C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

Merhaba, ben Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Caldwell Laboratuvarı'ndan Cody Locke. Ben Kyle Lee ve size aşırı karbonhidrat ve PTZ maruziyet tahlilleri için solucanları nasıl hazırlayacağınızı göstereceğim. Ben Bernard Tu ve size karbonhidrat tahlillerinin nasıl yapıldığını göstereceğim.

Ben Kaylin Berry ve deniz Elegance videolarından sorumluyum. Bu sunumda, bu sunumu anlatacağım ve PTZ maruziyet testini göstereceğim. Bugün meslektaşlarım ve ben, bir dizi temsili mutant suşla PTZ ve Alde karbonhidratına maruz kaldıktan sonra deniz zarafeti epilepsi modeliyle sinaptik iletim mutantlarının nasıl karakterize edileceğini göstereceğiz.

Öyleyse başlayalım. Kyle Lee, prosedürün ilk gününde ALD karbonhidrat tahlillerinin hazırlanışını göstererek bugün bize başlayacak. İkinci gün ALD karbonhidrat tahlilleri için her genotipten ve her kopyadan en az 30 genç yetişkin evre solucanının mevcut olacağından emin olun.

Bir deneycinin, besin kaynağı olarak e coli OP 50 ile oturtulmuş taze mantar ilacı içermeyen NGM plakalarına 50 veya daha fazla L dört aşamalı solucan seçmesi en iyisidir. Solucanları tutarlı ve izin verilen bir sıcaklıkta 12 ila 24 saat büyütün. 20 santigrat derece ila 22 santigrat derece en iyisidir, ancak 25 santigrat derece kabul edilebilir.

İkinci gün, 100 milimolar stok Al Decarb çözeltisi hazırlayın ve% 70 etanol uygun miktarda Al Decarb'ı NGM plakalarına yayın. 37,5 mikrolitre 100 milimolar alde karbonhidratı gm cinsinden 7,5 mililitre olan 60 milimetre havalandırmasız Petri plakalarına kaplayarak sürekli olarak 0,5 milimolar al Decarb kullanıyoruz. Alde karbonhidrat plakalarının oda sıcaklığında yaklaşık 30 ila 60 dakika kurumasına izin verin.

Plakalar kuruduktan sonra kapakların çatlamasına gerek yoktur. Her bir alde karbonhidrat plakasının ortasına tutarlı hacimlerde e coli ekleyin ve 30 ila 60 dakika daha kurutun. Oda sıcaklığında, tipik olarak 25 mikrolitre e coli OP 50 ekleriz.

Bu OP 50 hacmi, solucanları aşırı kalabalık olmadan tabağın ortasındaki küçük bir noktada tutmak için yeterli büyüklükte bir yiyecek çimi oluşturur. Yiyecek çimi kuruduktan sonra alba karbonhidrat tahlilleri ile devam edin. ALD karbonhidrat tahlillerinin öznel doğası nedeniyle, deneylerin körü körüne yapılması şiddetle tavsiye edilir.

Bunu yapmak için. Birincil deneycinin bir meslektaşı, test edilecek solucanları içeren orijinal plakaları yeniden etiketleyebilir veya meslektaşı, bir zamanlayıcıyı başlatmadan hemen önce solucanları orijinal plakalardan alde karbonhidrat plakalarını şifrelemek için aktarabilir. Artık plakalar yerleştirildiğine göre, bor ABO, analize başlamak için analize devam edecek, felçli solucanların sayısını sayacak.

Akut al dekarbın neden olduğu felci tanımlamak için iki ana yaklaşım vardır. İlk yaklaşım, faringeal pompalamanın kesilmesi ile felci tanımlar. Bu video notunda, ekranın sağındaki solucan farenksinin lümeni içinde yer alan karanlık bir yapı görülmektedir.

