Name: 2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarından timus diseksiyonu ve 2-dGuo ile lenfoid hücre deplesyonu yöntemini. Bu teknik, T hücre gelişimi ve immünolojik araştırmalar için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ziyaret ediniz <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protokolleri</a> , ex vivo timus organ kültürlerinin hazırlanması ile ilgili daha fazla bilgi için .

Yazarların beyan edilecek bir çıkar çatışması yoktur.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2-dguo boyalı thymus organ kültürleri hazırlanması

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Timus, olgunlaşmamış CD4 8 + T-hücre reseptör rastgele yeniden düzenlenmiştir ifade timositleri α-ve b-zincir genleri self-peptide/major histokompatibilite kompleksi (MHC) timik tarafından ifade molekülleri tanıma yeteneklerine göre pozitif ve negatif seçim olaylar tabi stromal hücreler. Kararlı durum yetişkin timus timik mikroçevresinin hücresel karmaşıklığı zor intrathymic seçimi sırasında timik stromal hücrelerin rolü in vivo analizi yapılır ve uygun hedefleme stratejilerinin eksikliği, özellikle de timik stromal bölümlerinde gen ekspresyonu işlemek için. Biz timik mikroçevresinin in vitro olarak tanımlanan stromal ve lenfoid hücrelerin üç boyutlu timus lobları hazırlanmasına olanak timus organ kültürleri, reaggregate kullanımı yoluyla kolayca manipüle edilebilir olduğunu göstermiştir. In vitro sistemleri diğer T-hücre gelişiminin bazı yönlerini desteklemesine rağmen, timus organ kültürü, I ve II-aracılı timosit seçim olaylar, ve böylece eğitim için etkili bir araç olarak kullanılabilir sadece in vitro sistemde verimli MHC sınıf desteği mümkün kalır reaggregate timus pozitif ve negatif seçim hücresel ve moleküler düzenlenmesi.

Bu video, diseksiyon ve fetal timus çıkarılması de 2-dGuo ile tedavi edilen timus ex vivo kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Timus içerisinde, gelişmekte olan T-hücresi öncülleri ile kortikal ve medüller epitelyal hücreleri içeren stromal hücreler arasındaki etkileşimlerin ... oynadığı bilinmektedir.

