Name: Thymus Kültürler Reaggregate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Öğrenin, 2-dGuo ile işlenmiş timus kültürlerinde T hücresi farklılaşmasını ve hücresel etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, CD4 ve CD8 pozitif T hücre alt kümelerinin oluşumunu gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Timus kültürler reggregate hazırlama hakkında daha fazla bilgi için lütfen ziyaret edin <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protokolleri</a> .

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

thymus kültürler reaggregate

Reaggregate Thymus Cultures

Timus, olgunlaşmamış CD4 8 + T-hücre reseptör rastgele yeniden düzenlenmiştir ifade timositleri α-ve b-zincir genleri self-peptide/major histokompatibilite kompleksi (MHC) timik tarafından ifade molekülleri tanıma yeteneklerine göre pozitif ve negatif seçim olaylar tabi stromal hücreler. Kararlı durum yetişkin timus timik mikroçevresinin hücresel karmaşıklığı zor intrathymic seçimi sırasında timik stromal hücrelerin rolü in vivo analizi yapılır ve uygun hedefleme stratejilerinin eksikliği, özellikle de timik stromal bölümlerinde gen ekspresyonu işlemek için. Biz timik mikroçevresinin in vitro olarak tanımlanan stromal ve lenfoid hücrelerin üç boyutlu timus lobları hazırlanmasına olanak timus organ kültürleri, reaggregate kullanımı yoluyla kolayca manipüle edilebilir olduğunu göstermiştir. In vitro sistemleri diğer T-hücre gelişiminin bazı yönlerini desteklemesine rağmen, timus organ kültürü, I ve II-aracılı timosit seçim olaylar, ve böylece eğitim için etkili bir araç olarak kullanılabilir sadece in vitro sistemde verimli MHC sınıf desteği mümkün kalır reaggregate timus pozitif ve negatif seçim hücresel ve moleküler düzenlenmesi.

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Lenfoid dokulardaki stromal hücreler, göçü ve ... kontrol ettiği düşünülen bir iskele sağlayan üç boyutlu yapılar şeklinde organize edilmiştir.

