Name: Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Öğrenin, yeni doğan sıçan yavrularından üstün servikal ganglionlardan sempatik nöronların izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu protokol, nörobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NZ sempatik nöronlar diseksiyon ve hasat onu eğitim için laboratuar üyeleri Subhas Biswas, Andrew Sproul ve Ryan Willet teşekkür etmek istiyorum. NIH-NINDS gelen bağışlarla desteklenir.

1. Diseksiyon için hazırlanması: <ol><li> Uygun kültür deneyler doğa bağlı olarak çanak (10 cm veya 6-iyi ya da 24 kuyu tabak, vb), ve sıçan kuyruklu kollajen 24 saat diseksiyonu önce ceket seçin. Sıçan kuyruğu kollajen hazırlanması ve kat kültür yemekleri kullanarak yöntemleri (1) başka bir yerde tarif edilmiştir. </li><li> % 0.25 tripsin çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS) (hiçbir EDTA) ve sterilize. -20 º C&#39;de 1 ml alikotları ve mağaza hazırlayın </li><li> Distile / deiyonize H 2 O. üridin, 2.5 mM ve 5-FDU içeren bir çözüm hazırlayın Filtre sterilize ve 50 ul alikotları hazırlamak. -20 º C&#39;de muhafaza </li><li> % 10 ısı inaktive at serumu (ısı 56 º C su banyosunda 30 dakika inkübe edilmesiyle inaktive) ve% 5 fetal sığır serumu: Komple Orta RPMI 1640 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Final Orta hazırlayın:% 1 ısı inaktive at serumu + NGF (100ηg/ml son konsantrasyon) + penisilin / streptomisin (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU çözüm RPMI 1640 kültür ortamı (10 mcM final konsantrasyon) . Not: her zaman kullanmadan önce bu ortamda taze yapılmalıdır. 24 plaka formatında bir deney için, bir 12 ml Bu orta hazırlamanız gerekir. Bu küçük bir ekstra hazırlar tavsiye edilir. NGF (Bu protokol sonunda Tablo) çeşitli ticari kaynaklardan satın alınabilir. </li><li> Ekipman: Tek bir diseksiyon mikroskobu ve ışık kaynağına ihtiyacınız olacaktır. Odaklanarak ipuçları ile ikili Gooseneck fiber optik aydınlatma tercih edilmektedir. Iki çift, paslanmaz çelik forseps mikro diseksiyon diseksiyon makas (paslanmaz çelik bir çift: Buna ek olarak, bir (otoklavlayarak ya da en az 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde sırılsıklam) aşağıdaki diseksiyon araçlarını temizlemek ve sterilize etmek için ihtiyacınız olacak ve Roboz her ikisi de). İki steril enjektör iğneleri (26 gague x 1 ½ inç veya benzeri) da ihtiyaç duyulacaktır. Bu bir diseksiyon tahtası, alüminyum folyo ile sarılır ve bir Kimwipe kaplı strafor 3 &quot;x3&quot; parça kurmak için gereklidir. Dekontamine% 70 etanol ile yönetim kurulu püskürtün. Son olarak, bir yangın parlatılmış cam mera pipet hazırlar. Yangın cilası için dönerken, cam pipet ve bir kaç saniye için alev ucu tutun. Inceleme üzerine, ucu pürüzsüz bir görünüm ve açılış dar olacaktır. Bu hücreler ayrılamaz adım için gerekli. Pipet steril kalması için bir hücre kültürü kaputu yangın parlatma gerçekleştirin. </li></ol> 2. Üstün Servikal Ganglia Diseksiyon: <ol><li> Yaş P0 ve P1 yenidoğan sıçan yavrularının toplayın. </li><li> Hızla kontaminasyon olasılığını azaltmak için% 70 etanol ile diseksiyon için yavru silin. </li><li> Hızla keskin bir makas çifti (bu adımı video gösterilmeyecektir) yavru başını kesmek. Kısaca aşırı kan akıtmak için steril gazlı bez karşı steril forseps kullanarak kafa tutun. </li><li> Ventral tarafı yukarı bakacak ve yönelmiştir kuyruk ucu ile diseksiyon pad üzerinde kafa yerleştirin. Kopmuş trakea kolayca görünür olmalıdır. Rağmen bir pin pad içine ağız çatı itme ve yastık içine kopmuş trakea rağmen ikinci pimi itin şu şekilde diseksiyon pad kopmuş başını sabitlemek için steril şırınga iğneleri kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında yastık yerleştirin ve diseksiyon başlayın. </li><li> Hem forseps (her elindeki biri), trakea çevresinde temizlemek deri ve yağ kullanımı, bakımı çok derin değil. Bunu yapmak neredeyse trakeanın her iki tarafında birbirine paralel çalışan kasların bir çift gösterecektir. Not: Diseksiyon sırasında, soğuk steril PBS veya soğuk, steril, Pasteur pipeti ile teslim aşırı kan yıkayacak ve bölgenin temiz ve nemli tutmak için serum serbest RPMI 1640 orta ile sulamak gerekir. Buna bağlı olarak sadece bir veya birden fazla kez yapılabilir, ne kadar hızlı bir çalışır. Bir deneyim dissektör için, bir çift gangliyon incelemek için sadece 2-3 dakika sürer. </li><li> Bir tarafta ilk kas kesip çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Kas kaldırıldıktan sonra, karotis arteri görünür hale gelecektir. Genellikle, ışığın pembemsi ve kan içerir. Çevresinde görebilirsiniz diğer kan damarları daha açık renkli