektedir.

Bu yapı öğütücü (grinder) olarak adlandırılır ve kolinerjik bir mekanizma aracılığıyla ritmik olarak kasılır. Bu videodaki solucanın lokomosyonu, Al Decarb maruziyeti nedeniyle büyük ölçüde yavaşlamıştır. Buna rağmen, bu solucanın faringeal öğütücüsü hâlâ net bir şekilde hareket etmektedir.

Bu nedenle, bu solucan pompalama durması tanımına göre felçli değildir. Bu videoda, ekranın sağında yer alan farengeal öğütücünün, al Decarb kaynaklı felç için çalışma tanımı olan pompalama durmasıyla birlikte kasılmadığı görülmelidir. Bu solucan felçli olarak puanlanmalıdır.

Buna rağmen, önceki videodaki solucan gibi, bu solucan da hafif yanlara doğru arama hareketleri sergilemektedir. Al Decarb nedeniyle lokomosyonu bozulmuş olsa da, bu hareketler bir deneycinin, Al Decarb ile indüklenen paraliziye yönelik ikinci tanımlama yaklaşımı olan tüm vücut immobilite ve dokunmaya karşı tepkisizlik kriterine göre bu solucanı paralize olarak değerlendirmesini engelleyecektir. Al Decarb ile indüklenen paraliziyi tanımlamanın ikinci yaklaşımı, her bir solucanın platin bir tel ile tutarlı bir şekilde uyarılmasını ve tepkinin kontrol edilmesini içerir.

Vücut hareketleri çıplak gözle tespit edilemiyorsa, tercih ettiğimiz yaklaşım solucanlarımızı her 30 dakikada bir baş kısmından iki kez ve kuyruk kısmından iki kez, toplam üç saat boyunca dürtmektir. Göreceğiniz üzere, bu videodaki solucan vücudunu belirgin bir şekilde hareket ettirmiyor. Buna rağmen, bu solucan dürtülmeye kuyruğunu net bir şekilde hareket ettirerek tepki verdiği için bu solucana felçli demiyoruz.

Al decarb kaynaklı felcin ikinci tanımına göre; önceki videodaki solucan gibi, bu solucan da vücudunu belirgin bir şekilde hareket ettirmemektedir ve bu nedenle bir dürtme testi gerektirir. Ancak, önceki videodaki solucanın aksine, bu solucan dürtme işlemine net bir yanıt vermemektedir.

Bu nedenle, bu solucan al decarb ile indüklenen paralizinin ikinci tanımına göre felç olmuştur. Al decarb ile felç olmuş ve olmamış solucanlar arasındaki fark belirgin olmasa da, deney yapanlar, Al Decarb plaklarına alındıktan hemen sonra Al Decarb'a maruz bırakılan çok sayıda temsili solucanı gözlemleyerek sinaptik iletimdeki önemli değişiklikleri tespit edebilmelidir. Yabani tip solucanlar ise hala hareketlidir.

Bu videoda, bir önceki videodaki aynı yabani tip solucanların bir saatlik Al Decarb maruziyeti sonrası hali görülecektir. Solucanların bir dereceye kadar yavaşladığı ancak hâlâ belirgin bir şekilde hareket ettikleri dikkat çekmektedir.

Yabani tip solucanların aksine, bu videodaki Tomasin one mutantları bir saatlik maruziyetten sonra ya tamamen hareketsiz kalmışlardır ya da zar zor hareket etmektedirler. Bu sonuç, nöromusküler bileşke noktalarındaki nörotransmitter salınımını negatif olarak düzenleyemedikleri için tomasin one mutantlarının aşırı asetilkolin salgılamasıyla tutarlıdır; nöromusküler bileşke noktalarındaki sinaptik yarıkların aşırı asetilkolinle birlikte asetilkolin yıkımının inhibisyonu (Bial Decarb), tomasin one mutantlarını aşırı duyarlı hale getirir. Burada gösterilmemiş olsa da, C. elegans kalsiyum kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 ortologunu kodlayan on 43 fonksiyon kaybı alelleriyle yapılan alde carb deneylerinden benzer sonuçların ortaya çıktığı varsayılmıştır. Bu video, inhibitör GABAerjik iletimde eksiklik olan on 25 mutantlarını göstermektedir.