Merhaba, ben Birmingham Üniversitesi'ndeki MRC İmmün Düzenleme Merkezi'nde Graham Anderson ve Eric Jenkinson'ın grubundan Will Jenkinson. Bugün size fetal timik organ kültürlerinin kurulumu için bir teknik göstereceğim. Ayrıca, bu organ kültürlerinin iki doksazin ile nasıl işleneceğini de göstereceğim.Ve bu madde, organ kültüründeki lenfoid hücreler için seçici olarak toksik olan bir maddedir. Bu tekniğin laboratuvarda birkaç uygulaması vardır. Bu uygulamalardan biri, yeniden agregasyonlu organ kültürlerinin üretimidir.Diğer uygulamalar arasında sit gelişiminin farklı aşamalarının incelenmesi yer almaktadır ve fetal timik organ kültürleri kullanarak, farklı yolakları inhibe eden veya stimüle eden reaktifler ekleyebiliyoruz; bu da bu süreçte spesifik moleküllerin rolünü inceleyebileceğimiz anlamına gelmektedir. Öyleyse başlayalım. Timus organ kültürlerini hazırlamanın ilk adımı, bir ila iki gebe anneden 14. veya 15. gün fare embriyolarını toplamaktır.Öncelikle, ötanazi uygulanmış fareyi %70 ethanol ile püskürtme yoluyla temizleyin. Ardından, pens yardımıyla tüyleri çekerek, mesaneden başlayıp uterusun iki lateral kornusuna doğru devam eden makasla karın bölgesinde V şeklinde bir insizyon yapın. Uterin kornusu çıkarın ve steril 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Uterus duvarı boyunca boyuna bir kesi yapın ve henüz amniyotik keseleri içinde bulunan embriyoları çıkarın. İki çift ince pens kullanarak embriyoları 10 ml PBS içeren bir Petri kabında yıkayın. Amniyotik keseyi dikkatlice yırtarak embriyoyu keseden ve plasentadan ayırın.Ardından, embriyoları PBS ve %10 FCS içeren RPMI 1640 karışımının 50:50 oranında 10 ml bulunduğu temiz bir petri kabına aktarın. Embriyo medyumun içine daldırılmış haldeyken, bir diseksiyon mikroskobu altında pens kullanarak embriyonun baş kısmını kesin. Kapalı bir pensin uçlarını göğüs boşluğuna yerleştirip pensi açarak göğüs duvarının ön yüzeyini açın ve iç göğüs boşluğunu ortaya çıkarın.Kalbin hemen altından nazikçe kavrayarak tüm torasik ağacı, kalbi, akciğerleri, trakeyi ve timusu çıkarın ve 14 ila 15 günlük bir embriyodan alınan bu dokuları, içinde 5 mL RPMI 1640 artı %10 FCS bulunan 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Rudimenter timus lobları, burada gövdenin her iki yanında, kalbin hemen üzerinde yer alır.Organ kültürüne geçmeden önce, ince pensler kullanarak tekil timus loblarını çıkarın ve fazla bağ dokusunu ve yapışmış kanı temizleyin. Artık organ kültürü için hazırız. Lenfoid detoks hazırlamak için, 9 mM stok 2-dioxazine çözeltisinden alarak 90 mm'lik bakteriyel plastik Petri kabına 600 µL hazırlayın.Dört ml önceden ısıtılmış DMEM medyumu ekleyin ve tüm yüzeyin medyumu kaplaması için kabı dairesel hareketlerle sallayın. Eğer T hücresi gelişimini incelemek için lenfoid kültürler istiyorsanız, iki dioksazini pens yardımıyla dışarıda bırakın. Bir santimetrekare boyutunda önceden kesilmiş iki steril sanat sargısı süngerini kabın içine yerleştirin.Besiyerinin süngere yaklaşık 30 saniye boyunca nüfuz etmesini bekleyin. Ardından, her iki tarafı da ıslatmak için süngeri ters çevirin. Tekrar forseps kullanarak, kapta bulunan besiyerinin dokuya ulaştığından emin olun.Her bir süngerin yüzeyine önceden sterilize edilmiş 0,8 mikronluk bir filtre yerleştirin. Timus loblarını organ kültürü filtresine aktarmak için filtreler, parlak yüzeyleri yukarı bakacak şekilde sünger desteklerinin üzerine yerleştirilir; cam pipetler hazırlamak için standart kontrol cam pipeti kullanmayı tercih ediyoruz. Cam tüpü bir Bunsen beki alevinin üzerinde ısıtın ve cam şekillendirilebilir hale geldiğinde, camı alevden çekip her iki ucundan çekerek camı en fazla 10 santimetre olacak şekilde uzatın ve camın soğumasını bekleyin.Ardından, camı kırmak için her iki uçtan çekin. Bu işlem, iki adet konik cam boru uç üretir. Her birinin