Bu yapıya öğütücü denir ve kolinerjik bir mekanizma ile ritmik olarak kasılır. Bu videodaki solucanın hareketi, Al Decarb'a maruz kalmaktan büyük ölçüde yavaşladı. Yine de bu solucanın faringeal öğütücüsü hala net bir şekilde hareket ediyor.

Bu nedenle, bu solucan pompalama tanımının kesilmesi ile felç olmaz. Bu videoda, ekranın sağında bulunan faringeal öğütücünün, al Decarb'ın neden olduğu felç için çalışma tanımı olarak pompalamanın durmasıyla kasılmadığını görmelisiniz. Bu solucan felçli olarak puanlanmalıdır.

Bununla birlikte, önceki videodaki solucan gibi, bu solucan da hafif yan yana yiyecek arama hareketleri sergiliyor. Al Decarb tarafından hareket kabiliyeti bozulmuş olmasına rağmen, bu hareketler bir deneycinin, al Decarb'ın neden olduğu felç, tam vücut hareketsizliği ve dokunmaya tepkisizliği tanımlamaya yönelik ikinci yaklaşımla bu solucanı felç ettiğini düşünmesini önleyecektir. Al decarb'ın neden olduğu felci tanımlamaya yönelik ikinci yaklaşım, her bir solucanı sürekli olarak bir platin tel ile dürtmeyi ve bir yanıt olup olmadığını kontrol etmeyi içerir.

Vücut hareketleri çıplak gözle tespit edilemiyorsa, tercih ettiğimiz yaklaşım, solucanlarımızı toplam üç saat boyunca her 30 dakikada bir iki kez kafasına ve kuyruğuna iki kez dürtmektir. Gördüğünüz gibi, bu videodaki solucan açıkça vücudunu hareket ettirmiyor. Bununla birlikte, bu solucan kuyruğunu açıkça hareket ettirerek dürtmeye tepki verdiği için, bu solucana felçli demiyoruz.

Al decarb'ın ikinci tanımı ile indüklenen felç. Önceki videodaki solucan gibi, bu solucan da vücudunu açıkça hareket ettirmiyor ve bu nedenle bir dürtme testi gerektiriyor. Yine de önceki videodaki solucanın aksine, bu solucan dürtmeye net bir şekilde yanıt vermiyor.

Bu nedenle, bu solucan, al decarb'ın neden olduğu felcin ikinci tanımı ile felç olur. Alde karbonhidrat tarafından felçli ve felçli olmayan arasındaki fark ince olabilse de, deneyciler, Al Decarb plakalarına alındıktan hemen sonra Al Decarb'a maruz kalan çok sayıda temsili solucanı gözlemleyerek önemli değişiklikleri ve sinaptik iletimi tanımlayabilmelidir. Yabani tip solucanlar hala hareketlidir.

Bu videoda. Bir saatlik Al Decarb maruziyetinden sonra önceki videodaki aynı vahşi tip solucanlar görülecektir. Solucanların bir dereceye kadar yavaşladığını, ancak yine de net bir şekilde hareket ettiğini unutmayın.

Yabani tip solucanların aksine, bu videodaki Tomasin one mutantları ya tamamen hareketsiz hale geliyor ya da bir saatlik maruziyetten sonra zar zor hareket ediyor. Bu sonuç, nöromüsküler kavşaklarda nörotransmitter salınımını negatif olarak düzenleyememe, asetilkolin bozunmasının inhibisyonu ile birlikte nöromüsküler kavşaklardaki aşırı asetilkolin ve sinaptik yarıklardan kaynaklanan aşırı asetilkolin sekresyonuna sahip olan tomasin one mutantları ile tutarlıdır, Bial Decarb, tomasin one mutantlarını aşırı duyarlı hale getirir, burada gösterilmese de, benzer sonuçların 43'te fonksiyon kaybı alelleri olan alde karbonhidrat testlerinden kaynaklandığı varsayılmıştır, kalsiyum cal Moulin'e bağımlı protein kinaz iki'nin C elegance ortologunu kodlar. Bu video, inhibitör GABAerjik iletimde eksik olan 25 mutantı göstermektedir.