görünebilir ve bu nedenle karotis arteri hemen fark olmayabilir. Bu arter bir &quot;Y&quot; şeklinde bir şerit gibi göründüğünü trakea ve çatallanmasıdır yanında çalışır. Bu çatallanma önemli bir dönüm noktası olduğunu ve bulunduğu kez, SCG bulmak için nispeten kolay olacaktır. </li><li> En kaudal sonunda arter Sever ve forseps (diğer ucu hala bağlı) ile hafifçe yukarı kaldırın. Bunu yaptığınızda, thr dokusu gevşek bifurkasyonunun noktada arter bağlı ve badem şekilli, parlak görünümlü küçük bir kitle var göreceksinizöncesi ve / veya post-ganglion bağlaçlar EAD gibi. Bu üstün servikal ganglion. Öte yandan ikinci bir çift forseps yavaşça soğuk, serum serbest RPMI 1640 orta içeren küçük bir kültür çanak (35 mm) ve yer ayırmak için kullanın. </li><li> Daha sonra, aynı protokol Trakeanın diğer tarafta ganglion ayıklamak. </li></ol> 3. Ganglia Temizleme: <ol><li> Bir kez tüm ganglionlar disseke olmuştur, onlar mümkün olduğunca gereksiz doku serbest bırakılmalıdır. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, karotis arter, yağ veya diğer doku parçalarıyla ganglionlar bağlı olduğunu görebilirsiniz. Bu istenmeyen maddeleri uzaklaştırmak kızdırmak için her el forseps ile çalışın. Yeri RPMI 1640 orta içeren, steril bir 15ml konik, polipropilen tüp içine ganglionlar temizlenir. </li><li> Öncesi ve / veya post-ganglion bağlaçlar da kesilmiş olmalı. Her ganglion yaklaşık 10.000 nöron vardır. Nöronlar kaplama sonra, onların neurites regrow. </li></ol> 4. Sempatik Nöron kültürü oluşturulması: <ol><li> 2 dakika boyunca 200xg ganglionlar Santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 0,5 - 1 ml% 0.25 tripsin çözüm ganglionlar tekrar 30 dakika için 37 ˚ C su banyosunda veya inkübatör yerleştirin. Bu ganglionlar hücreleri ayrıştırmaları yardımcı olacaktır. </li><li> 30 dakika sonra, Komple Orta sulandırmak ve 2 dakika boyunca 200xg tripsin ve santrifüj nötralize etmek için 10 ml ekleyin. </li><li> Final Orta 2 ml supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> Ayrıca yangın parlatılmış cam mera pipet ile ganglionlar yukarı ve aşağı triturating hücreleri ayrıştırmaları. Ganglionlar 20 kez Karışım ve birkaç dakika boyunca buz üzerinde tüp. </li><li> Bu arada, (yaklaşık 2 / 3, 1 / 2 mm çapında) açılış dar yapmak için daha fazla yangın lehçe pipet. Soğuyuncaya kadar birkaç dakika bekleyin ve 20 kat daha fazla ganglionlar çiğnemek. Devam ederken, orta cloudier hücrelerin tedricen ayrışmış olduğunu bildiren olacak. Kez ya da iki kez daha hücrelerin ayrıştırmaları ne kadar iyi bağlı olarak bu adımı yineleyin. Bir süre sonra, tüm ganglionlarda nöron içine ayrı ve hiç bozulmamış ganglionlar tüp içinde görünür olduğunu fark edeceksiniz. Ayrıştırmaları değil bazı doku malzeme olabilir. Bu noktada, herhangi bir undissociated enkaz altına yerleşmek böylece tüp buz oturup birkaç dakika izin verin. Şimdi dikkatli bir şekilde neredeyse tüm orta ve üst yerden başka bir tüp içinde toplamak. Undissociated enkaz toplamak etmemelerini sağlamak için tüpün alt kısmında yaklaşık 50 ul bırakın. Final orta ayrışmış hücreleri içeren tüp ekle: bu birimde kültür plakasına bir kültür nöronlar kullanarak türüne bağlıdır. Örneğin: iyi ortalama Final orta 0.5 ml 24-iyi bir yemek, iyi ortalama istihdam edilecek ise, daha sonra plakası 0.5 ganglionlar (~ 10.000 nöronlar de ortalama). 24 ganglionlar verecekti 12 yavrular, tipik bir sıçan çöp oluşur. Bu tohum 24-plaka ve Final orta toplam hacmi 12 ml yeterlidir. Not: ganglionlar kültüründe mevcut olacaktır glia ve diğer hücre türleri küçük bir nüfus da içerir. Final ortamda Uridine/5-FDU kullanılması silahların yayılmasını önlemek ve ölüm teşvik edecektir. </li><li> Yem hücreleri taze RPMI% 1 at serumu + NGF ve uridine/5-FDU ile 2 / 3 orta değiştirerek her 48 saatte bir. Not: İlk olarak, kültür, hiç neurites yuvarlak bir görünüm sempatik nöronlar içerir. Kısa neurites diseksiyonu 24 saat sonra görünür hale gelir ve kademeli olarak daha yoğun ve daha fazla zaman içinde dallı. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Biz kültürlerin Sprague Dawley rat kullanın. Ganglionlar temizlik zaman ve özen. Tüm artıkları, kan damarları ve yağ çıkarın. Bu adım, daha az ya da çok homojen ve gereksiz hücre tiplerinin bir kültür sağlanmasında önemlidir. Uridine/5-FDU eklenmesi, büyük ölçüde kültür kirlenmesine kalan (mitotik) non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırılması ya da en azından onların çoğalmasını baskıladığı. Buna ek olarak, ayrışma adım sırasında, sabırlı olun ve plakalar üzerine numaralı seribaşı sonra büyük yığınlarda bulunmayan böylece nör...

