Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi
2 Şubat 2009
Bu video tüm montaj immünhistokimya, bir antijen mekansal ve zamansal ifade desenini genç civciv embriyolarında görüntülendi edilebilecek bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından piyasaya sürüldü.
Bu video, HRP konjuge ikincil antikorlar kullanılarak civciv embriyosunda yapılan tüm mount immünohistokimyanın farklı adımlarını göstermektedir. İlk olarak, embriyo paraformaldehit ile fikse edilir. Ardından, endojen peroksidaz aktivitesi söndürülür.
Ardından embriyo primer antikor içinde inkübe edilir. Birkaç yıkama işleminden sonra, embriyo HRP ile konjuge edilmiş sekonder antikor içinde inkübe edilir. DAB substratı kullanılarak renk reaksiyonu ortaya çıkarılır ve antikor boyaması turuncu görünür. Bu yöntemin floresan antikorların kullanımına göre avantajı, embriyoların parafin kesit işlemi için hazırlanabilmesi ve böylece antijen bölgelerinin enine kesitlerde incelenebilmesine olanak tanımasıdır.
Merhaba, ben Houston'daki Texas A&M bünyesindeki Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki FIN Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün sizlere, HRP konjuge antikorlar kullanarak tavuk embriyolarında hormon montajlı antikor boyamalarının gerçekleştirilme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, antiepileptik ilaçlarla tedavi sonrası embriyoların morfolojisini incelemek için kullanıyoruz.
Civciv embriyolarında bütün mount immünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için başlayalım. İlk olarak, kabuğu pensle hafifçe vurarak ve kabuk parçalarını temizleyerek yumurtayı açın. Kalın albümini pensle uzaklaştırın ve embriyo yukarı bakacak şekilde vitellüs kesesini kaba pensle eğin.
Ardından, embriyo çevresindeki vitellüs kesesini kesmek için ince makas kullanın. Embriyoyu bir kaşık yardımıyla vitellüsten ayırın ve diseksiyon mikroskobu altında, PBS içeren bir kaba yerleştirin. Vitellüs içindeki membranları dikkatlice temizleyin ve embriyoyu PBS içeren taze bir kaba aktarın.
Embriyoyu aktardıktan sonra, pens ve entomoloji iğneleri ile embriyoyu sabitleyin ve PBS'yi aspire edin. Bunun yerine PBS içinde %4 PFA ekleyin ve potansiyel mikrobiyal kontaminasyonu minimize etmek için embriyonun oda sıcaklığında bir saat boyunca fikse olmasına izin verin. Embriyo fikse edildikten sonraki tüm adımlarda deiyonize H2O kullanın, fiksasyon solüsyonunu aspire edin ve kimyasal atık olarak uygun şekilde imha edin.
Kabı BS ile doldurun. Ardından, mikrodiseksiyon bıçağı kullanarak ekstra embriyonik membranları uzaklaştırmak için embriyonun etrafından kare şeklinde bir kesi yapın. Pinler çıkarıldıktan sonra, böcek iğnelerini pensle alın. Embriyoyu PBT içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için küt uçlu bir pastör pipeti kullanın.
Embriyoyu, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez PBT ile yıkayın. Potansiyel endojen peroksidazı inaktive etmek için sintilasyon şişesindeki PBT'yi boşaltın ve yerine %0.3H 2 0 2 içeren PBTX ekleyin. Oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde iki saat boyunca inkübe edin.
Embriyoyu önce üç kez 10'ar dakika, ardından üç kez 30'ar dakika PBT ile yıkayın. Embriyoyu antikor ile boyamak için, embriyoyu bir saat boyunca bloklama tamponunda veya %1BSA %1NGS içinde yıkayarak başlayın.
Sekonder antikor keçide üretildiği için NGS kullanıyoruz. İnkübasyondan sonra mutator üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, primer antikoru bloklama tamponunda bire bir oranında seyreltin ve embriyoyu bu çözeltide dört derece santigrat sıcaklıkta iki gün boyunca inkübe edin. Mutator üzerinde.
Primer antikor dilüsyon faktörü, seçilen primer antikora bağlıdır. Burada, süpernatant formunda sağlanan gelişimsel çalışmalar hibrid DOMA bankasından bir antikor kullanıyoruz. Bunu bloklama tamponu ile bire bir oranında dilüye ediyoruz.