Merhaba, ben Andrea White. Birmingham Üniversitesi'ndeki MRC İmmün Düzenleme Merkezi'nde Graham Anderson ve Eric Jenkinson'ın laboratuvarındayım. Bugün, T-hücresi diferansiyasyonu sırasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek, yeniden agregat edilmiş timik organ kültürlerinin türetilmesine yönelik bir protokol sunuyorum. Bu prosedüre başlanmadan önce, embriyonik timik loblar izole edilmiş ve tüm lenfositleri uzaklaştırmak için işlenmiştir.Bu, ayrı bir videoda görülebilir. Daha sonra, stromal hücre hazırlığı oluşturmak için alienoid loblar ayrıştırılır. Ve son olarak, hücreler yeniden birleştirilerek bir re-aggregate fmic organ kültürü oluşturulur.Başlayalım. Kültürde beş ila yedi gün geçtikten sonra, LO, shoal hücre preparatları için disagrege edilmeye hazır olmalıdır; 0,8 µm filtreleri, RPMI 1640 artı %10 FCS içeren bir Petri kabına batırın. Pens yardımıyla, kendiliğinden ayrılıp yüzmeyen fiber kalıntılarını nazikçe iterek temizleyin. Lobları 1,5 mL'lik bir endotür tüpe aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın.Her Eppendorf tüpü başına en fazla 50 lob öneriyoruz. Lobların yer çekimi altında tüpün tabanına çökmesini bekleyin ve ardından ortamı uzaklaştırın. Lobları 1 ml PBS ile yıkayın ve ardından lobların tekrar tabana çökmesini sağlayın.Bu işlemi toplam üç kez PBS yıkaması yapana kadar tekrarlayın, son PBS yıkamasını uzaklaştırın ve 600 µL %0,25'lik tripsin çözeltisi ekleyin. Eppendorf tüpünü 37 °C'lik bir inkübatöre 25 dakika boyunca yerleştirin. Bir pipet yardımıyla 1 ml'lik mavi uç kullanarak lobları 10 saniye boyunca nazikçe trite edin ve ardından tekrar inkübatöre yerleştirin; 20 dakika sonra lobları tamamen ayrıştırmak için pipetle yukarı aşağı çekin.Tek hücre süspansiyonu elde etmek için, tripsini nötralize etmek amacıyla 400 microliters buz gibi soğuk, %10 FCS eklenmiş RPMI 1640 ekleyin; hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca bin RPM'de santrifüj ederek çökelttirin, süpernatantı uzaklaştırın ve gerekirse pelletini 1 mil. %10 FCS eklenmiş RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın. Bu işlem yaklaşık 30 saniye sürmelidir.Genellikle, E 15 fibröz dokusundan başlayarak, her dioksazin lobu başına yaklaşık 50, 000 hücre bekleriz. Şimdi, bir buçuk mililitrelik eppendorf tüpünde agregat fmic Corgan kültürleri oluşturmaya hazırız. Taze hazırlanmış stromal hücreleri karıştırın.Önceden seçilmiş CD4 pozitif CD8 pozitif fibrositler ile birlikte. Stromal hücrelerin fibrositlerle yaklaşık olarak birer bir oranında olmasını öneririz. Kullanacağınız hücre sayısı, mevcut hücre sayısına ve gerçekleştirilecek deneylere bağlı olarak değişecektir.Toplamda en az yüz bin ve 1,5 milyon hücreden fazla olmamasını öneririz. V agregatlarının tekrarlanabilir olacak kadar büyük, ancak merkezinin ölmeyeceği kadar küçük olmasını istersiniz. Hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca bin RPM'de santrifüj ederek çöktürün. Organ kültürü filtresini dikkatlice monte edin.Süpernatantın tamamını P 200 pipet kullanarak uzaklaştırın. Hücre pelletini, bir süspansiyon oluşturmak için 10 saniye boyunca vorteksleyin. Hacim yaklaşık olarak bir ila iki mikrolitre olmalıdır.Süspansiyonu, hücre süspansiyonunu pipet ucunda tutarak ince uçlu bir pipete çekin. Diseksiyon mikroskobu altında, hücre süspansiyonunu dikkatlice 0,8 µm'lik bir filtrenin merkezine pipetleyin. İdeal olarak hücreler, bir ila iki milimetre çapındaki bir daire içerisinde dik bir damla şeklinde yerleştirilmelidir.Eğer bulamaç yayılmaya başlarsa, kalan hücreleri yerleştirmeden önce bulamaçtaki sıvının pos üzerinden süzülmesine izin verin. Kabı plastik bir saklama kabına yerleştirin ve kapatın. Timus organ kültürlerinde olduğu gibi, kabı bir inkübatöre yerleştirin; agrege kültürler kültürün 18 saati içinde sağlam yapılar oluşturur.Dört ila beş günlük kültürden sonra, hem CD4 pozitif CD8 negatif hem de CD4 negatif CD8 pozitif olgun sit subsetleri oluşturacaklardır. 50 dioxazine ilele işlenmiş loblarla başlamak, üç ila beş reaggregate kültürü hazırlamak için yeterli stromal hücreyi sağlamalıdır. Bu kültürler tipik olarak, bozulmadan forseps yardımıyla filtrelerden itilebilen koherent hücre kümeleri şeklinde görünür.F epitelyal hücreleri tarafından gerçekleştirilen pozitif seçilimin incelenme yöntemini açıklamış bulunmaktayız. Bu yöntem, dendritik hücre aracılı negatif seçilimin incelenmesi için de kullanılabilir. Son olarak, TCR transgenik FİBROSİTLER veya MHC Sınıf I eksik veya MHC Sınıf II eksik stromal hücreler kullanılarak çalışılabilir.Bu sistem, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücresi seçiliminin ayrı ayrı incelenmesine olanak tanır. İzlediğiniz için teşekkürler.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, diseksiyon ve fetal timus çıkarılması de 2-dGuo ile tedavi edilen timus ex vivo kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Bu video, üç boyutlu bir timik kültür sistemi kullanarak iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinden fonksiyonel antijene özgü T hücreleri oluşturmak için bir protokolü gösterir. iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinin endojen lenfosit tükenmiş fareler fetal timik loblarla birlikte kültürlenmesi, T hücrelerinin CD8αβ + MHC sınıf I + iPSC'den türetilmiş timik göçmenler (iTE'ler) oluşturmak üzere başarılı bir şekilde olgunlaşmasıyla sonuçlandı.

iPSC'den türetilmiş timik göçmenler oluşturmak için üç boyutlu timik kültür sistemi

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Bu video, FACS izolasyonu için timik epitel hücrelerini (TEC'ler) yoğunluk gradyanı ile zenginleştirmek için bir protokol göstermektedir. Ayrıca, TEC agrega oluşumunu teşvik etmek için EAK16-II/EAKIIH6 peptitlerinin kullanımını da gösterir. EAK16-II/EAKIIH6 hidrojelin mikro ortamları, TEC'lerin hayatta kalmasını ve işlevini sürdürmek için gerekli 3 boyutlu konfigürasyonu sağlar.

EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Burada, timik epitel hücresi (TEC) olgunlaşmasını ve uzun süreli bakımı ve ayrıca in vitro timopoezi desteklemeyi amaçlayan 3D fibrin hidrojellerde büyütülen insan iPSC'den türetilmiş timus organoidlerinin oluşumu için bir protokol açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Öğrenin, 2-dGuo ile işlenmiş timus kültürlerinde T hücresi farklılaşmasını ve hücresel etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, CD4 ve CD8 pozitif T hücre alt kümelerinin oluşumunu gösterir.

Thymus Kültürler Reaggregate

Daha fazla video keşfet