Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Bu video, HRP konjuge sekonder antikorlar kullanılarak civciv embriyosunda tüm Mount immünohistokimyasındaki farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, embriyo para formaldehit içinde sabitlenir. Daha sonra endojen peroksidaz aktivitesi söndürülür.

Embriyo daha sonra primer antikorda inkübe edilir. Birkaç yıkamadan sonra, embriyo HRP'ye konjuge edilmiş ikincil antikorda inkübe edilir, renk reaksiyonu DAB substratı kullanılarak ortaya çıkar ve antikor boyaması turuncu görünür. Bu yöntemin floresan antikorların kullanımına göre avantajı, embriyoların mum kesiti için işlenebilmesi ve böylece enine kesitteki antijen bölgelerinin incelenmesini sağlamasıdır.

Merhaba, ben Texas a ve Houston'daki Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki FIN Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün size HRP konjuge antikorlar kullanarak yanak embriyolarında hormon mount antikorları, boyamaları gerçekleştirmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, antiepileptik ilaçlarla tedaviyi takiben embriyoların morfolojisini incelemek için laboratuvarda kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım: Civciv embriyoları üzerinde tam montaj immünohistokimyası yapmak. İlk olarak, kabuğa forseps ile vurarak ve kabuğun parçalarını çıkararak bir yumurta açın. Kalın albümini forseps ile çıkarın ve yumurta sarısı torbasını kaba forseps ile embriyo yukarı bakacak şekilde eğin.

Daha sonra, embriyonun etrafında bir kare yumurta sarısı çuvalı kesmek için ince makası birleştirin. Embriyoyu bir kaşıkla yumurta sarısından çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında PBS içeren bir tabağa koyun. Sarısı içindeki zarları dikkatlice çıkarın ve embriyoyu PBS içeren taze bir tabağa aktarın.

Embriyoyu transfer ettikten sonra, embriyoyu forseps ve böcek iğneleri ile sabitleyin ve PBS'yi aspire edin. Bunu PBS'de% 4 PFA ile değiştirin ve potansiyel mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için embriyonun oda sıcaklığında bir saat sabitlenmesine izin verin. Embriyo sabitlendikten sonra aşağıdaki adımların tümü sabitlendiğinde D deiyonize H2O kullanın, fiksatif çözeltiyi aspire edin ve kimyasal atık olarak uygun şekilde atın.

Çanağı BS ile doldurun. Daha sonra, bir mikrodiseksiyon bıçağı kullanarak, ekstra embriyonik zarları çıkarmak için embriyonun etrafında bir kare kesin. Pimler çıkarıldıktan sonra böcek pimlerini forseps ile çıkarın. Embriyoyu PBT içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için künt uçlu bir mera pipeti kullanın.

Embriyoyu PBT ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBT'yi sintilasyon şişesinden çıkarın ve potansiyel endojen peroksidazı inaktive etmek için% 0.3 H 2 0 2 içeren PBTX ile değiştirin. Bir mutatör üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Embriyoyu PBT ile önce üç kez 10'ar dakika, ardından üç kez 30'ar dakika boyunca yıkayın. Embriyoyu antikorla lekelemek için. Embriyoyu bloke edici tamponda veya %1 BSA %1 NGS'de bir saat yıkayarak başlayın.

İkincil antikor keçide yükseldiği için NGS kullanıyoruz. İnkübasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca mutatör üzerinde inkübe edin, birincil antikoru bloke edici tamponda bire bir seyreltin ve embriyoyu bu çözelti içinde iki gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Mutatör üzerinde.

Primer antikor seyreltme faktörü, primer antikor seçimine bağlıdır. Burada, süper natin olarak sağlanan gelişimsel çalışmalar hibrit DOMA bankasından bir antikor kullanıyoruz. Tamponu bloke etmek için bire bir seyreltiyoruz.

Ardından, PBT'de 10 dakikalık üç yıkama ve ardından PBT'de birer saatlik üç yıkama gerçekleştirin. Yıkadıktan sonra, ikincil antikoru bloke edici tamponda bir ila 2.500 oranında seyreltin. Bu durumda, peroksidaz konjuge keçi anti-US IgG ve embriyoyu bu çözelti içinde gece boyunca mutatör üzerinde dört santigrat derecede inkübe eder.

Lekeli embriyonun renk reaksiyonunu geliştirmek için PBT'de 10 dakikalık üç yıkama ve ardından PBT'de birer saatlik üç yıkama gerçekleştirin. İlk iki 20 dakikalık yıkama tris tamponunda 100 milimolar tris, HCL pH 7.4. Daha sonra, son TS tampon yıkamasını embriyoyu içeren flakondan çıkarın ve beş mililitre DAB çözeltisi ile değiştirin.

Mutatör üzerinde 20 dakika karanlıkta tutun. Einor ucunu %10'luk bir ağartma solüsyonu içeren kovaya atın. DAB'ı dekontamine etmek için 16 mikrolitre ekleyin.

DAB'da embriyo içeren şişeye H 2 0 2 stoklayın. Karanlıkta tutun 10 dakika sonra, renk reaksiyonu tamamlandığında reaksiyonu mikroskop altında izleyin. DAB'ı çamaşır suyu kovasına atın, beş mililitre ile değiştirin.

Musluk suyu. Ardından, fotoğrafçılık ve balmumu kesitleme için işlemek üzere PBS'de 10 dakikalık iki yıkama gerçekleştirin. Lekeli embriyoyu bir etanol serisinde, her biri 10 dakika boyunca %25, %50, %75 ve %100 kurutun.

Dehidrasyondan sonra, etanolü 0,5 ila bir mililitre sedir ağacı yağı ile değiştirin. Bu, sedir ağacı yağında fotoğrafçılık için embriyo yarı saydam sürecini yapacaktır. Fotoğrafın ardından embriyoyu şişeye geri koyun ve sedir ağacı yağını %100 etanol ile değiştirin.

Son olarak, etanolü %100 etanol içinde %5 hızlı yeşil FCF ile değiştirin ve üç dakika inkübe edin. Bu adım, embriyoları histoloji için görünür hale getirecektir. Hızlı yeşil FCF çözeltisini %100 etanol ile değiştirin ve histoloji için işlem yapın.

İşte lekeli embriyolara üç örnek. Bu evre 11 embriyoları 15.3 B dokuz ile etiketlenir veya etiketlenmez. Bunlardan biri, Jane Dod ve Tom Gessel'in laboratuvarında geliştirilen bir nodal kord spesifik antikor.

DAB'da iki dakika sonra, embriyo hala şeffaftır. DAB'de 20 dakika sonra, düğüm kordonunda hafif bir etiketleme görülür. Son olarak, 40 dakika sonra, düğüm kordonunun etiketlenmesi tamamlanır.

Bu örnekte, Tom Jessel'in laboratuvarında geliştirilen bir antikor olan PAC yedinin, nöral tüp kapanmasının erken aşamalarını ve orta beyinden çıkan kraniyal nöral krest hücrelerini nasıl tanıdığını gösteriyoruz. Burada embriyo, David Wilkinson'ın laboratuvarından Croc 20 probu ile etiketlenir, ardından tek bir antikor gelmez. Size az önce tüm mount immünohistokimyasının embriyoları nasıl kontrol edeceğinizi gösterdik.

Bu prosedür, daha önce tam mount in situ hibridizasyon için işlenmiş embriyolarda da kullanılabilir. Bu durumda, in-situ hibridizasyonun ardından embriyoyu bir saat boyunca kısaca sabitleyin ve ardından antikor boyamaya devam edin. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.