Tomasin bir ve M 43 mutantlarına benzer şekilde alde karbonhidrata bir saat maruz kaldıktan sonra, bu mutantlar önemli alde karbonhidrat kaynaklı lokomotor e bozuklukları gösterir ve aynı süre boyunca al Decarb'a maruz kalan vahşi tip solucanlardan daha fazla etkilenmiş gibi görünmektedir. Bu sonuç, al Decarb maruziyeti ve azalmış GABAerjik iletimin bir kombinasyonundan aşırı uyarılmış vücut duvarı kaslarına sahip olan M 25 mutantları ile tutarlıdır, bu da CL EL'lerde, nöromüsküler kavşaklarda daha büyük bir uyarıcı-inhibitör iletim oranına ve müteakip felce yol açar. Yine de, 43'teki tomasin ve 25'teki mutantlar, bu zaman noktasında Al Decarb'a benzer hassasiyetler sergiledikleri için.

Vücut duvarı kaslarının aşırı uyarılması için farklı nedenlere sahip olmasına rağmen, bir deneyci, önce nedensel mutasyonların kimliklerini bilmeden aşırı duyarlılığın altında yatan mekanizmayı bilemezdi. Bu video için, ALD karbonhidrat tahlilimizin bu son noktasında üç saatlik al Decarb maruziyetinden sonra daha önceki bir videodaki aynı vahşi tip solucanlara geri döndük, bu solucanların vahşi tip olmalarına rağmen ya tamamen hareketsiz olduklarını ya da zar zor hareket ettiklerini açıkça görmeliyiz. Bu solucanlar şimdi fenotipik olarak alde karbonhidrat maruziyetinden bir saat sonra gösterilen TOM one ve M 25 mutantlarına benzer, çünkü muhtemelen uyarıcı kolinerjik iletim vahşi tip solucanların aksine karşılaştırılabilir seviyelere ulaşmıştır, Synap Bren one mutantları üç saatlik maruziyette önemli ölçüde hareketli kalır.

Bu sonuç, normal nörotransmitter sekresyon seviyelerine sahip olmayan, vücut duvarı kaslarında, şu anda aynı alde karbonhidrat maruziyetini takiben odun yabani tip solucanlara göre daha az kolinerjik stimülasyona sahip olan Synaptive Bren one mutantları ile tutarlıdır. Kolinerjik iletimde özellikle eksik olan dört mutantın noktası, Al Decarb'a Synaptive Bren one mutantları ile benzer hassasiyetlere sahip olmalıdır. Tersine, Tomasin bir ve O 25 aşırı duyarlı mutantlar, vahşi tip solucanlardan farklı olarak felçli kalır.

Bazı solucanların, özellikle Al Decarb'a dirençli olanların, plakadan sürünmeye çalışabileceğini belirtmekte fayda var. Bu durumda, deneyci, solucan hareketine fiziksel bir engel olan tutarlı miktarda palmitik asit yayabilir. Al Decarb plakalarının etrafına, mililitre etanol başına 25 mikrolitre 10 miligram palmitik asit yayıyoruz.

Bu, Al Decarb maruziyet paradigmasını tamamlar. Şimdi, Penta Yalın Terazol maruziyet paradigmasını göstereceğim. Kaylin Berry, PTZ tahlillerinde bize yardımcı olacak.

PTZ tahlilleri için solucanların hazırlanması, esasen alde karbonhidrat tahlilleri için solucanların hazırlanması ile aynıdır. İki tahlil arasındaki tek önemli fark şunlardır. PTZ çözücüsü olarak% 70 etanol yerine DDH iki O kullanıyoruz.