Ardından, PBT ile üç kez 10 dakika boyunca yıkama yapın ve bunu PBT ile üç kez birer saatlik yıkamalarla takip edin. Yıkama işleminden sonra, sekonder antikoru bloklama tamponu ile 1:2.500 oranında seyreltin. Bu durumda, peroksidaz konjuge keçi anti-US IgG kullanın ve embriyoyu bu çözelti içerisinde, çalkalayıcıda dört °C'de gece boyunca inkübe edin.
Boyanmış embriyonun renk reaksiyonunu geliştirmek için önce PBT ile üç kez 10 dakikalık yıkama, ardından PBT ile üç kez bir saatlik yıkama yapın. İlk olarak 100 millimolar tris, HCL pH 7.4 tris tamponu ile iki kez 20 dakikalık yıkama gerçekleştirin. Daha sonra, embriyoyu içeren şişedeki son TS tamponu yıkamasını uzaklaştırın ve yerine beş milliliters DAB çözeltisi ekleyin.
Mutatörde 20 dakika boyunca karanlıkta bekletin. Einor ucunu %10'luk çamaşır suyu çözeltisi içeren kovaya atın. DAB'ı dekontamine etmek için 16 µL ekleyin.
DAB içeren embriyo tüplerine H₂O₂ stok çözeltisi ekleyin. Karanlıkta bekletin. 10 dakika sonra, renk reaksiyonu tamamlandığında reaksiyonu mikroskop altında izleyin. DAB'ı çamaşır suyu kovasına boşaltın ve beş mililitre ile yenileyin.
Musluk suyu. Ardından, fotoğraf çekimi ve parafin kesit işlemleri için PBS ile iki kez 10 dakikalık yıkama işlemi gerçekleştirin. Boyanmış embriyoyu %25, %50, %75 ve %100'lük etanol serilerinde, her biri 10 dakika olacak şekildeye dehidrate edin.
Dehidrasyonun ardından, etanolü 0,5 ila 1 mL sedir ağacı yağı ile değiştirin. Bu işlem, sedir ağacı yağı içindeki fotoğraf çekimi için embriyoyu yarı saydam hale getirecektir. Fotoğraf çekiminin ardından, embriyoyu tekrar şişeye yerleştirin ve sedir ağacı yağını %100 etanol ile değiştirin.
Son olarak, etanolü %100 etanol içindeki %5 fast green FCF ile değiştirin ve üç dakika boyunca inkübe edin. Bu adım, embriyoları histoloji için görünür hale getirecektir. Fast green FCF çözeltisini %100 etanol ile değiştirin ve histoloji için işleme alın.
Burada boyanmış embriyolara dair üç örnek yer almaktadır. Bu evre 11 embriyoları, Jane Dod ve Tom Gessel'ın laboratuvarında geliştirilen, nodal korda özgü bir antikor olan 15.3 B nine ile işaretlenmiştir veya işaretlenmemiştir.
DAB içerisinde iki dakika geçirdikten sonra embriyo hâlâ şeffaftır. DAB içerisinde 20 dakika geçtikten sonra, nodal kordda hafif bir işaretleme görülür. Son olarak, 40 dakika sonra nodal kordun işaretlenmesi tamamlanır.
Bu örnekte, Tom Jessel'in laboratuvarında geliştirilen bir antikor olan PAC seven'ın, nöral tüp kapanmasının erken evrelerini ve orta beyinden ortaya çıkan kranial nöral krist hücrelerini nasıl tanıdığını gösteriyoruz. Burada embriyo, David Wilkinson'ın laboratuvarından temin edilen Croc 20 probu ile işaretlenmiş ve ardından bir antikor uygulanmıştır. Size, chick embriyolarda bütün mount immünohistokimyanın nasıl yapılacağını göstermiş olduk.
Bu prosedür, daha önce tüm mount in situ hibridizasyon işlemi uygulanmış embriyolar için de kullanılabilir. Bu durumda, in situ hibridizasyonu takiben embriyoyu bir saat boyunca kısaca fikse edin ve ardından antikor boyama işlemine geçin. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, genç civciv embriyolarındaki antijenlerin mekansal ve zamansal ekspresyon modellerini görselleştirmek için kullanılan bir teknik olan tüm mount immünohistokimyayı göstermektedir. Yöntem, boyama sonuçlarını ortaya çıkarmak için fiksasyon ve antikor inkübasyonu dahil olmak üzere birkaç adım içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- İmmünohistokimya
Arka Plan
- Tüm vücut immünohistokimyası, embriyolarda antijen dağılımının incelenmesine olanak tanır.
- Bu teknik ilk olarak Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından tanıtılmıştır.
- Gelişimsel süreçler ve gen ekspresyonu hakkında bilgiler sağlar.
