Name: Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin SDD-AGE yöntemiyle amiloid benzeri polimerleri taramayı. Bu biyokimya tekniği, yüksek verimli protein analizi için ölçeklenebilir ve güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokolü gelişmekte olan yardım için Simon Alberti teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM25874), Howard Hughes Tıp Enstitüsü Investigatorship (SL) ve Ulusal Bilim Vakfı predoctoral eğitim bursu (RH) bir hibe ile desteklenmiştir.

<html> Bölüm 1: jel hazırlanması <ol><li> Jel döküm tepsi birleştirin. Standart donanım yatay DNA elektroforezi için kullanılabilir. Çok sayıda numune için, 20 cm kadar dört adet 50-iyi tarak x 24 cm döşeme hazırlar. Bu leke görüntüsünü bozabilir levha, çizik yoktur emin olun. </li><li> 1X TAE% 1.5 agaroz çözeltisi (orta veya yüksek jel gücü, düşük EEO) oluşturun. Hacmi tamamen daldırın tarak dişleri için yeterli olmalıdır tespiti en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca çok örnek yüklemek isteyeceksiniz. Mikrodalga karışımı agaroz tamamen eriyene kadar. </li><li> Hızla% 10 oranında hisse senedi% 0,1 SDS ekleyin. Çalkalanarak karıştırılır. Bu adım sırasında bazı agaroz katılaşır varsa, sıcak bir tabak kullanılarak çözülür ve kaynar önlemek için dikkatli olun. </li><li> Çözüm döküm tepsiye dökün. Daha sonra transferi etkileyebilecek herhangi bir kabarcıkları dışarı komisyon bir tarak kullanın. </li><li> Sonra jel seti, tarak kaldırmak jel ve jel tankının içine yerleştirin. Tamamen daldırın 1X TAE jel SDS% 0.1 içeren. </li></ol> Bölüm 2: numunelerin hazırlanması <ol><li> Maya lizatları yüksek verimlilik analizi için, bir gecede 96-iyi blokların hızlı ajitasyon yetiştirilen 2 ml kültürleri ile başlar. Bu durumda, her kültürün ilgi eksprese bir protein. Düşük bolluk proteinleri analiz ederken, büyük kültür hacimleri kullanılması gerekir </li><li> Hasat hücreler santrifüj yoluyla oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 RCF. </li><li> Su ve santrifüj hücrelerin tekrar süspanse edin. </li><li> 1 ml spheroplasting çözelti içinde süspanse edin. Yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe 30 ° C (Mikroskop ile spheroplasting verimliliği onaylamak). </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 RCF santrifüjleyin. Tamamen süpernatant kaldırmak. </li><li> 100 ml lizis tamponu pelet spheroplasts tekrar </li><li> 2 dakika için yüksek hızlı bant ve vorteks blok örtün. </li><li> 2 dakika süreyle 4000 RCF Pelet hücre kalıntıları vardır. </li><li> Dikkatle yeni bir konteyner, örneğin, bir 96-PCR plate supernatant çıkarın. </li><li> İsterseniz, lizatları protein konsantrasyonu belirler. </li><li> 1X numune tamponu içeren lizatları üretmek için numuneler 4X numune tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Jel Yük. İsterseniz, örnek hacmi yarısı kaydetmek ve SDS-PAGE analizi için kaynatın. Transfer ölçüde daha sonra izlemek için, bir ön-lekeli SDS-PAGE işaretleme içerir. Ayrıca, çok büyük proteinleri (örneğin, tavuk pektoralis özü) oluşan bir moleküler ağırlık belirteci çözülmesi kompleksleri boyutlarını tahmin etmek için kullanılabilir. </li><li> Boya ön jel sonundan itibaren yaklaşık 1 cm ulaşır kadar alçak gerilim (≤ 3 V / cm jel uzunluğu) çalıştırın. Bu birkaç saat sürebilir. Jel serin kalması çok önemlidir, aksi halde düşük molekül ağırlıklı protein (örneğin, monomerler) difüzyon tespit sınırı. </li></ol> Bölüm 3: Transfer <ol><li> Nitroselüloz, jel gibi aynı boyutta bir parça kesin. </li><li> GB004 20 adet ve 8 adet GB002 blot kağıt, jel gibi aynı boyutta kesin. Kes bir fitil olarak kullanılmak üzere ek bir parça GB004 jel yaklaşık 20 santimetre daha geniş yapmak. </li><li> 1X TBS nitroselüloz, fitil, 4 adet GB002, bırakın. </li><li> 20 adet kuru GB004, daha sonra 4 adet kuru GB002, daha sonra tek parça ön ıslak GB002: Bir plastik kap, aşağıdaki gibi bir yığın kağıtları bir araya. Nitroselüloz bu yığının üstüne yatırın. </li><li> Aşırı çalışan tampon kaldırmak için su döküm tepsi kısaca jel durulayın. Sonra, dikkatle jel yığının üzerine tepsi kapalı slayt başlar. Tepsiyi kapalı jel sürme, gerektiğinde TBS ile membran söndürmeye. Ekstra tampon jel altında sıkışmış olmanın kabarcıkları önlemeye yardımcı olur. Bu amaçla transfer pipet iyi çalışır. </li><li> Jel yığınına taşındıktan sonra, kabarcıklar iyice kontrol edin. Herhangi biri mevcutsa, jel kenar kaldırın ve kabarcıkları dışarı çalıştı kadar tampon yeniden uygulayın. </li><li> Jel üstünde kalan üç önceden ıslatılmış GB002 adet koyun. Yığının üst kısmında bir pipetle iyice haddeleme tüm katmanları arasındaki kapsamlı temas olun. </li><li> TBS içeren iki yükseltilmiş tepsiler Kanat transfer yığını. Öncesi ıslak fitil fitil ya sonunda TBS batmış olduğunu yığını karşısında Örtüsü. </li><li> Ekstra ağırlık taşıyan (örneğin, 500 ml şişe su) ek bir plastik tepsi ile bir araya transferi yığını örtün. </li><li> En az üç saat veya gece boyunca devam transferine olanak sağlar. </li><li> Aktarımdan sonra, membran standart Western blot tarafından işlenebilir. </li></ol> Spheroplasting Çözüm 1,2 M D-sorbitol 0.5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7.5 50 mM BME (taze eklemek) 0.5 mg / ml Zymolyase 100T (taze eklemek) coration: underline &quot;&gt; Lizis Tampon 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (taze eklemek) proteaz inhibitörleri (taze eklemek) 4X Örnek Arabelleği 2X TAE % 20 gliserol % 8 SDS tercihinize Bromophenol Mavi