Ayrıca, sık sık ALDE karbonhidrattan daha büyük hacimlerde PTZ tabakladığımız için, OP 50 eklemeden önce plakaların en az bir saat kurumasına izin veriyoruz. Palmitik asit, PTZ ile de kullanılabilir. Ayrıca, PTZ'nin alde karbonhidrattan çok daha az kararlı olduğunu ve eksi 20 santigrat derecede saklanması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Analize başlamak için, her 30 dakikada bir toplam bir saat boyunca epileptik hafif sarsıcı solucanların sayısını sayın. Tonik-klonik dediğimiz ön kasılmalar ile vücut duvarı kas felçlerinin kombinasyonu veya tonik tonik dediğimiz tüm vücut felci dediğimiz tam vücut kasılmaları, ön kasılmalar dediğimiz baş Bobs dediğimiz ön kasılmaların kombinasyonu gibi ayrı kategorilerde farklı tipte kasılmalara sahip solucanların sayılarını puanlamak en doğrusudur. Sağdaki solucanda görüldüğü gibi nöbet benzeri aktivite, genellikle sol tonikte solucanda görüldüğü gibi tonik-klonik konvülsiyonları takip eder.

Nöbet benzeri aktivite, tekrarlayan tonik-klonik konvülsiyonları takiben kas yorgunluğundan kaynaklanabilir. Bununla birlikte, yayınlanmamış verilerimiz, bazı solucanların daha önce tonik-klonik olmadan al decarb kaynaklı felce benzer bir şekilde PTZ'de tonik hale gelebileceğini göstermektedir. Burada, çeşitli hayvan nöbet ve epilepsi modellerinde PTZA, GABA, reseptör antagonisti ve ortak nöbet indükleyicisinin yokluğunda sürünen temsili bir sinaptik iletim mutant solucanı gösteriyoruz.

Yiyecek ararken solucanın ucunun veya burnunun bir yandan diğer yana sallandığına dikkat edin. Bu videoda, önceki videoda kullanılan aynı sinaptik iletim mutant suşundan başka bir solucan gösteriyoruz. Mililitre su başına 2,5 miligram PTZ varlığında olan bu solucanın, yiyecek ararken çoğunlukla başını bir yandan diğer yana hareket ettirmeye devam ettiğine dikkat edin.

Yine de bu solucan ara sıra bir yandan diğer yana yiyecek aramayı durdurur ve bunun yerine tekrar tekrar önünü öne doğru iter. Son olarak, önceki iki videodaki solucanlarla aynı mutasyonu taşıyan bir solucanı, mililitre su başına 10 miligram PTZ varlığında görmelisiniz. Bu solucanın yan yana yiyecek aramayı azalttığına ve daha düşük PTZ konsantrasyonundan daha büyük bir frekans ve yoğunlukla ön tarafını ileri doğru ittiğine dikkat edin.

Bu sonuçlar, tüm PTZ'ye duyarlı sinaptik transmisyon mutantlarında gözlemlediğimiz PTZ'nin doz bağımlılığını göstermektedir. Daha da önemlisi, PTZ'ye maruz kalmak, vahşi tip solucanlarda epileptik benzeri konvülsiyonları indüklemek için yeterli değildir. Benzer şekilde, dörtte olduğu gibi kolinerjik iletimde spesifik eksiklikleri olan solucanlarda veya tomasin gibi aşırı kolinerjik iletimi olan solucanlarda PTZ'nin neden olduğu epileptik benzeri konvülsiyonları denedik, ancak gözlemlemedik.

Bu nedenle, PTZ'ye göreceli duyarlılıklarına bağlı olarak, genel sinaptik fonksiyondaki eksikliklerden veya kolinerjik iletimdeki spesifik eksikliklerden alde karbonhidrat direncine sahip sinaptik iletim mutantlarını daha fazla karakterize etmek mümkün olmalıdır. Belki de şaşırtıcı bir şekilde, C zarafetinde tespit edilebilir GABA ifadesinden yoksun olan ONC 25 mutantının işlevinde güçlü bir azalma. İnhibitör motor nöronlar, bu videoda görüldüğü gibi spontan epileptik ışık konvülsiyonları göstermez.

