Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Merhaba, ben Randall Hoffman, MIT biyoloji bölümünde Susan Linus Laboratuvarı'nda yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün sizi yarı denatüre edici deterjan agro rose, jel elektroforezi veya SDD age ile tanıştıracağım. Laboratuvarımız bu tekniği prionları ve diğer alojenik proteinleri taramak için kullanır.

SDD age versiyonumuz basit ve güvenilirdir ve herhangi bir sayıda numuneyi barındıracak şekilde ölçeklendirilebilir. Amiloidler, SDDH kullanılarak diğer proteinlerden ayrılmalarına izin veren SDS ile denatürasyona karşı son derece dirençlidir. Bununla birlikte, SDDH'den gelen veriler tek başına bir şeyin amiloid olduğunu doğrulamak için kullanılamaz.

Bunu yapmak için başka teknikler kullanmanız gerekir. Bunu aklımda tutarak, size göstereyim. S-D-D-H-S-D-D-H, yatay DNA elektroforezi için standart ekipman kullanılarak gerçekleştirilebilir.

İlk olarak, jel döküm tepsisini monte etmeniz gerekir. Aparatın boyutu, kaç numuneniz olduğuna bağlı olacaktır. Çok sayıda numune için 20 x 24 santimetrelik bir levha ve dört adede kadar 50 kuyulu tarak kullanıyoruz.

Jeli hazırlamak için orta veya yüksek jel mukavemeti düşük, EEO agros, bir XTAE tamponu ve %10'luk bir SDS stok çözeltisine ihtiyacınız olacak% 1.5 AROS çözeltisi ve bir XTAE'ye ihtiyacınız olacak. Jeli mümkün olduğunca kalın yapmak isteyeceksiniz, böylece en fazla numuneyi yükleyebilir ve algılamayı en üst düzeye çıkarabilirsiniz. Karışımı aros tamamen eriyene kadar mikrodalgada ısıtın.

100 XSDS stoğunu hızlı bir şekilde %0,1'e ekleyin ve karıştırmak için döndürün. Bu adımda bir miktar agro katılaşırsa, kırmızı, sıcak bir plaka üzerinde çözün. Kaynamasına izin vermemeye dikkat edin.

Çözelti kolayca köpüreceği için SDS'yi ekledikten sonra, bu çözeltiyi hala sıcakken döküm tepsisine dökün. Ardından, daha sonra jel transferi sırasında müdahale edebilecek kabarcıklardan kurtulmak için bir tarak kullanın. Jel tamamen soğuduktan ve katılaştıktan sonra, tarakları dikkatlice çıkarın ve jeli tanka yerleştirin.

Jeli %0.1 SDS ile tek bir XTAE'ye tamamen daldırın. Artık numunelerinizi yüklemeye hazırsınız. SDDH'de kullanılan protein örnekleri, iki önemli istisna dışında tıpkı bir SDS sayfasındaki gibi hazırlanır.

İlk olarak, agregaları protein monomerlerine denatüre edebilecek numuneleri ısıtmaktan kaçınmalısınız. İkincisi, protein bozulmasını önlemeye dikkat edin. Burada kullanılan denatüre etme koşulları tüm proteazları inaktive etmek için yeterli olmadığından, tam bir proteaz inhibitörü kokteylinin önerilen konsantrasyonunun en az iki katını kullanmanızı öneririz.

Bu gösteride, belirli bir ilgilenilen proteini aşırı eksprese eden maya hücrelerinden lizatları kullanacağız. Genellikle gece boyunca iki mil kullanırız. 96'da yetiştirilen kültürler, VWR'den elde edilebilen iyi bloklar, ancak düşük bolluktaki proteinleri analiz ederken daha büyük kültür hacimleri kullanılmalıdır.

Santrifüjlemeyi takiben kültürü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 RCF'de santrifüjleyerek hücreleri hasat edin, supra natanı çıkarın ve hücreleri Resus suda süspanse ederek ve ikinci döndürmeden sonra tekrar santrifüjleyerek yıkayın, süpernatanı çıkarın ve hücreleri yedek kaplama çözeltisinde reçineleyin. Çözeltideki zy, hücre duvarlarını sindirir, bu da hücreleri verimli bir şekilde yalan söylemenize ve küçük bir hacimde lizis tamponu yapmanıza olanak tanır. 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Yedek plastik hücreleri bu sefer 800 RCF'de beş dakika boyunca peletleyin. Doytuyu tamamen çıkarın ve her bir peleti ve 100 mikrolitre lizis tamponunu yeniden süspanse edin. Ardından, bloğu bantla örtün ve iki dakika boyunca yüksek hızda girdaplayın.

Bu, tüm küre plastiklerinin hücresel kalıntıları 4.000 RCF'de LY P'ye çıkarmasına yardımcı olur. İki dakika boyunca. S natin'i dikkatlice 96 oyuklu bir PCR plakasına aktarın.

Tipik olarak, laboratuvarımızda bir seferde yüzlerce numuneyi analiz ederiz, bu nedenle bu konuda bize yardımcı olması için bir sıvı işleme sistemi vardır. İstenirse, lizatların protein konsantrasyonunu belirleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edilen bir x numune tamponu içeren lizatlar oluşturmak için numunelere dört x numune tamponu ekleyin.

