Thymus Kültürler Reaggregate

Merhaba, ben Andrea White; Birmingham Üniversitesi MRC İmmün Düzenleme Merkezi'ndeki Graham Anderson ve Eric Jenkinson'ın laboratuvarındayım. Bugün, T hücresi farklılaşması sırasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek yeniden agregat edilmiş timik organ kültürlerinin türetilmesine yönelik bir protokol sunuyorum. Bu prosedüre başlanmadan önce, embriyonik timik loblar izole edilmiş ve tüm lenfositleri uzaklaştırmak için işlem görmüştür.

Bu işlem ayrı bir videoda görülebilir. Ardından, stromal hücre hazırlığı oluşturmak için alienoid loblar disgrege edilir. Ve son olarak, hücreler tekrar birleştirilerek yeniden agregasyonlu bir fmic organ kültürü oluşturulur.

Hadi başlayalım. Kültürde beş ila yedi gün geçirdikten sonra, LO, shoal hücre hazırlıkları için ayrıştırmaya hazır olmalıdır; 0,8 mikrometrelik filtreleri %10 FCS içeren RPMI 1640 bulunan bir Petri kabına daldırın. Pens kullanarak, kendiliğinden ayrılmayan fiber kalıntılarını nazikçe iterek temizleyin. Lobları 1,5 ml'lik bir eppendorf tüpüne aktarmak için bir milipipet kullanın.

Her bir endotracheal tüp başına 50 lobdan fazla konulmaması önerilir. Lobların yerçekimi etkisiyle tüpün dibine çökmesini bekleyin ve ortamı uzaklaştırın. Lobları 1 ml PBS ile yıkayın ve ardından lobların tekrar dibe çökmesine izin verin.

Bu işlemi toplam üç kez PBS yıkaması yapacak şekilde tekrarlayın, son PBS yıkamasını uzaklaştırın ve 600 µL %0,25'lik tripsin çözeltisi ekleyin. Eppendorf tüpünü 37 °C'deki bir inkübatöre 25 dakika boyunca yerleştirin. Bir pipet üzerindeki 1 mL'lik mavi uçla lobları 10 saniye boyunca nazikçe triture edin ve ardından tekrar inkübatöre yerleştirin; loblar tamamen disagrege olana kadar pipetle aşağı yukarı çekerek karıştırın.

Tek hücre süspansiyonu elde etmek için yaklaşık 30 saniye sürecek şekilde, tripsini nötralize etmek amacıyla 400 µL buz gibi soğuk, %10 FCS içeren RPMI 1640 ekleyin; hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüj ederek çöktürün, süpernatantı uzaklaştırın ve gerekirse pellet'i 1 mL %10 FCS içeren RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın.

Genellikle, E 15 fibröz yapısından başlayarak dioksazin lobu başına yaklaşık 50,000 hücre bekleriz. Şimdi, bir buçuk mililitrelik endotür tüpte agregat fmic Corgan kültürleri oluşturmaya hazırız. Taze hazırlanmış stromal hücreleri karıştırın.

Önceden seçilmiş CD4 pozitif CD8 pozitif fibrositlerle birlikte. Stromal hücrelerin fibrositlere yaklaşık birbire bir oranında olmasını öneririz. Kullanacağınız hücre sayısı, mevcut hücre sayısına ve gerçekleştirilecek deneylere bağlı olarak değişecektir.

Toplamda en az yüz bin ve en fazla 1,5 milyon hücre kullanmanızı öneririz. V agregatlarının tekrarlanabilirlik sağlayacak kadar büyük olması, ancak merkezdeki hücrelerin ölmesine neden olacak kadar büyük olmaması gerekir; santrifüjle 1000 RPM'de 10 dakika boyunca hücreleri çöktürün. 4 °C'de, organ kültürü filtresini dikkatlice monte edin.

Bir P 200 pipet kullanarak aşamadaki tüm süpernatantı uzaklaştırın. Bir süspansiyon oluşturmak için hücre peletini 10 saniye boyunca vorteksleyin. Hacim yaklaşık bir ila iki mikrolitre olmalıdır.

Hücre süspansiyonunu pipetin ucunda tutarak, süspansiyonu ince uçlu bir pipete çekin. Dissection mikroskobu altında, hücre süspansiyonunu dikkatlice 0,8 µm'lik bir filtrenin merkezine pipetle aktarın. İdeal olarak hücreler, bir ila iki mm çapında bir daire şeklinde, dik duran bir damla olarak yerleştirilmelidir.

Süspansiyon yayılmaya başlarsa, kalan hücreleri yerleştirmeden önce süspansiyondaki sıvının pos aracılığıyla süzülmesini bekleyin. Kabı plastik bir sandviç kutusuna yerleştirin ve kapatın. Timus organ kültürlerinde olduğu gibi, kutuyu bir inkübatöre yerleştirin; agregasyon kültürleri, kültürün 18 saat içinde sağlam yapılar oluşturur.

Dört ila beş günlük kültürden sonra, hem CD4 pozitif CD8 negatif hem de CD4 negatif CD8 pozitif olgun sit subsetleri oluşacaktır. 50 dioxazine ile işlem görmüş loblarla başlanması, üç ila beş reaggregate kültürü hazırlamak için yeterli stromal hücre sağlamalıdır. Bu kültürler genellikle, forseps kullanılarak bozulmadan filtrelerden itilebilen tutarlı hücre yığınları şeklinde görünür.

F epitelyal hücreleri tarafından gerçekleştirilen pozitif seçilimin incelendiği yöntemi açıklamış olduk. Bu yöntem, dendritik hücre aracılı negatif seçilimin incelenmesi için de kullanılabilir. Son olarak, TCR transgenik FİBROSİTLER veya MHC Sınıf bir eksik veya MHC Sınıf iki eksik stromal hücreler kullanılarak da uygulama yapılabilir.

Bu sistem, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücresi seleksiyonunun ayrı ayrı araştırılmasına olanak tanır. İzlediğiniz için teşekkürler.