Bir saatlik alde carb maruziyetinden sonra, tomasin one ve M 43 mutantlarına benzer şekilde, bu mutantlar belirgin alde carb kaynaklı lokomotor bozukluklar sergilemektedir ve aynı süre boyunca al Decarb ile maruz bırakılan yabani tip solucanlardan daha fazla etkilenmiş görünmektedir. Bu sonuç, M 25 mutantlarının al Decarb maruziyeti ve azalmış GABAerjik iletimin birleşimi nedeniyle aşırı uyarılmış vücut duvarı kaslarına sahip olduğu, bunun da CL ELs nöromüsküler kavşaklarında daha yüksek bir uyarıcı/inhibitör iletim oranına ve ardından paraliziye yol açtığı ile tutarlıdır. Yine de tomasin one, 43 ve 25 mutantları bu zaman noktasında Al Decarb'a karşı benzer hassasiyetler göstermektedir.

Vücut duvarı kaslarının aşırı uyarılmasının farklı nedenleri olmasına rağmen, bir deneyci, neden olan mutasyonların kimliklerini önceden bilmeden hipersensitivitenin altında yatan mekanizmayı bilemez. Bu video için, ALD carb deneyimizin bu uç noktasında, üç saatlik al Decarb maruziyetinden sonra daha önceki bir videodaki aynı vahşi tip solucanlara geri döndük; bu solucanların, vahşi tip olmalarına rağmen ya tamamen immobilize oldukları ya da zar zor hareket ettikleri açıkça görülmelidir. Bu solucanlar, muhtemelen eksitatör kolinerjik iletimin karşılaştırılabilir seviyelere ulaşması nedeniyle, alde carb maruziyetinden bir saat sonra gösterilen TOM one ve M 25 mutantları ile fenotipik olarak benzerdir; buna karşılık vahşi tip solucanların aksine, Synap Bren one mutantları üç saatlik alde carb maruziyetinde önemli ölçüde mobil kalmaya devam eder.

Bu sonuç, normal nörotransmitter salgılama seviyelerine sahip olmayan Synaptive Bren one mutantlarının, bu süre zarfında aynı düzeyde alde carb maruziyetini takiben gövde duvar kaslarında, vahşi tip solucanlara kıyasla daha az kolinerjik stimülasyona sahip olmasıyla tutarlıdır. Özellikle kolinerjik iletimde eksikliği olan Point on four mutantlarının, Al Decarb'a karşı Synaptive Bren one mutantları ile benzer hassasiyetler göstermesi gerekir. Aksine, Tomasin one ve O 25 hipersensitif mutantları, tıpkı vahşi tip solucanlar gibi felçli kalmaya devam eder.

Bazı solucanların, özellikle Al Decarb'a dirençli olanların, plaktan dışarı çıkmaya çalışabileceği unutulmamalıdır. Bu durumda deney yapan kişi, solucan hareketine karşı fiziksel bir bariyer olan palmitik asidi eşit miktarda yayabilir. Al Decarb plaklarının çevresine, etanol içinde 10 mg/mL konsantrasyonunda olan palmitik asitten 25 µL yaydık.

Bu işlem Al Decarb maruziyet paradigmasını tamamlar. Şimdi, Penta Lean Terazol maruziyet paradigmasını göstereceğim. PTZ analizlerinde Kaylin Berry bize yardımcı olacak.

Solucanların PTZ analizleri için hazırlanması, temel olarak alde carb analizleri için hazırlanmasıyla aynıdır. İki analiz arasındaki tek anlamlı fark şudur: PTZ çözücüsü olarak %70 etanol yerine DDH two O kullanıyoruz.

