Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Bu prosedür, P sıfır neonatal sıçanlardan superior servikal sempatik ganglionların izole edilmesiyle başlar. Her beyinde iki superior servikal sempatik ganglion bulunur. Tek bir sıçan yavrusu batınından yaklaşık 24 ganglion elde edilebilir.

Ganglionların disosiasyonu, 30 dakika boyunca tripsin ile işlemle başlar. Daha ileri disosiasyon, ateşle cilalanmış bir pastoral pipet ile tekrarlanan mekanik parçalama yoluyla gerçekleştirilerek tek hücre süspansiyonu elde edilir. Sempatik nöronlar daha sonra kolajen kaplı kaplara ekilir.

Merhaba, ben Columbia University City Patoloji ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nden Dr. Lloyd Green'in laboratuvarından Nila Zurin. Bugün, yeni doğmuş kırmızı köpek yavrularının superior servikal gangliyonlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu hücreleri tipik olarak sinir büyüme faktörü yoksunluğuna yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Prosedüre, diseksiyonu gerçekleştirmeden 24 saat önce bir kültür kabını sıçan kuyruk kolajeni ile kaplayarak başlıyoruz. Deneyin doğasına bağlı olarak, 24 kuyucuklu veya 48 kuyucuklu bir kültür plakası kullanılır.

Sıradaki çözeltiler, besiyerleri ve ekipmanlar hazırlanacaktır. Bu materyaller ve reaktifler, bu videoya eşlik eden metin protokolünde bulunabilir. Üridin ve beş FDU çözeltisinin hemen kullanımdan önce hazırlanması gerektiğinin belirtilmesi önemlidir.

Hazırlığa ateşle devam edin. Titrasyon adımları için cam pastör pipetlerini cilalayın. Cam pipetin ucu, daraltmak ve düzeltmek için döndürülerek birkaç saniye boyunca alevde tutulur.

Açılış alev cilalaması steril bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilmelidir. Diseksiyona başlamak için, P0 ile P1 arası neonatal sıçan yavruları toplayın. Kontaminasyonu azaltmak için bir neonatal sıçan yavrusu hızlıca %70 etanol ile silinir.

Dekapitasyon sonrası baş, ventral tarafı yukarı bakacak ve kuyruk kısmı size doğru yönelecek şekilde diseksiyon pedine yerleştirilir. Kesilmiş trakea kolayca görünür olmalıdır. Kesilen başı diseksiyon pedine sabitlemek için steril şırınga iğneleri şu şekilde kullanılır.

Bir pini ağız tavanından geçirerek pede sabitleyin ve ikinci pini kesilmiş spinal korddan geçirerek pede sabitleyin. Diseksiyon pedini mikroskobun altına taşıyıp okülerlerden baktıktan sonra, trakea çevresindeki deri ve yağ dokusunu temizlemek için iki çift pens kullanın. Çok derine inmemeye dikkat ederek, trakeanın her iki yanında birbirine neredeyse paralel uzanan bir çift kas ortaya çıkarılacaktır.

Diseksiyon sırasında, fazla kanı temizlemek için steril bir pastör pipetiyle soğuk steril PBS veya soğuk serumsuz RPMI 1640 besiyeri ile irigasyon yapmanız gerekecektir. Bu işlem, çalışma hızına bağlı olarak bir kez veya birden fazla kez gerçekleştirilebilir. Ardından, önce bir taraftaki kası kesip çıkarmak için pensler kullanılır.

Kas çıkarıldıktan sonra, karotis arteri görünür hale gelecektir. Bu arter, trakeanın yanından uzanır ve Y şeklinde bir şeride benzeyen bir yapıya ayrılır. Bu bifurkasyon önemli bir referans noktasıdır ve tespit edildiğinde, superior servikal ganglionların bulunması nispeten kolay olacaktır.

Arter en uç noktadan kesilir ve pensetle hafifçe yukarı kaldırılır. Arterin diğer ucu ise bağlı bırakılır. Bu işlem tamamlandığında, superior servikal ganglion görünür hale gelecektir.

Bifurkasyon noktasında artere gevşekçe tutunmuş, badem şeklinde, parlak görünümlü küçük bir doku kitlesi olduğu ve iplik benzeri pre ve/veya postganglionik bağlantılara sahip olduğu görülmelidir. Üst servikal ganglionu nazikçe ayırmak ve soğuk, serumsuz RPMI 1640 medyum içeren küçük 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirmek için ikinci bir forseps çifti kullanılır. Ardından, aynı protokol izlenerek trakeanın diğer tarafındaki ganglion çıkarılır.

Tüm gangliyonlar diseke edildikten sonra, yabancı dokulardan mümkün olduğunca arındırılırlar. Mikroskop altında, gangliyonlara karotis arter yağının veya diğer dokuların parçalarının yapışmış olduğu fark edilebilir; bu istenmeyen materyalleri ayıklamak için pens kullanılır. Pre ve/veya post ganglionik konnektifler de budanarak uzaklaştırılır.