<table><tbody><tr><td>Pens, Paslanmaz çelik #5</td><td>Alet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Makas, DEAVER düz keskin-küt- 43mm bıçaklar - 5.5</td><td>Alet</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin içeren RPMI 1640</td><td>Reaktif</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Reaktif</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Donör At Serumu</td><td>Reaktif</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>30 dakika boyunca 56&amp;#x00B0;C su banyosunda inkübe ederek ısı ile inaktive edin.</td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>EDTA'sız Trypsin</td><td>Reaktif</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoksiüridin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reaktif</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu ve ışık kaynağı</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropilen tüpler</td><td>Alet</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kapları</td><td>Alet</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rat Üstün servikal ganglia (scg) kültür sempatik nöronlar protokolü

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Sıçanlarda üstün servikal ganglion (SCG), sempatik nöronlar içeren küçük, parlak, badem biçimli yapılar. Bu nöronlar, baş ve boyun bölgeleri için sempatik innervations sağlamak ve iyi karakterize ve görece homojen bir nüfus (4) oluşturmaktadır. Sempatik nöronlar NGF, kullanılabilirlik, kendi kültür ve deneysel manipülasyon (2, 3, 6) kolaylaştırır, hayatta kalma, farklılaşma ve aksonal büyüme ve yaygın sinir büyüme faktörü (NGF) bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı, kültürlü, sempatik nöronlar nöronal gelişim ve farklılaşma, ve patolojik programlanmış hücre ölümü mekanizmaları ve sinyal iletimi (1, 2, 5 ve 6) da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede çalışmalar kullanılmaktadır. Yeni doğan sıçan ve kültür sempatik nöronlar SCG Diseksiyon çok karmaşık değildir ve oldukça hızlı bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, yeni doğan sıçan yavrular SCG incelemek ve sempatik nöronların kültürleri kurmak için bunları kullanmak için ne kadar detaylı bir şekilde anlatacağız. Makalede ayrıca, hazırlık adımları ve bunu başarmak için gerekli olan çeşitli reaktifler ve ekipman anlatacağız.

Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.

Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Sıçanlardaki superior servikal ganglionlar (SCG); sempatik nöronlar içeren küçük, parlak, badem şeklinde yapılardır. Bu nöronlar ...

Bu prosedür, P sıfır neonatal sıçanlardan superior servikal sempatik ganglionların izole edilmesiyle başlar. Her beyinde iki superior servikal sempatik ganglion bulunur. Tek bir sıçan yavrusu batınından yaklaşık 24 ganglion elde edilebilir.Ganglionların disosiasyonu, 30 dakika boyunca tripsin ile işlemle başlar. Daha ileri disosiasyon, ateşle cilalanmış bir pastoral pipet ile tekrarlanan mekanik parçalama yoluyla gerçekleştirilerek tek hücre süspansiyonu elde edilir. Sempatik nöronlar daha sonra kolajen kaplı kaplara ekilir.Merhaba, ben Columbia University City Patoloji ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nden Dr. Lloyd Green'in laboratuvarından Nila Zurin. Bugün, yeni doğmuş kırmızı köpek yavrularının superior servikal gangliyonlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu hücreleri tipik olarak sinir büyüme faktörü yoksunluğuna yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Prosedüre, diseksiyonu gerçekleştirmeden 24 saat önce bir kültür kabını sıçan kuyruk kolajeni ile kaplayarak başlıyoruz. Deneyin doğasına bağlı olarak, 24 kuyucuklu veya 48 kuyucuklu bir kültür plakası kullanılır.Sıradaki çözeltiler, besiyerleri ve ekipmanlar hazırlanacaktır. Bu materyaller ve reaktifler, bu videoya eşlik eden metin protokolünde bulunabilir. Üridin ve beş FDU çözeltisinin hemen kullanımdan önce hazırlanması gerektiğinin belirtilmesi önemlidir.Hazırlığa ateşle devam edin. Titrasyon adımları için cam pastör pipetlerini cilalayın. Cam pipetin ucu, daraltmak ve düzeltmek için döndürülerek birkaç saniye boyunca alevde tutulur.Açılış alev cilalaması steril bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilmelidir. Diseksiyona başlamak için, P0 ile P1 arası neonatal sıçan yavruları toplayın. Kontaminasyonu azaltmak için bir neonatal sıçan yavrusu hızlıca %70 etanol ile silinir.Dekapitasyon sonrası baş, ventral tarafı yukarı bakacak ve kuyruk kısmı size doğru yönelecek şekilde diseksiyon pedine yerleştirilir. Kesilmiş trakea kolayca görünür olmalıdır. Kesilen başı diseksiyon pedine sabitlemek için steril şırınga iğneleri şu şekilde kullanılır.Bir pini ağız tavanından geçirerek pede sabitleyin ve ikinci pini kesilmiş spinal korddan geçirerek pede sabitleyin. Diseksiyon pedini mikroskobun altına taşıyıp okülerlerden baktıktan sonra, trakea çevresindeki deri ve yağ dokusunu temizlemek için iki çift pens kullanın. Çok derine inmemeye dikkat ederek, trakeanın her iki yanında birbirine neredeyse paralel uzanan bir çift kas ortaya çıkarılacaktır.Diseksiyon sırasında, fazla kanı temizlemek için steril bir pastör pipetiyle soğuk steril PBS veya soğuk serumsuz RPMI 1640 besiyeri ile irigasyon yapmanız gerekecektir. Bu işlem, çalışma hızına bağlı olarak bir kez veya birden fazla kez gerçekleştirilebilir. Ardından, önce bir taraftaki kası kesip çıkarmak için pensler kullanılır.Kas çıkarıldıktan sonra, karotis arteri görünür hale gelecektir. Bu arter, trakeanın yanından uzanır ve Y şeklinde bir şeride benzeyen bir yapıya ayrılır. Bu bifurkasyon önemli bir referans noktasıdır ve tespit edildiğinde, superior servikal ganglionların bulunması nispeten kolay olacaktır.Arter en uç noktadan kesilir ve pensetle hafifçe yukarı kaldırılır. Arterin diğer ucu ise bağlı bırakılır. Bu işlem tamamlandığında, superior servikal ganglion görünür hale gelecektir.Bifurkasyon noktasında artere gevşekçe tutunmuş, badem şeklinde, parlak görünümlü küçük bir doku kitlesi olduğu ve iplik benzeri pre ve/veya postganglionik bağlantılara sahip olduğu görülmelidir. Üst servikal ganglionu nazikçe ayırmak ve soğuk, serumsuz RPMI 1640 medyum içeren küçük 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirmek için ikinci bir forseps çifti kullanılır. Ardından, aynı protokol izlenerek trakeanın diğer tarafındaki ganglion çıkarılır.Tüm gangliyonlar diseke edildikten sonra, yabancı dokulardan mümkün olduğunca arındırılırlar. Mikroskop altında, gangliyonlara karotis arter yağının veya diğer dokuların parçalarının yapışmış olduğu fark edilebilir; bu istenmeyen materyalleri ayıklamak için pens kullanılır. Pre ve/veya post ganglionik konnektifler de budanarak uzaklaştırılır.Her bir ganglion yaklaşık 10.000 nörona sahiptir. Nöronlar ekildikten sonra, temizlenmiş nöronları yeniden büyüyecektir. Ganglionlar daha sonra, RPMI 1640 besiyeri içeren steril 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere yerleştirilir.Ardından, sempatik nöron kültürü oluşturulur. Ganglionlar 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir ve supernatant atılır. Ganglionlar 0,5 ile 1 ml 0,25% tripsin çözeltisi içinde yeniden süspanse edilir ve ardından ganglionlardaki hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için 37 °C'lik bir su banyosuna veya inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirilir.30 dakika sonra, tripsini seyreltmek ve nötralize etmek için 10 mililitre komple besiyeri eklenir. Ardından çözeltiler 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir. Daha sonra süpernatan uzaklaştırılır ve ganglionlar iki mililitre final besiyerinde yeniden süspande edilir.Geniş açıklıklı, önceden hazırlanmış ateşle cilalanmış pipet uçlarından biri kullanılarak, ganglionların 20 kez yukarı ve aşağı çekilmesiyle hücreler daha fazla ayrıştırılır. Ardından tüp birkaç dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Sonrasında, açıklığı daha da daraltmak için pipet tekrar ateşle cilalanır.Pipet soğuduktan sonra, gangliyonlar 20 kez daha tritüre edilir. Hücrelerin disosiye olduğunun göstergesi olarak ortam giderek daha bulanık hale gelecektir. Bu adım, hücrelerin ne kadar iyi disosiye olduğuna bağlı olarak bir veya iki kez daha tekrarlanır.Bir süre sonra gangilyonlar nöronlara ayrışacak ve tüpte hiç sağlam gangilyon görünmeyecektir. Bu aşamada ayrışmayan bazı doku materyalleri kalabilir. Ayrışmamış kalıntıların dibe çökmesi için tüp birkaç dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.Süpernatantın yaklaşık 50 mikrolitresi hariç tamamı dikkatlice toplanır ve başka bir tüpe aktarılır. İlişkisiz kalıntıların transferini önlemek için tüpün dibinde 50 mikrolitre bırakılır. Ayrıştırılmış hücreleri içeren tüpe daha fazla nihai besiyeri eklenir.Eklenen nihai besiyeri hacmi, kullanılan kültür plağının türüne bağlıdır. Nöronların kültüre edilmesi için bir plak kullanılır. Örneğin, 24 kuyucuklu bir kap kullanılacaksa, kuyucuk başına 0,5 mililitre nihai besiyeri olacak şekilde her kuyucuğa bir ganglion ekleyin.Tipik bir sıçan batını 12 yavrudan oluşur ve bu da 24 ganglion sağlar. Bu sayı, 1 adet 24 kuyucuklu plakayı ekmek için yeterlidir ve final besiyerinin toplam hacmi 12 mililitredir. Final besiyerinde üridin beş FDU kullanımı, küçük bir glia popülasyonunun ve diğer hücre tiplerinin proliferasyonunu önleyecek ve ölümlerini teşvik edecektir.Kültürde bulunan hücreler, ortamın üçte ikisinin taze RPMI artı %1 at serumu artı NGF ve uridin ve beş FDU ile değiştirilmesiyle her 48 saatte bir beslenir. Başlangıçta kültür, nöron içermeyen ve yuvarlak görünen sempatik nöronlar içerir.Kısa nöronlar diseksiyondan 24 saat sonra görünür hale gelir ve zamanla giderek daha yoğun ve dallı bir yapı kazanır. Yeni doğan sıçanların superior servikal ganglionlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken şunları hatırlamak önemlidir: birincisi, ganglionları temizlemek için zaman ayırın ve özen gösterin; tüm kalıntıları, kan damarlarını ve yağları uzaklaştırın.Bu adım, aşağı yukarı homojen ve yabancı hücre tiplerinden arındırılmış bir kültür elde edilmesini sağlamak açısından önemlidir. İkinci olarak, disosyasyon adımında sabırlı olun ve nöronların büyük kümeler halinde kalmaması için onları ayırmaya zaman ayırın. Plakalara yerleştirildikten sonra, büyük kümeler süreci zorlaştıracaktır.Nöronların kesilmesi veya enfekte edilmesi gibi sonraki uygulamalarda, immün boyama da engellenebilir ve nöronların sayılmasını gerektiren tüm deneylerin gerçekleştirilmesi aynı şekilde zor olacaktır. Son olarak, besiyerinin penisilinle streptomisinle desteklenmesi gerekli değildir. Hücreler her beslendiğinde ek penisilin streptomisin eklenmesine gerek yoktur; hücrelerin ilk ekim aşamasında yapıldığı işlem yeterlidir.Besiyeri her değiştirildiğinde, besiyerine taze üridin beş FDU ekleyin. Laboratuvarımız, sinir büyüme faktörü yoksunluğuna yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için sempatik nöronal kültür kullanmıştır. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Bu video, sıçan embriyolarından dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarını izole etmek ve olgun Schwann hücreleri oluşturmak için bunları Schwann hücre öncüleri ile birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. İzole edilen DRG'ler, nöronları ve glial hücreleri izole etmek için işlenir. İzole edilen hücreler, nöronları saflaştırmak için kültürlenir ve daha sonra bir ko-kültür ortamında Schwann hücre benzeri hücreler (SCLC'ler) ile birlikte kültürlenir. DRG nöronları ile etkileşim,...

