Thymus Kültürler Reaggregate
August 28th, 2008
Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.
Merhaba, ben Andrea White ve Graham Anderson ve Eric Jenkinson'ın Birmingham Üniversitesi'ndeki MRC Bağışıklık Düzenleme Merkezi'ndeki laboratuvarındanım. Bugün, T hücresi farklılaşması sırasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek yeniden agrega timik organ kültürlerinin türetilmesi için bir protokol sunuyorum. Bu prosedüre başlamadan önce, embriyonik timik loblar izole edildi ve tüm lenfositleri çıkarmak için tedavi edildi.
Bu ayrı bir videoda görülebilir. Yabancı loblar daha sonra bir stromal hücre preparatı üretmek için ayrıştırılır. Ve son olarak, hücreler yeniden agregalı bir fmik organ kültürü oluşturmak üzere toplanır.
Hadi başlayalım. Kültürde beş ila yedi gün sonra, LO, sığ hücre preparatları için ayrıştırılmaya hazır olmalıdır, 0.8 mikrometre filtreleri RPMI 1640 artı% 10 FCS içeren bir Petri kabına daldırın, Forseps kullanarak, yüzmeyi bırakmayan lif eğimlerini nazikçe itin. Lobları 1.5 mil genişliğindeki bir orph tüpüne aktarmak için evcil hayvan başına bir mil kullanın.
Eend orph tüpü başına en fazla 50 lob öneriyoruz. Lobların birim yerçekimi altında tüpün dibine çökmesine izin verin ve ortamı çıkarın. Lobları bir mil PBS ile yıkayın ve ardından lobların tekrar dibe çökmesine izin verin.
Bunu toplam üç PBS yıkaması için tekrarlayın, son PBS yıkamasını çıkarın ve çözeltiye 600 mikrolitre% 0.25'lik bir trip ekleyin. Einor tüpünü 25 dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir perpet üzerinde bir mil mavi uç kullanarak lobları 10 saniye boyunca nazikçe tritrate edin ve 20 dakika sonra inkübatöre geri koyun, lobları tamamen ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
Yaklaşık 30 saniye sürmelidir Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için, 400 mikrolitre buz gibi, RPMI 1640 artı% 10 FCS ekleyin, tripsin imp peletini bin RPM'de, dört derece C'de 10 dakika santrifüjleme ile nötralize edin, takviyeyi çıkarın ve peleti bir milde yeniden süspanse edin. İstenirse RPMI 1640 artı %10 FCS. Hücreleri sayın.
Tipik olarak, bir E 15 fibrözden başlayarak, dioksazin lobu başına yaklaşık 50.000 hücre bekleriz. Şimdi agrega fmic Corgan kültürlerini bir buçuk mil genişliğindeki bir orph tüpünde oluşturmaya hazırız. Karışık, taze hazırlanmış ince stromal hücreler.
Önceden seçilmiş CD ile birlikte dört pozitif CD, sekiz pozitif fibrosit. Stromal hücrelerin fibrositlere yaklaşık bire bir oranını öneriyoruz. Kullanacağınız hücre sayısı, mevcut hücre sayısına ve yapılacak deneylere bağlı olacaktır.
Toplamda en az yüz bin hücre ve en fazla 1,5 milyon hücre öneriyoruz. V agregalarının tekrarlanabilir olacak kadar büyük olmasını, ancak merkezin pelet hücrelerini 10 dakika boyunca bin RPM'de santrifüjleme yoluyla öldürecek kadar büyük olmamasını istiyorsunuz. Dört derece C'de organ kültürü filtresini dikkatlice monte edin.
Evcil hayvan başına bir P 200 ile sahnedeki tüm SUP natin'i çıkarın. Girdap hücresi peleti bir bulamaç oluşturmak için 10 saniye boyunca peletlenir. Hacim bir ila iki mikrolitre ağız civarında olmalıdır.
Bulamacı ince çekilmiş bir evcil hayvanın içine yerleştirin ve hücrelerin süspansiyonunu evcil hayvanın ucunda tutun. Diseksiyon mikroskobumuz altında, hücre bulamacını 0.8 mikrometrelik bir filtrenin merkezine dikkatlice ağızdan alın. İdeal olarak, hücreler bir ila iki milimetre çapında bir daireye ayakta duran bir damla olarak yerleştirilmelidir.
Bulamaç yayılmaya başlarsa, kalan hücreleri biriktirmeden önce bulamaçtaki sıvının postan akmasına izin verin. Çanağı plastik bir sandviç kutusuna koyun ve kapatın. Timus organ kültürlerine gelince ve bir inkübatöre bir kutu yerleştiriyoruz, kültürleri kültürden 18 saat sonra sağlam yapılara dönüştürüyoruz.
Dört ila beş günlük kültürden sonra, hem CD dört pozitif sekiz negatif hem de CD dört negatif sekiz pozitif olgun sit alt kümeleri oluşturacaklar. 50 ile başlayarak, dioksazin ile muamele edilmiş loblar, üç ila beş reagrega kültürü hazırlamak için yeterli stromal hücre vermelidir. Bu kültürler tipik olarak, forseps kullanılarak filtrelerden bozulmadan itilebilen tutarlı hücre höyükleri olarak görünür.
F epitel hücreleri tarafından pozitif seçilimin çalışılacağı yöntemi az önce tanımladık. Bu yöntem aynı zamanda dendritik hücre aracılı negatif seçimi incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, TCR transgenik FIBROSITLER veya MHC Sınıf bir eksik veya MHC Sınıf iki eksik stromal hücreler kullanılarak.
Bu sistem, CD dört pozitif veya CD sekiz pozitif T hücresi seçimi ile ilgili ayrı araştırmalara izin verir. Bizi izlediğiniz için teşekkürler.
Genel Bakış
Bu video, 2-dGuo ile işlem görmüş reagrege timus kültürlerinin hazırlanmasını göstermektedir. Bu kültürler, T hücre farklılaşması ve hücresel etkileşimler çalışması için gereklidir.
Önemli Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Timik Organ Kültürleri
Arka Plan
- Timik organ kültürleri, T hücre gelişimini incelemek için kullanılır.
- Reagrege kültürler, hücresel etkileşimlerin incelenmesine izin verir.
- 2-dGuo işlemi, timik lobların hazırlanmasında kullanılır.
- T hücre farklılaşmasının anlaşılması, immünolojik araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Reagrege timik organ kültürlerini türetmek.
- T hücre farklılaşma süreçlerini araştırmak.
- Kontrollü bir ortamda hücresel etkileşimleri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyonik timik lobların izolasyonu ve işlenmesi.
- Stroma hücre hazırlıklarını üretmek için disagregasyon.
- Reagrege kültürler oluşturmak için hücrelerin agregasyonu.
- Kültür gelişiminin inkübasyonu ve gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Reagrege kültürler, 18 saat içinde bütün yapılar oluşturur.
- CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücre alt grupları üretilir.
- Yöntem, pozitif ve negatif seçimi çalışmaya olanak tanır.
- Daha ileri araştırmalar için TCR transgenik fibrositlerin kullanımı.
Sonuçlar
- Protokol, T hücre farklılaşmasını etkili bir şekilde göstermektedir.
- Reagrege kültürler, immünolojik çalışmalar için değerli bir araç sağlamaktadır.
- Daha fazla araştırma, bu yöntemi çeşitli T hücre seçimi çalışmaları için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
