Name: Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Öğrenin, dorsal root ganglia duyu nöronlarını kompartmanlı kültürlerde hazırlama ve bakım yöntemini. E15 sıçan embriyosu hücreleriyle akson uzamasını ve nöronal etkileşimleri inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz, Katharina Cosker ve Stephanie Courchesne yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum.

Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> Kollajen kaplama: kollajen kat p35 doku kültürü plakaları ve bir fırında 37 ° ° C bölücüler yağlama 2 gün önce. Kollajen nihai konsantrasyonu 0,71 mg / ml 0,001 N HCl seyreltilmiş olmalıdır. Daha sonra, plaka başına 1 ml karışımı ekleyin. </li><li> Gres yükleyiciler: gres yükleyici doldurmak için, 60 ml şırınga Corning vakum gres yağı ile dolu olmalıdır. Gres yükleyici doldurmak için 45 dakika otoklavda sonra folyo ile sarın ve şırınga kullanın. </li><li> Teflon bölücüler: bölücüler her bir deney sonrası yeniden kullanılır ama olabilir ilk önce düzgün bir şekilde temizlenmesi gerekir. Plaka bölücü çıkarın, 2 gün boyunca tüm sülfürik asit kalan yağ ve yer silin. Asit çıkardıktan sonra, 20 dakika boyunca, su 3X, kaynatın ile durulayın, kuruması için 20 dakika boyunca bir bardak P100 petri ve otoklav yer sağlamak. </li><li> N2-metilselüloz: metilselüloz, 1.5g tartılır ve bir 500ml şişe yerleştirin. Bir heyecan çubuğuna ekleyin ve kuru zeminde 20 dakika otoklav (bu noktadan itibaren tüm iş steril olmalıdır). Daha sonra, serum serbest medya (N 2) 500 mL ekleyin ve soğuk bir odaya eriyene kadar karıştırın. -20 ° C'de 50 ml conicals ve donma içine kısım -20 ° C'de çalışan hisse senedi, 1 ml tüpler içine 50 ml conicals bir kısım ve dondurma için </li><li> DRG medya: DMEM,% 5 Isı inaktive at serumu ve% 1 penisilin streptomisin. </li><li> 100ng/mL DRGN medya: hem sinir büyüme faktörü (NGF) ve beyin-türevli nörotrofik faktör (BDNF) stok konsantrasyonu 1mg/ml. DRG ortama nörotrofinler 1:10,000 her sulandırınız. Kültürler NGF tek başına büyümüş olabilir, bu kültürlerin hayatta nöronların tamamlayıcı değiştirir. Not: Gerektiğinde, (sitozin arabinozid) AraC konsantrasyon 1uM ve 0.3uM son bir konsantrasyonda kullanılır. Bu Schwann hücrelerinin ve diğer glia büyümesini engelleyecektir. </li><li> 10 ng DRGN medya: 100ng/mL DRGN DRG medya ile medya (1:10) sulandırınız. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Şekil 1" width="392" height="294"> Şekil 1 set-up için gerekli Araçlar </li></ol> (Diseksiyon 1-2 gün önce bu süreci başlatmak) kompartman odaları ayarlama <ol><li> Dışa doğru bir hareket ile kollajen kaplı p35 çanak ortasında bir çizik olun. </li><li> Sıfırdan ortasında N2-metilselüloz Yeri 30ul. Bölücü yağlanmış kadar kenara yemekleri ayarlayın. </li><li> Yağ yükleyici 23-gauge luer saplama adaptörü takın. Grip Teflon bir çift ile 90 ° açı hemostat bölücü ve bölücü ile mikroskop altında yukarı bakacak şekilde düz yatıyordu. Gres yağ sürekli bir satırı (bkz. diyagram) olacak şekilde her zaman adaptörü adaptörü, önceki adımda yağ eklenir yeni bir başlangıç ​​noktasında yer olduğunu emin olun bölücü iz. N2-metilselüloz orta bölmesi üzerinden bu nedenle, yağ, tüm bölücü uygulandıktan sonra baş aşağı, hazırlanan p35 yemekleri açmak ve yerleştirmek. Bir cımbız ile çanak alt bastırın. Dört köşe ("X" şemada gösterilen sol üst, sağ alt, sağ üst, sol alt,) bölücü iç basın emin olun. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Şekil 2" width="171" height="183"> Şekil 2: bölücü yağlama Adımlar Not: Bu yağ çanak ile tam bir sızdırmazlık yapar, böylece sıkıca yeterli basın için önemlidir, ama eğer çok fazla baskı eklenir, aksonlar yan bölmeye çapraz olmaz. Hemostat Pick up ters çevirin ve bölücü çözülme. Son olarak, orta bölmesinin altındaki odaklanarak mikroskop altında sıkıca bağlı bölücü ile çanak yerleştirin. Gres yükleyici ile, hücreleri orta bölmesi yerleştirilir sonra onlar dışarı sızıntı olamayacağını, bu nedenle küçük bir bariyer (0,25 cm). </li><li> Pek çok kültürde, yan bölmelerin her yerde DRG medya ve hücrelerin muhafaza edileceği bir kuluçka yer ayarladıktan sonra. Kültürleri, birkaç saat için oturup sonra sızıntı kontrol etmek için izin verin. Medya orta bölmesinin içine sızan varsa, o zaman kültür kullanılamaz. Not: bu tekniği ilk öğrenirken, birçok sızdıran olacak gibi, bir deney için gerekli olan daha fazla kültürler kurmak için önemlidir. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Şekil 3" width="254" height="191"> Şekil 3: "İyi vs sızdıran" kültür </li></ol> Kompartman kültürler bakımı DRG nöronlar <ol><li> 1. Gün: 100ng/mL DRGN medya + AraC ile yan bölümlerinde medya DRG değiştirin. Diseksiyon ve orta bölmesi (100,000 hücreleri) hücreleri ekleyin. </li><li> 2. Gün: medya merkezi bölmesi ile yağ bariyerini ve değişim sıvı üzerinde akana kadar teflon bölücü dışında 10 ng medya + AraC ekleyin. </li><li> 3. Gün: 10 ng DRGN AraC atlayarak AraC ve surround atlayarak 100ng/mL DRGN yan bölümlerinde medya değiştirin. </li><li> 6. Gün: 1ng/mL + AraC ve DRG medya + AraC surround yan bölümlerinde medya değiştirin. </li><li> 9. Gün: deney için kullanın. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Şekil 4" width="267" height="148"> Şekil 4: hücre gövdeleri ve distal aksonlar IHC görüntüleri Not: ortam değiştirirken, her iki tarafında bölmesinin üst sıvı aspire önemlidir. Ayrıca, sadece surround, orta bölmesi kendisi ortamı değiştirmek ve merkezi haline yağ bariyerini üzerinden akmasına izin asla. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