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-YAŞ ilk Kryndushkin ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir 1, SDS-dirençli kompleksleri çalışma [PSI +] maya prion, ve o zamandan beri hem prion ve prion olmayan agrega 2-9 okuyan yaygın kullanımı bulmuştur. Ancak, bir agaroz jel bir zar aşağıdaki elektroforez, proteinlerin transferi sorunlu ve çarpık bir leke görüntü 5 neden olabilir . Ayrıca, en sık kullanılan batık electroblotting tekniği jel boyutu için pratik sınırlamalar tanıtır ve böylece işlenebilir örneklerin sayısı. Biz aşağı kılcal transfer 10, jel nitroselüloz membran proteinleri aktarmak için bir yığın kuru blot kağıtları kullanan basit bir prosedür kullanılarak bu sorunları ele alınmıştır. Kılcal transfer bozulmasını engeller ve büyük jeller kolay işlenmesine olanak verir. SDD-YAŞ kullanarak önce dikkate alınması gereken bir kaç şey vardır. Ham örnekler için (örneğin, lizatları), spesifik proteinlerin İmmuno gerekli. SDD-AGE tamamen ilgi protein kompleksleri doğasını değildir, protein (lar) tespit edilmesi, amiloidojenik bölgenin dışında bir epitopu etiketi taşımalıdır. Lizatları genellikle normal bir SDS-PAGE olacağı gibi iki önemli farklılıklar hazırlanmış olabilir. İlk olarak, proteoliz tarafından bozulmasını önlemek için artan dikkat edilmelidir. Burada kullanılan kısmen denatüre koşulları proteazlar inaktive etmek için yeterli değildir ve de proteoliz hedef proteinler daha duyarlı yapabilirsiniz. En az iki kat önerilen konsantrasyonda tam bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanın. İkincisi, numunelerin ısıtma kaçınılmalıdır. Bir all-monomer negatif kontrol isteniyorsa, örneğin yüksek molekül ağırlıklı türler monomerik protein en amiloidleri geri kovalent modifikasyonlar, 10 dakikalık bir inkübasyon 95 ° C kullanılabilir nedeniyle olmadığını onaylamak için.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz İnhibitör Kokteyli</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra nitroselüloz</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 blot kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) blot kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