Ayrıca, PTZ'nin ALDE carb'dan daha büyük hacimlerde sıklıkla ekilmesi nedeniyle, OP 50 eklemeden önce plakların en az bir saat kurumasını bekleriz. PTZ ile birlikte palmitik asit de kullanılabilir. Ayrıca, PTZ'nin alde carb'dan çok daha az stabil olduğunu ve -20 °C'de saklanması gerektiğini belirtmek önemlidir.

Analize başlamak için, toplam bir saat boyunca her 30 dakikada bir epileptik ışık konvülsiyonu geçiren solucanların sayısını belirleyin. Farklı konvülsiyon türlerine sahip solucanları; tüm vücut konvülsiyonları, "head bobs" olarak adlandırdığımız anterior konvülsiyonlar, anterior konvülsiyonların vücut duvarı kas paralizisi ile kombinasyonu olan "tonik-klonik" veya "tonik" olarak adlandırdığımız tüm vücut paralizisi gibi ayrı kategorilerde puanlamak en iyisidir. Sağdaki solucanda görüldüğü gibi nöbet benzeri aktivite, genellikle soldaki solucanda görüldüğü gibi tonik-klonik konvülsiyonları takip eder.

Nöbet benzeri aktivite, tekrarlayan tonik-klonik konvülsiyonları takiben meydana gelen kas yorgunluğundan kaynaklanıyor olabilir. Ancak, yayınlanmamış verilerimiz, bazı solucanların daha önce tonik-klonik olmaksızın, al decarb ile indüklenen paralizeye benzer bir şekilde PTZ etkisiyle tonik hale gelebildiğini göstermektedir. Burada, çeşitli nöbet ve epilepsi hayvan modellerinde yaygın bir nöbet indükleyici ve GABA reseptör antagonisti olan PTZ yokluğunda hareket eden temsili bir sinaptik iletim mutant solucanını gösteriyoruz.

Solucanın ucunun veya burnunun, besin arama sırasında yanlara doğru sallandığına dikkat edin. Bu videoda, önceki videoda kullanılan aynı sinaptik iletim mutant suşundan başka bir solucan gösteriyoruz. Mililitre başına 2,5 miligram PTZ içeren suyun varlığında bulunan bu solucanın, besin arama sırasında başını çoğunlukla yanlara doğru hareket ettirmeye devam ettiğini fark edin.

Yine de bu solucan zaman zaman yanlara doğru besin aramayı durdurur ve bunun yerine ön kısmını tekrarlayıcı bir şekilde ileriye doğru iter. Son olarak, mililitre başına 10 miligram PTZ içeren su varlığında, önceki iki videodaki solucanlarla aynı mutasyona sahip bir solucan görülmelidir. Bu solucanın yanlara doğru besin aramasının azaldığına ve ön kısmını, daha düşük PTZ konsantrasyonuna kıyasla daha yüksek bir frekans ve yoğunlukla ileriye doğru ittiğine dikkat ediniz.

Bu sonuçlar, tüm PTZ duyarlı sinaptik iletim mutantlarında gözlemlediğimiz PTZ'nin doz bağımlılığını kanıtlamaktadır. Önemli bir nokta olarak, PTZ'ye maruz kalmak yabanı tip solucanlarda epilepsi benzeri konvülziyonları indüklemek için yeterli değildir. Benzer şekilde, kolinerjik iletimde spesifik eksiklikleri olan four veya tomasin one gibi aşırı kolinerjik iletime sahip solucanlarda PTZ kaynaklı epilepsi benzeri konvülziyonlar gözlemlemeye çalıştık ancak gözlemleyemedik.

Bu nedenle, PTZ'ye karşı göreceli hassasiyetlerine dayanarak, alde carb dirençli sinaptik iletim mutantlarını, genel sinaptik fonksiyon bozukluklarından veya kolinerjik iletime özgü bozukluklardan kaynaklanan durumlarına göre daha ayrıntılı bir şekilde karakterize etmek mümkün olmalıdır. Belki de şaşırtıcı bir şekilde, C. elegans inhibisyon motor nöronlarında saptanabilir GABA ekspresyonu bulunmayan ve fonksiyonu güçlü şekilde azalmış olan ONC 25 mutantı, bu videoda görüldüğü gibi spontan epileptik benzeri konvülsiyonlar sergilememektedir.