Bu video, kompartman odaları kültür DRG nöronlar kullanmak için nasıl hazırlamak ve sürdürmek göstermiştir. Düzgün yapılmazsa, bu sistem hangi nörotrofinler uzun aksonlar boyunca sinyal mekanizmaları araştırmak için akson hücre gövdesinden ayrılması sağlar. Bölmeleri arasında akışkan izolasyon olmadığı için, diğer bölmeleri etkilenen olmadan bir kompartmanı seçici uyarılma veya tedavi için izin verir. Kompartman odasına kültürlerin üstün servikal ganglionlar, retina ganglion nöronlar, ve kortikal nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak ...

<table><tbody><tr><td>kolajen</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>N2-metilselüloz 400CPS</td><td>Reaktif</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon bölücü</td><td>Diğer</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>pek çok farklı bölücü tipi mevcuttur</td></tr><tr><td>Pin tırmığı</td><td>Araç</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>Gres yükleyici</td><td>Araç</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reaktif</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reaktif</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek vakum gresi</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge luer stub adaptör</td><td>Araç</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;#x00B0; açılı hemostatlar</td><td>Araç</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

kompartman kültürleri dorsal kök ganglia nöronlar hazırlanması ve bakım

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Nöronlar hedef kaynaklı büyüme faktörleri nöronal hayatta kalma ve işlevi için gerekli olan hedef dokular, çok innerve hücre gövdesi çıkarılır aksonal süreçleri uzatmak. Nörotrofinler özellikle duyusal nöronlar innerve hayatta ve farklılaşma korumak için gereklidir, ancak bu hedef elde edilen nörotrofinler innerve nöron hücre gövdesi nasıl iletişim soru, 30 yılı aşkın bir süredir aktif bir araştırma alanı olmuştur. Nörotrofin sinyalleri hücre gövdesinden nasıl ulaşacağını en yaygın kabul gören model, sinyalizasyon, akson boyunca retrograd bu sinyali taşımak endosomes önermektedir. Retrograd taşıma incelemek üzere, bir kültür sistemi, aslında hücre gövdeleri aksonlar izole edildiği Robert Campenot tarafından icat edildi. Kültür duyusal nöronlar özetlediği hedef kaynaklı nörotrofinler in vivo aşağıdaki sürümde oluşan nöron terminalleri seçici uyarılma için bu kompartman odaları hazırlama tekniği. Uzun menzilli mikrotübül bağımlı retrograd taşıma gerektiren Retrograd sinyalleme olaylarını nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için önemli etkileri vardır.