Şimdi numuneleri jelin içine yükleyin. İstenirse, SDS sayfa analizi için örneklerin yarısını kaydedin. Ayrıca, önceden boyanmış işaretleyiciler ve tavuk flektörünün özü gibi çok yüksek moleküler ağırlıklı bir işaretleyici dahil olmak üzere moleküler ağırlık işaretleyicilerini yükleyin.

İstenirse, düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin difüzyonunu önlemek için jeli soğuk tutmak önemlidir, bu nedenle soğuk odada çalıştırmak isteyebilirsiniz. Jeli, jel uzunluğunun santimetresi başına üç volttan daha az düşük voltajda çalıştırın. Çap jelin ucundan yaklaşık bir santimetreye ulaşana kadar jeli birkaç saat çalıştırın.

Amiloid, oda sıcaklığında% 2 SDS ile denatüre edilmediğinden, çoğu amiloid olmayan agregat da dahil olmak üzere diğer kompleksler% 2 SDS varlığında ayrışırken bozulmadan kalacaktır. Böylece, çoğu protein monomerik olacak ve jelden hızlı bir şekilde geçecektir. SDS'ye dirençli yüksek moleküler ağırlıklı amiloidler daha yavaş göç edecektir.

Bundan sonra, jel transfer için hazır olacaktır. Birden fazla transfer yöntemi kullanılabilse de en iyi sonuçları kılcal transfer kullanarak elde ediyoruz. Kılcal transfer her boyutta jeli barındırabildiğinden, kılcal transferde yüzlerce numuneyi analiz etmek pratiktir.

Bir kuru kurutma kağıdı yığını, jel biriktiren proteinlerden tampon çekmek için işlev görür ve kağıtlar ile jel arasına yerleştirilen bir nitroselüloz membran üzerine yerleşir. Jel ile aynı boyutlara ekstra olarak yüksek bağ C gibi bir nitroselüloz parçası kesmeniz gerekecektir. Ayrıca jel ile aynı boyutta 20 adet GBO oh dört ve sekiz adet GBO oh iki kurutma kağıdı kesmeniz gerekecektir.

GB oh dört çok kalın ve emicidir. GBO oh two ise çok daha incedir ve daha ince bir dokuya sahiptir, bu da zarla daha eşit temas sağlar. Fitil olarak kullanılmak üzere ek bir GBO oh four parçası kesin ve daldırılan jelden yaklaşık 20 santimetre daha geniş yapın.

Azotlu UL WIC ve dört parça GBO oh iki ve bir XTBS, plastik bir kapta aşağıdaki gibi bir kağıt yığınını birleştirir, 20 parça kuru GBO oh dört. Sonra dört parça kuru GBO, oh iki. Sonra bir parça önceden ıslatılmış GBO oh iki.

Nitroselülozu bu yığının üzerine yerleştirin. Fazla akan tamponu çıkarmak için döküm tepsisindeki jeli kısa bir süre suda durulayın. Ardından, jeli tepsiden kaydırırken jeli tepsiden yığının üzerine dikkatlice kaydırmaya başlayın, zarı gerektiği gibi TBS ile ıskalayın.

Ekstra tampon, kabarcıkların jelin içine sıkışmasını önlemeye yardımcı olur. Transfer pipeti, jel tamamen yığına taşındıktan sonra bu amaç için iyi çalışır. Varsa kabarcık olup olmadığını iyice kontrol edin.

Jelin kenarını kaldırın ve kabarcıklar çözülene kadar tamponu tekrar uygulayın. Kalan üç önceden ıslatılmış GBO oh iki parçayı jelin üzerine koyun. Bir pipeti yığının üst kısmında sıkıca yuvarlayarak tüm katmanlar arasında tam temas sağlayın.

Aktarım yığınını TBS içeren iki yükseltilmiş tepsi ile çevreleyin, önceden ıslatılmış fitili, fitilin her iki ucu da suya batacak şekilde yığının üzerine örtün. TBS'de, monte edilmiş transfer yığınını 500 mil şişe su gibi ekstra ağırlık taşıyan ek bir plastik tepsi ile örtün. Fitil, tepsilerden bir tampon çekecek ve kuru kurutma kağıtları, tamponu birkaç saat boyunca jelin içinden çekecektir.

Bu, proteinleri zar üzerine bırakacak, transferin en az üç saat veya gece boyunca devam etmesine izin verecektir. Kılcal damar transferi tamamlandıktan sonra, zar standart western blotlama ile işlenebilir. Burada, belirli proteinleri amiloid oluşturmaya yatkın hale getiren bir maya suşunda aşırı eksprese edilen tipik bir protein lekesi görüyorsunuz.

Bazı adaylarımızın, burada ve burada gösterilenler gibi amiloid veya yüksek moleküler ağırlıklı SDS'ye dirençli türler oluşturduğunu açıkça görebilirsiniz. Bununla birlikte, diğerleri agrega oluşturmazlar ve bunlar ve bunlar gibi tamamen monomeriktirler. Ek olarak, amiloid polimerlerinin boyutunun, bu iki şeritte görebileceğiniz proteine bağlı olarak farklılık gösterdiğini görebilirsiniz.

Aday prionların amiloidleri gibi yüksek moleküler ağırlıklı, çözünmeyen agregaları analiz etmek için size basit bir yöntem gösterdik. Umarız sunumumuzu izlemekten keyif almışsınızdır ve bu tekniği ve Amy immünojenik proteinleri üzerine yapılan çalışmaları faydalı bulmuşsunuzdur. İzlediğiniz için teşekkürler ve araştırmanızda iyi şanslar.