Her bir ganglion yaklaşık 10.000 nörona sahiptir. Nöronlar ekildikten sonra, temizlenmiş nöronları yeniden büyüyecektir. Ganglionlar daha sonra, RPMI 1640 besiyeri içeren steril 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere yerleştirilir.

Ardından, sempatik nöron kültürü oluşturulur. Ganglionlar 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir ve supernatant atılır. Ganglionlar 0,5 ile 1 ml 0,25% tripsin çözeltisi içinde yeniden süspanse edilir ve ardından ganglionlardaki hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için 37 °C'lik bir su banyosuna veya inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirilir.

30 dakika sonra, tripsini seyreltmek ve nötralize etmek için 10 mililitre komple besiyeri eklenir. Ardından çözeltiler 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir. Daha sonra süpernatan uzaklaştırılır ve ganglionlar iki mililitre final besiyerinde yeniden süspande edilir.

Geniş açıklıklı, önceden hazırlanmış ateşle cilalanmış pipet uçlarından biri kullanılarak, ganglionların 20 kez yukarı ve aşağı çekilmesiyle hücreler daha fazla ayrıştırılır. Ardından tüp birkaç dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Sonrasında, açıklığı daha da daraltmak için pipet tekrar ateşle cilalanır.

Pipet soğuduktan sonra, gangliyonlar 20 kez daha tritüre edilir. Hücrelerin disosiye olduğunun göstergesi olarak ortam giderek daha bulanık hale gelecektir. Bu adım, hücrelerin ne kadar iyi disosiye olduğuna bağlı olarak bir veya iki kez daha tekrarlanır.

Bir süre sonra gangilyonlar nöronlara ayrışacak ve tüpte hiç sağlam gangilyon görünmeyecektir. Bu aşamada ayrışmayan bazı doku materyalleri kalabilir. Ayrışmamış kalıntıların dibe çökmesi için tüp birkaç dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.

Süpernatantın yaklaşık 50 mikrolitresi hariç tamamı dikkatlice toplanır ve başka bir tüpe aktarılır. İlişkisiz kalıntıların transferini önlemek için tüpün dibinde 50 mikrolitre bırakılır. Ayrıştırılmış hücreleri içeren tüpe daha fazla nihai besiyeri eklenir.

Eklenen nihai besiyeri hacmi, kullanılan kültür plağının türüne bağlıdır. Nöronların kültüre edilmesi için bir plak kullanılır. Örneğin, 24 kuyucuklu bir kap kullanılacaksa, kuyucuk başına 0,5 mililitre nihai besiyeri olacak şekilde her kuyucuğa bir ganglion ekleyin.

Tipik bir sıçan batını 12 yavrudan oluşur ve bu da 24 ganglion sağlar. Bu sayı, 1 adet 24 kuyucuklu plakayı ekmek için yeterlidir ve final besiyerinin toplam hacmi 12 mililitredir. Final besiyerinde üridin beş FDU kullanımı, küçük bir glia popülasyonunun ve diğer hücre tiplerinin proliferasyonunu önleyecek ve ölümlerini teşvik edecektir.

Kültürde bulunan hücreler, ortamın üçte ikisinin taze RPMI artı %1 at serumu artı NGF ve uridin ve beş FDU ile değiştirilmesiyle her 48 saatte bir beslenir. Başlangıçta kültür, nöron içermeyen ve yuvarlak görünen sempatik nöronlar içerir.

Kısa nöronlar diseksiyondan 24 saat sonra görünür hale gelir ve zamanla giderek daha yoğun ve dallı bir yapı kazanır. Yeni doğan sıçanların superior servikal ganglionlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken şunları hatırlamak önemlidir: birincisi, ganglionları temizlemek için zaman ayırın ve özen gösterin; tüm kalıntıları, kan damarlarını ve yağları uzaklaştırın.

Bu adım, aşağı yukarı homojen ve yabancı hücre tiplerinden arındırılmış bir kültür elde edilmesini sağlamak açısından önemlidir. İkinci olarak, disosyasyon adımında sabırlı olun ve nöronların büyük kümeler halinde kalmaması için onları ayırmaya zaman ayırın. Plakalara yerleştirildikten sonra, büyük kümeler süreci zorlaştıracaktır.

Nöronların kesilmesi veya enfekte edilmesi gibi sonraki uygulamalarda, immün boyama da engellenebilir ve nöronların sayılmasını gerektiren tüm deneylerin gerçekleştirilmesi aynı şekilde zor olacaktır. Son olarak, besiyerinin penisilinle streptomisinle desteklenmesi gerekli değildir. Hücreler her beslendiğinde ek penisilin streptomisin eklenmesine gerek yoktur; hücrelerin ilk ekim aşamasında yapıldığı işlem yeterlidir.

Besiyeri her değiştirildiğinde, besiyerine taze üridin beş FDU ekleyin. Laboratuvarımız, sinir büyüme faktörü yoksunluğuna yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için sempatik nöronal kültür kullanmıştır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.