Mililitre başına 10 miligram PTZ içeren suda bir ONC 25 mutantı. Bununla birlikte, gösterilmese de, bazı hareketlerin eşlik ettiği öncül konvülsiyonlar, ONC 25 ile ilişkili tonik-klonik konvülsiyonlardan önce gelmiş ve synap Bren one mutantlarının konvülsiyonlarını taklit etmiştir, ancak güçlü tonik-klonik konvülsiyonlar sergilemektedir. Bu nedenle, özellikle hipomorf mutant aleller elde etme olasılığı göz önüne alındığında, bir deneyci, tüm inhibitör GABA mutantlarının PTZ varlığında tonik-klonik konvülsiyonlar veya buna yakından ilişkili tonik nöbet benzeri aktivite sergileyeceğini varsaymamalıdır.

İnhibitör GABA mutantlarının hem aldecarb'a hem de PTZ'ye karşı aşırı duyarlılık gösterdiğini; ancak kolinerjik iletimin negatif regülasyonu eksik olan mutantların yalnızca aldecarb'a karşı aşırı duyarlılık gösterip PTZ'ye karşı normal duyarlılık sergilediğini kanıtlamış bulunmaktayız. Diğer sinaptik iletim mutantlarımız gibi aldecarb'a karşı da aşırı duyarlı oldukları için, UNC 43 fonksiyon kaybı mutantlarının PTZ karşısındaki durumunun ne olduğu merak edilebilir; 43 mutantları, nadir, tekrarlamayan ancak yine de spontan olan tüm vücut kasılmalarına sahip olsalar da, PTZ yokluğunda belirgin epileptik benzeri konvülsiyonlar sergilemezler. Buna rağmen, mililitre başına 10 mg PTZ içeren suya maruz kaldıklarında, 43 fonksiyon kaybı mutantları güçlü, tekrarlayan ve doza bağlı tüm vücut konvülsiyonları göstermektedir. Şu an için bu sonuçlar belirsizdir; ancak UNC 43'ün inhibitör GABAerjik iletimde spesifik bir rolü olmadığını veya yalnızca nörotransmitter salınımının negatif regülasyonunda bir rolü olduğunu göstermiş görünmektedir.

C. elegans sinir sisteminde, tamamlayıcı nöral stimülanlar olan kolinesteraz inhibitörü Aldicarb ve GABA reseptör antagonisti PTZ ile sinaptik iletim mutantlarının nasıl karakterize edileceğini gösterdik. Tamamlayıcı bir farmakolojik paradigma izlerken, bir nöral stimülan için duyarlılık derecesinin, diğer nöral stimülan için duyarlılık derecesini öngöremeyeceğini unutmayın. Aldicarb analizlerinin kullanımı, PTZ ile baş sallama (head bobbing) davranışı gösteren ancak Aldicarb'a karşı hipersensitif olan inhibitör GABA mutantlarını, yine PTZ ile baş sallayan ancak Aldicarb'a dirençli olan genel sinaptik fonksiyon eksikliği olan mutantlardan ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Ayrıca, inhibitör GABA mutantlarının PTZ ile baş sallama davranışı gösterdiği, kolinerjik iletimin negatif regülasyonu eksik olan solucanların ise PTZ üzerinde vahşi tip görünümünde olduğu fark edilmelidir.

Bu nedenle, PTZ deneyi, her ikisi de Alde carb'a aşırı duyarlı olan bu sinaptik iletim mutant sınıflarını birbirinden ayırmak için de kullanılabilir. Özetle, PTZ ve Alde carb deneylerini içeren tamamlayıcı bir yaklaşım, bir deneycinin C elegant sinaptik iletim mutantlarını, tek başına herhangi bir ilaçla mümkün olmayan bir şekilde karakterize etmesine olanak tanımalıdır. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.