ince alanı yaklaşık beş santimetre uzunluğunda ve ucu yaklaşık 0,5 mm çapındadır.Pipet düzeneğini kurmak için, diğer uca ağızlık olarak plastik bir pipet ucu yerleştirin ve cam pipetin küt ucunu hortumun içine yerleştirin. Bireysel timus loblarını ağız pipetiyle dikkatlice alın ve 0,8 mikronluk filtre yüzeyine yerleştirin. Organ kültürü için, her filtreye beş ila altı timus lobu, her kapta ise toplam 10 ila 12 timus lobu koymanızı öneririz.Bu, organ kültürlerinin büyümesi için geniş bir alan sağlar ve iki dioksazinin tüm endojen lenfoid hücreleri ortadan kaldırmasına olanak tanır. Kültürler kurulduktan sonra, platform olarak 10 santimetrelik bir Petri kabı kapağı kullanılarak ve platform seviyesinin hemen altına çift distile su eklenerek bir sandviç kutu kapağı düzenleyin. Kutunun içine en fazla üç kap yerleştirin ve kapağı bantla kutuya sabitleyin.Kapağın karşılıklı köşelerine iki adet beş milimetrelik hava deliği açılmış olmalıdır. Kutuları 37 °C sıcaklıkta ve %10CO2 içeren bir inkübatöre beş ila yedi gün süreyle yerleştirin; bu sürenin sonunda, kontrollü üç boyutlu bir ortamda stromal timik bölge etkileşimlerini incelemek için bu kültürleri önce disagrege edin ve ardından yeniden agrege edin. Genellikle beş ila yedi gün süren bir kültür döneminin ardından, filtrelerin besiyerine daldırılması ve lobların pens yardımıyla nazikçe itilmesiyle F talklar hasat edilir; lenfoid f tosların, doksazin uygulanmamış lenfoid loblara kıyasla tipik olarak daha küçük ve kistik olduğunu görebilirsiniz.Böylece size fetal timik organ kültürlerinin kurulum tekniğini göstermiş oldum. Bu protokolde, fetal timik organ kültürlerinin iki dioksazin ile nasıl işleme tabi tutulacağını gösterdik; bu işlem, timusun beş ila yedi günlük kültürleme süresinin ardından tipik olarak tüm lenfoid hücreleri tüketir. Bu organ kültürlerini, yeniden agregasyonlu organ kültürleri üretmek için kullanıyoruz.Ancak, bu tek yöntem değildir. Ayrıca, timik farelerin böbrek kapsülü altına transfer etmek için dioksazin ile işlem görmemiş fetal timik organ kültürleri de kullanıyoruz. Buna ek olarak, in vivo ortamda meydana gelebilecek ikincil etkilerden arındırılmış, kontrollü in vitro koşullarda T hücresi gelişimini incelemek için lenfoid fetal timik organ kültürleri kullanıyoruz.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Bu video, üç boyutlu bir timik kültür sistemi kullanarak iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinden fonksiyonel antijene özgü T hücreleri oluşturmak için bir protokolü gösterir. iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinin endojen lenfosit tükenmiş fareler fetal timik loblarla birlikte kültürlenmesi, T hücrelerinin CD8αβ + MHC sınıf I + iPSC'den türetilmiş timik göçmenler (iTE'ler) oluşturmak üzere başarılı bir şekilde olgunlaşmasıyla sonuçlandı.

iPSC'den türetilmiş timik göçmenler oluşturmak için üç boyutlu timik kültür sistemi

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Biz transplantasyon için basit ve verimli bir yöntem sağlamak 2 '-deoxyguanosine bir çıplak fare renal kapsül içine e 18.5 timus tedavi. Bu yöntem, hem timik epitelyal hücreler fonksiyon ve T hücrelerinin olgunlaşma çalışmada Yardımcısı olmalıdır.

Çıplak farelerde 2 '-Deoxyguanosine tedavi Murine embriyonik Thymus renal subkapsüler nakli

Burada, timik epitel hücresi (TEC) olgunlaşmasını ve uzun süreli bakımı ve ayrıca in vitro timopoezi desteklemeyi amaçlayan 3D fibrin hidrojellerde büyütülen insan iPSC'den türetilmiş timus organoidlerinin oluşumu için bir protokol açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Öğrenin, fare embriyolarından timus diseksiyonu ve 2-dGuo ile lenfoid hücre deplesyonu yöntemini. Bu teknik, T hücre gelişimi ve immünolojik araştırmalar için değerli bir model sunar.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Daha fazla video keşfet