DRG Nöronlarının İzolasyonu ve Schwann Hücreleri Oluşturmak için Schwann Hücre Öncüleri ile Kokültür

Bu video, fare omurga köklerinden Schwann hücrelerinin izolasyonunu ve kültürlenmesini özetlemektedir. İzole edilen hücreler daha sonra spesifik ortamda kültürlenir. Schwann hücreleri, diferansiyel sindirim ve aderans yoluyla izole edilir. Daha sonra bağlanma ve çoğalma için hücre dışı matris kaplı lamellere aktarılırlar.

Schwann Hücrelerinin Fare Omurga Köklerinden İzolasyonu

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Bu yazı, embriyonik sıçan sempatik nöronların superior servikal gangliyondan izole ve kültürlenmesini açıklamaktadır. Ayrıca immünositokimyasal boyama ve kütle spektrometrik analizi için nöronal özler hazırlamak için ayrıntılı protokoller sağlar.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Chick siliker gangliyonu (CG) parasempatik sinir sisteminin bir parçasıdır. Civciv CG nöronların nöronal kültürlersinir kas etkileşimleri çalışmada etkili hücre modelleri olduğu gösterilmiştir. Biz diseksiyon, dissosilasyon ve civciv embriyolarından CG nöronların in vitro kültür için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, superior servikal ganglionu tanımlayarak ve rezeke ederek adrenerjik innervasyonun ablasyonunun bir fare modelini tanımlamaktadır.

Bir Murin Modelinde Superior Servikal Ganglionektomi için Cerrahi Teknik

Öğrenin, yeni doğan sıçan yavrularından üstün servikal ganglionlardan sempatik nöronların izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu protokol, nörobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir temel sunar.

Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Daha fazla video keşfet