Mililitre su başına 10 miligram PTZ üzerinde bir ONC 25 mutantı. Bununla birlikte, sağlam tonik-klonik konvülsiyonlar sergiler, ancak sadece anterior konvülsiyonlar gösterilmese de, bazı hareketlerle ONC 25 ilişkili tonik-klonik konvülsiyonlardan önce gelir ve synap Bren one mutantlarının konvülsiyonlarını taklit eder. Bu nedenle, bir deneyci, tüm inhibitör GABA mutantlarının, özellikle hipomorfik mutant aleller elde etme olasılığı göz önüne alındığında, PTZ varlığında tonik-klonik konvülsiyonlar veya yakından ilişkili tonik nöbet benzeri aktivite sergileyeceğini varsaymamalıdır.

Artık inhibitör GABA mutantları tarafından alde karbonhidrata ve PTZ'ye karşı aşırı duyarlılık gösterdik, ancak yalnızca alde karbonhidrata karşı aşırı duyarlılık ve kolinerjik iletimin negatif regülasyonundan yoksun mutantlar tarafından PTZ'ye normal duyarlılık gösterdik. UNC 43 fonksiyon kaybı mutantlarının PTZ'de nasıl göründüğü merak edilebilir, çünkü onlar da diğer sinaptik iletim mutantlarımız gibi Alda karbonhidratına karşı aşırı duyarlıdırlar, 43 mutanttaki mutantlar, PTZ yokluğunda bariz epileptik benzeri konvülsiyonlar sergilemezler, ancak bu mutantların nadir görülen tekrarlayan olmayan, ancak yine de spontan tam vücut kasılmaları vardır, ancak 43'te mililitre su başına 10 miligram PTZ'ye maruz kaldıktan sonra, fonksiyon kaybı mutantları, sağlam, tekrarlayan ve doza bağımlı tüm vücut konvülsiyonları mevcuttur. Şu anda, bu sonuçlar belirsizdir, ancak 43'ün inhibitör GABAerjik iletimde spesifik bir rolü olmaması gerektiğini veya nörotransmitter salınımının sadece negatif regülasyonunda bir rolü olmaması gerektiğini göstermektedir.

C elegance sinir sisteminde, CL elgan sinaptik iletim mutantlarını ücretsiz nöral uyarıcılar, alde karbonhidrat, bir kolinesteraz inhibitörü ve PTZA GABA reseptör antagonisti ile nasıl karakterize edeceğinizi gösterdik. Tamamlayıcı bir farmakolojik paradigmayı takip ederken, bir nöral uyarıcıya duyarlılık derecesinin diğer nöral uyarıcıya duyarlılık derecesini tahmin edemeyeceğini unutmayın Alde karbonhidrat tahlillerinin kullanılması, Bob'u PTZ'ye yönlendiren, ancak Alde karbonhidratına genel sinaptik fonksiyon eksikliği olan mutantlardan aşırı duyarlı olan inhibitör GABA mutantlarını ayırt etmeye yardımcı olmalıdır, bu da Bob'u PTZ'ye yönlendiriyor, ancak alde karbonhidrata karşı dirençli. Ayrıca, inhibitör GABA mutantlarının PTZ'de Bob'a kafa attığı, kolinerjik iletimin negatif regülasyonuna sahip olmayan solucanların ise PTZ'de vahşi tip göründüğü anlaşılmalıdır.

Bu nedenle, PTZ testi, her ikisi de Alde karbonhidratına aşırı duyarlı olan bu sinaptik iletim mutantları sınıflarını ayırt etmek için de kullanılabilir. Özetle, PTZ ve Alde karbonhidrat tahlilleri ile tamamlayıcı bir yaklaşım, bir deneycinin C zarif sinaptik iletim mutantlarını tek başına her iki ilaçla da imkansız olan bir şekilde karakterize etmesine izin vermelidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.