yarı denatüre deterjan-agaroz jel elektroforez amiloid toplama taraması

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amiloid agregasyonu conformationally olan pek çok protein misfolding patolojiler ve temelini prionlar bulaşıcı özellikleri, kendi kendine şablonu daha aşağı organizmalardan yararlı rolleri olduğu düşünülmektedir proteinler. Ile ilişkili. Amiloidleri çıkılmazlık ve yapısal heterojenite nedeniyle çalışma için herkesin bildiği gibi zor olmuştur. Ancak, boyutu ve deterjan çıkılmazlık dayalı amiloid polimerler çözünürlüğü mümkün hale olmuştur Yarı denatüre Deterjan Agaroz Jel Elektroforezi (SDD-AGE). Bu tekniğin yaygın kullanımı amiloid konformasyonel türevlerini tespit edilmesi ve karakterizasyonu için bir bulgudur. Burada, roman prionlar ve diğer amiloidojenik proteinler için ekranlar gibi büyük ölçekli uygulamaları, kullanımı kolaylaştıran bu tekniğin bir uyum göstermektedir. Daha fazla güvenilirlik için yeni SDD-AGE bir yöntem kılcal transferi kullanır ve kullanım kolaylığı, ve herhangi bir büyüklükteki jel yer sağlar. Böylece, hücre veya saflaştırılmış proteinlerin hazırladığı numuneler çok sayıda, etiketli proteinlerin SDS-çözünmez conformers varlığı için aynı anda işlenebilir.

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Amyloid agregasyonu, çok sayıda protein katlanma bozukluğu patolojisi ile ilişkilidir ve prionların enfeksiyöz özelliklerinin temelini oluşturur; bunlar...