- HRP konjuge ikincil antikorlar, antijenlerin görselleştirilmesini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Bütünle bağışıklık boyama (whole mount immunohistochemistry) prosedürünü göstermek.
- Civciv embriyolarındaki antijen ekspresyonunu görselleştirmek.
- Bu yöntemin floresan antikor tekniklerine göre avantajlarını karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyoların paraformaldehit ile fiksasyonu.
- Endojen peroksidaz aktivitesinin sönümlenmesi.
- Primer ve sekonder antikorlar ile inkübasyon.
- Görselleştirme için DAB substratı kullanılarak renk reaksiyonunun ortaya çıkarılması.
Temel Sonuçlar
- Antikor boyaması turuncu görünür ve bu durum antijen tespitinin başarılı olduğunu gösterir.
- Embriyolar, boyama sonrası parafin kesit işlemi için hazırlanabilir.
- Bu yöntem, antijen bölgelerinin kesitsel çalışmalarına olanak tanır.
- HRP konjugatlı antikorların boyamadaki etkinliğini kanıtlar.
Sonuçlar
- Tüm mount immünohistokimya, civciv embriyolarının incelenmesi için değerli bir tekniktir.
- Antijen ekspresyon modellerinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
- Bu yöntem, sonraki histolojik analizler için avantajlıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Civciv embriyolarında bütün vücut immünohistokimyası, antijen ekspresyonunun mekânsal haritalanmasına olanak tanıyarak gelişimsel nörobilimde hedef doğrulamayı destekler. Bu yöntem, moleküler hedefleri hastalıkla ilgili bir sistemdeki fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltma sağlar. Parafin kesit alma ile uyumluluk, çapraz fonksiyonel ekiplerin immünohistokimyasal verileri histolojik analizlerle ilişkilendirmesine izin vererek preklinik hedef değerlendirmesinde translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gelişmekte olan nöral tüp ve somitteki antijen dağılımını görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Bozulmamış embriyolarda hedef etkileşiminin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Kurşun bileşik tanımlama için mekansal olarak çözümlenmiş ekspresyon verileri sağlayarak hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: HRP-konjuge ikincil antikorlar ve DAB substratı kullanarak standartlaştırılmış, tekrarlanabilir boyama paternleri oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Renk yoğunluğu aracılığıyla antijen bölgelerinin yarı kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak analiz optimizasyonunu destekler.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Parafin kesitleme ile uyumludur ve aynı boyanmış örneğin birden fazla alt analitik iş akışına hizmet etmesine imkan tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlgisi: Antiepileptik ilaçlar gibi bileşiklerin embriyotoksik etkilerini bir omurgalı modelinde incelemek için uygundur.
- Translasyonel Süreklilik: Tüm mount ve kesit formatları boyunca tutarlı antijen takibine olanak sağlayarak keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen fenotiplerin, gelişmekte olan dokulardaki hedef modülasyonu ile korelasyon gösterip göstermediğini netleştirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uyum sağlayarak, öncü bileşik optimizasyonu öncesindeki erken hedef doğrulama ve analiz geliştirme aşamalarını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Gelişmekte olan beyin ve nöral tüpteki spasyotemporal antijen ekspresyonunu ortaya çıkararak hipotez testlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Embriyonik sistemlerde tekrarlanabilir bileşik değerlendirmesini destekleyen standardize immünohistokimyasal okumalar sağlar.
- Analitik: Aydınlık alan mikroskopisi ile tespit edilebilen kromojenik sinyal üretir ve durum karşılaştırması için kantitatif görüntü analizine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Antijen lokalizasyonunun hem bütün mount hem de histolojik kesitlerde valide edilmesine izin vererek biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gelişimsel toksisite veya hedef ekspresyonu çalışan birden fazla projede uygulanabilen, yeniden kullanılabilir, histolojiye uygun bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Antijen varlığını belirli embriyonik yapılarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış fiksasyon, bloklama ve antikor inkübasyon adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonun histolojik onayını sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gelişimsel hedef etkileşim profillerine dayalı olarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Embriyo diseksiyonu, immünohistokimya ve kromojenik deteksiyon konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikroskoplara, mutatörlere ve DAB ile H2O2 kullanımı için havalandırma sistemlerine erişime bağlıdır.
- Antikor dilüsyonu ve yıkama protokollerinin ekipler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer türlere adaptasyon, geçirgenlik ve bloklama adımlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında daha uzun inkübasyon süreleri ve artefakt oluşumunu önlemek için DAB'ın dikkatli bir şekilde bertaraf edilmesi gerekliliği yer alır.