Burada dorsal kök gangliyon kültür duyusal nöronlar için kompartman odaları hazırlanması ve bakımı tekniği açıklar.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Nöronlar, hedef dokuları innerve etmek amacıyla hücre gövdesinden oldukça uzaklaşan aksonal uzantılar geliştirirler; bu dokulardaki hedeften türeyen büyüme faktörleri ... için gereklidir.

Bu prosedür, kolajen kaplı bir plağın merkezine pin tırmığı ile bir çizik oluşturulması ve çiziklerin merkezine 30 µL Methylcellulose pipetlenmesi ile başlar. Her bir ayırıcıyı bir gres yükleyici kullanarak yağlayın ve kolajen kaplı plağa sabitleyin. E 15 sıçan embriyolarından elde edilen 100,000 hücreyi orta bölmeye ekleyin.Dokuz gün sonra, hücreler yan bölmeye doğru aksonlar uzatmış olacak ve deney için hazır hale gelecektir. Merhaba, ben Dana-Farber Kanser Enstitüsü Pediyatrik Onkoloji Bölümü'nde Dr. Rosalyn Siegel'in laboratuvarından Maria Murphy. Bugün size, bölmeli kültürlerde Dorsa root ganglia nöronlarının hazırlanması ve sürdürülmesi prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda nörotrofin sinyalizasyonunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Kompartmanlı odacıklar kurulmadan önce, P 35 doku kültür plakları kollajen ile kaplanmalıdır.Bunu yapmak için, plakalara 0,001 normal HCL içinde 0,71 mg/mL kolajen çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve bunları 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. İki gün sonra, kolajen kaplı plakaların ortasına bir pin tırmığı ile çizik oluşturun. Dışa doğru bir hareket uygulayın.Ardından, çizik bölgesinin ortasına 30 µL N iki Metil

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Bu video, kolajen ve reaktif olmayan gres kullanarak üç bölmeli bir hücre kültürü sistemi oluşturmayı göstermektedir. Bu sistem, glioma hücreleri ve aksonlar arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için kullanılır.

Nöronal Hücre Kültürü için Kollajen Kaplı Bölmeli Kültür Kaplarının Hazırlanması

Video, dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının Schwann hücreleri ile birlikte kültürlenmesini göstermektedir. DRG nöronları ilk olarak hizalanmış akson büyümesi için önceden gerilmiş bir zar üzerinde büyütülür. Daha sonra aksonlara bağlanan, onları izole eden ve nöral hücre sağkalımını ve işlevini destekleyen Schwann hücreleri tanıtılır.

Schwann Hücrelerinin Önceden Gerilmiş Bir Zar Üzerinde DRG Nöronları ile Ko-Kültürü

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) nöronları toplamak için bir yöntem gösterir. Bir sıçanın omurgasından DRG izole edilir, enzimlerle muamele edilir ve daha sonra tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Nöronlar, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak glial hücrelerden ayrılır ve bir büyüme ortamında kültürlenir.

Nöronal Kültürler için Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması ve Ayrıştırılması için Bir Teknik

Bu video, bir dorsal kök ganglion eksplant ve Schwann hücrelerinin kokülasyon modelini göstermektedir. Kokültür koşullarında, askorbik asit, Schwann hücrelerinin miyelinatör formlara farklılaşmasını teşvik eder. Miyelinizan Schwann hücreleri, sinir fonksiyonu için gerekli olan bir miyelin kılıfı oluşturmak için aksonları birden çok kez sarar.

Nöron Miyelinasyonu için Dorsal Kök Ganglion Eksplantının Schwann Hücreleri ile Birlikte Kültürlenmesi

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Bu protokol, çok bölmeli (MC) bir cihazda yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından ekilen dorsal kök ganglionunu (DRG) hasat etmek ve kültürlemek için bir teknik sağlar.

Periferik Nöronal Özellikleri İncelemek için Çok Bölmeli Cihazlarda Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması, Gömülmesi ve Kültürlenmesi

Öğrenin, dorsal root ganglia duyu nöronlarını kompartmanlı kültürlerde hazırlama ve bakım yöntemini. E15 sıçan embriyosu hücreleriyle akson uzamasını ve nöronal etkileşimleri inceleyin.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Daha fazla video keşfet