Merhaba, ben MIT biyoloji bölümündeki Susan Linus Laboratuvarı'nda lisansüstü öğrencisi Randall Hoffman. Bugün sizlere yarı denatüre deterjan agaroz jel elektroforezini veya SDD-AGE'yi tanıtacağım. Laboratuvarımız bu tekniği, prionlar ve diğer amilojenik proteinleri taramak için kullanmaktadır.Bizim SDD yaşlandırma versiyonumuz basit ve güvenilirdir; herhangi bir örnek sayısını karşılayacak şekilde ölçeklendirilebilir. Amiloidler, SDS ile denatürasyona karşı olağanüstü dirençlidir ve bu durum onların SDDH kullanılarak diğer proteinlerden ayrılmasını sağlar. Ancak, SDDH'den elde edilen veriler tek başına bir maddenin amiloid olduğunu doğrulamak için kullanılamaz.Bunu yapmak için diğer teknikleri kullanmanız gerekir. Bunu göz önünde bulundurarak, size göstereyim. S-D-D-H-S-D-D-H, yatay DNA elektroforezi için kullanılan standart ekipmanlar ile gerçekleştirilebilir.İlk olarak, jel döküm tepsisini monte etmeniz gerekir. Aparatın boyutu, kaç adet örneğiniz olduğuna bağlı olarak değişecektir. Çok sayıda örnek için, 20'ye 24 santimetrelik bir plaka ve dört adete kadar 50 kuyucuklu tarak kullanıyoruz.Jeli hazırlamak için orta veya yüksek jel mukavemetli düşük EEO agroz, 1X TAE tamponu ve %10'luk SDS stok çözeltisine ihtiyacınız olacak. %1,5'luk bir agroz ve 1X TAE çözeltisi hazırlayın. En fazla örneği yükleyebilmek ve deteksiyonu maksimize etmek için jeli mümkün olduğunca kalın hazırlamanız gerekir. Agroz tamamen çözünene kadar karışımı mikrodalga fırında ısıtın.100 XSDS stok çözeltisini hızla %0,1'e ekleyin ve karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın. Bu adım sırasında bazı agrar katılaşırsa, bir ısıtıcı tabla üzerinde çözün. Kaynamamasına dikkat edin.SDS eklendikten sonra çözelti kolayca köpüreceği için, bu çözeltiyi henüz sıcakken döküm tepsisine boşaltın. Daha sonra, jel transferi sırasında ileride sorun oluşturabilecek hava kabarcıklarını gidermek için bir tarak kullanın. Jel tamamen soğuyup katılaştıktan sonra, tarakları dikkatlice çıkarın ve jeli tankın içine yerleştirin.Jeli, %0.1 SDS içeren 1X TAE çözeltisine tamamen daldırın. Artık örneklerinizi yüklemeye hazırsınız. SDDH'de kullanılan protein örnekleri, iki önemli istisna dışında tıpkı bir SDS-PAGE'deki gibi hazırlanır.İlk olarak, agregatların protein monomerlerine denatüre olmasına neden olabilecek ısıtma işlemlerinden kaçınmalısınız. İkinci olarak, protein degradasyonunu önlemeye dikkat edin. Burada kullanılan denatüre edici koşullar tüm proteazları inaktive etmek için yeterli olmadığından, önerilen konsantrasyonun en az iki katı oranında komple bir proteaz inhibitör kokteyli kullanmanızı öneririz.Bu gösterimde, ilgilenilen belirli bir proteini aşırı eksprese eden maya hücrelerinden elde edilen lizatları kullanacağız. Genellikle VWR'den temin edilebilen 96 kuyucuklu bloklarda büyütülen 2 mL gece boyu kültürler kullanırız; ancak düşük bolluktaki proteinler analiz edilirken daha büyük kültür hacimleri kullanılmalıdır.Kültürü oda sıcaklığında 2000 RCF'de beş dakika santrifüjleyerek hücreleri hasat edin; santrifüj işleminin ardından üst fazı uzaklaştırın ve hücreleri suda yeniden süspanse edip tekrar santrifüjleyerek yıkayın. İkinci çevirme işleminden sonra üst fazı uzaklaştırın ve hücreleri uygun plaka solüsyonunda yeniden süspanse edin. Solüsyondaki enzimler, hücrelerin küçük bir lizis tamponu hacmiyle verimli bir şekilde lizize edilmesini sağlayacak şekilde hücre duvarlarını sindirecektir. 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Yedek plastik hücreleri bu kez 800 RCF'de beş dakika boyunca pelletleyin. Üst fazı tamamen uzaklaştırın ve her bir pelleti 100 µL lizis tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, bloğun üzerini bantla kapatın ve yüksek hızda iki dakika boyunca vorteksleyin.Bu işlem, tüm küresel plastiklerin hücresel kalıntıları 4,000 RCF'de, iki dakika boyunca çöktürmesine yardımcı olur. Süpernatantı dikkatlice 96 kuyucuklu bir PCR plakasına aktarın.Laboratuvarımızda genellikle aynı anda yüzlerce örneği analiz ettiğimiz için bu süreçte bize yardımcı olması amacıyla bir sıvı taşıma sistemi kullanıyoruz. İstenirse, lizatların protein konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, bir x örnek tamponu içeren lizatlar oluşturmak için örneklere dört x örnek tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Şimdi örnekleri jelle yükleyin. İstenirse, örneklerin yarısı SDS page analizi için saklanabilir. Ayrıca, önceden boyanmış markerlar ve tavuk flector s ekstraktı gibi çok yüksek moleküler ağırlıklı bir marker dahil olmak üzere moleküler ağırlık markerlarını yükleyin.Arzu edilirse, düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin difüzyonunu önlemek için jeli soğuk tutmak önemlidir, bu nedenle işlemi soğuk odada gerçekleştirmek isteyebilirsiniz. Jeli, jel uzunluğunun santimetresi başına üç volttan daha düşük bir düşük voltajda çalıştırın. Boya cephesi jelin sonuna yaklaşık bir santimetre kalana kadar jeli birkaç saat boyunca çalıştırın.Amyloid, oda sıcaklığında %2 SDS ile denatüre olmadığı için, çoğu non-amyloid agregat dahil olmak üzere diğer kompleksler %2 SDS varlığında ayrışırken amyloid yapısı bozulmadan kalacaktır. Bu nedenle, çoğu protein monomerik halde olacak ve jel boyunca hızla ilerleyecektir. SDS'ye dirençli yüksek moleküler ağırlıklı amyloidler ise daha yavaş göç edecektir.Bunun ardından jel, aktarıma hazır hale gelecektir. Birden fazla aktarım yöntemi kullanılabilse de, en iyi sonuçları kapiler aktarım kullanarak elde etmekteyiz. Kapiler aktarım her boyut jellle uyumlu olduğundan, kapiler aktarımda yüzlerce örneği analiz etmek pratiktir.Kuru blotting kağıtlarından oluşan bir yığın, tampon çözeltiyi jel üzerinden çekerek proteinlerin, kağıtlar ile jel arasına yerleştirilen bir nitroselüloz membrana çökelmesini sağlar. Yüksek bağlayıcı C ekstra gibi bir nitroselüloz parçasını, jelin boyutlarıyla aynı olacak şekilde kesmeniz gerekecektir. Ayrıca, jelle aynı boyutta 20 adet GBO 04 ve 8 adet GBO 02 blotting kağıdı kesmeniz gerekecektir.GB04 oldukça kalın ve emicidir. GB02 ise çok daha ince ve daha hassas bir dokuya sahiptir, bu da membranla daha eşit bir temas sağlanmasına yardımcı olur. Fitil olarak kullanılmak üzere ek bir GB04 parçası kesin ve bunu, daldırılan jelden yaklaşık 20 santimetre daha geniş olacak şekilde hazırlayın.Nitroz UL WIC, dört adet GBO o2 ve bir adet XTBS plastik bir kapta şu şekilde üst üste dizilir: 20 adet kuru GBO o4, ardından dört adet kuru GBO o2 ve son olarak bir adet önceden ıslatılmış GBO o2.Nitrocellulose membranı bu yığının üzerine yerleştirin. Fazla koşma tamponunu uzaklaştırmak için döküm tepsisindeki jeli kısaca suyla durulayın. Ardından, gerektiğinde membranı TBS ile nemlendirerek, jeli dikkatle tepside kaydırıp yığının üzerine aktarmaya başlayın.Ekstra tampon, kabarcıkların jel içinde hapsolmasını önlemeye yardımcı olur. Jel tamamen yığına taşındıktan sonra, transfer pipeti bu amaç için etkili bir şekilde çalışır. Varsa kabarcıkların olup olmadığını dikkatlice kontrol edin.Kabarcıklar giderilebilene kadar jel kenarını kaldırıp tampon çözeltiyi yeniden uygulayın. Önceden ıslatılmış kalan üç GBO parçayı jelin üzerine yerleştirin. Bir pipeti yığının üst kısmı boyunca sıkıca yuvarlayarak tüm katmanlar arasında tam temas sağlandığından emin olun.Transfer diziliminin yanlarına TBS içeren iki yükseltilmiş tepsi yerleştirin ve önceden ıslatılmış fitili, her iki ucu da sıvıya batacak şekilde dizilimin üzerine yayın. Birleştirilmiş transfer dizilimini, üzerine 500 ml'lik bir su şişesi gibi ek ağırlık konulmuş ek bir plastik tepsi ile TBS içinde kapatın. Fitil, tepsilerdeki tamponu çekecek ve kuru blot kağıtları, birkaç saatlik süre boyunca tamponun jel boyunca ilerlemesini sağlayacaktır.Bu işlem proteinlerin membrana çökelmesini sağlayacaktır; transferin en az üç saat veya gece boyunca devam etmesine izin verin. Kapiler transfer tamamlandıktan sonra, membran standart western blotting ile işlenebilir. Burada, belirli proteinlerin amiloid oluşturmasına yatkınlık sağlayan bir maya suşunda aşırı eksprese edilen proteinlerin tipik bir blot görüntüsünü görüyorsunuz.Burada ve burada gösterilenler gibi bazı adaylarımızın amiloid veya yüksek moleküler ağırlıklı SDS'ye dirençli türleri çok iyi oluşturduğunu açıkça görebilirsiniz. Öte yandan diğerleri, şunlarda ve şunlarda olduğu gibi, agregat oluşturmazlar ve tamamen monomerik yapıdadırlar. Ayrıca, bu iki şeritte görebileceğiniz üzere, amiloid polimerlerin boyutunun proteine bağlı olarak farklılık gösterdiğini görebilirsiniz.Sizlere, aday prionların amiloidleri gibi yüksek moleküler ağırlıklı, çözünmeyen agregatların analizi için basit bir yöntem gösterdik. Sunumumuzu izlemekten keyif aldığınızı umuyor, bu tekniği immünojenik protein çalışmalarında faydalı bulmanızı diliyoruz. İzlediğiniz için teşekkür eder, araştırmalarınızda başarılar dileriz.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan kortikal homojenatlarında açıklık, SDS-PAGE ile protein ayırma, antijen alımı ve Aβ peptid antikor immunoblotting hazırlanması için kullanılan bir tekniktir açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz sürekli olarak insanlarda Alzheimer patolojisi olan kortikal doku monomerik ve multimer Aβ algılar.

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu video, amiloid liflerinin iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezi bazlı ayrımını göstermektedir. Teknik, polimorfik amiloid agregatlarını heterojen boyutlarına göre ayırır.

İki Boyutlu Yarı Denatüre Edici Agaroz Jel Elektroforezi: Polimorfik Amiloid Liflerini Boyut Heterojenliğine Göre Ayırmak İçin Bir Teknik

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Bu çalışma, GFAP ve hastalık neden olan mutasyonlarını biyokimyasal olarak karakterize etmek için filament montajı, toplama ve translasyon sonrası modifikasyona odaklanan deneysel yöntemleri ortaya koymaktadır. Yüksek saflıkta GFAP proteinleri analiz edildi ve Alexander hastalığı mekanizmalarına dair bilgiler ortaya çıkarıldı; bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek ve GFAP mutasyonları ile ilgili bozuklukları anlamak için bir çerçeve sağlayabilecektir.

Glial Fibriller Asitli Protein ve Hastalıkla İlgili Varyantlarının Biyokimyasal Analizi İçin Deneysel Yaklaşımlar

Öğrenin SDD-AGE yöntemiyle amiloid benzeri polimerleri taramayı. Bu biyokimya tekniği, yüksek verimli protein analizi için ölçeklenebilir ve güvenilir bir protokol sunar.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Daha fazla video keşfet