Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Bu prosedür, P sıfır neonatal sıçanlardan superior servikal sempatik ganglionların izole edilmesiyle başlar. Her beyinde iki adet superior servikal sempatik ganglion bulunur. Tek bir sıçan yavru batınından yaklaşık 24 ganglion elde edilebilir.

Gangliyonların disosiasyonu, 30 dakika boyunca uygulanan işlem ve tedavi ile başlar. Daha ileri disosiasyon, tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar ateşle cilalanmış bir pastör pipeti ile tekrarlanan mekanik parçalama yoluyla gerçekleştirilir. Sempatik nöronlar daha sonra kollajen ENC kaplı kaplara ekilir.

Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Şehir kampüsü, Patoloji ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nde Dr. Lloyd Green'in laboratuvarından Nila Zurin. Bugün, yeni doğmuş kırmızı fare yavrularının superior servikal ganglionlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstereceğiz. Laboratuvarımızda, bu hücreleri genellikle sinir büyüme faktörü çekilmesine yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. İşleme, diseksiyonu gerçekleştirmeden 24 saat önce bir kültür kabını sıçan kuyruğu kolajeni ile kaplayarak başlıyoruz. Deneyin doğasına bağlı olarak, 24 kuyuklu veya 48 kuyuklu bir kültür plakası kullanılır.

Sıradaki solüsyonlar, ortamlar ve ekipmanlar hazırlanacaktır. Bu malzemeler ve reaktifler, bu videoya eşlik eden metin protokolünde bulunabilir. Uridin ve beş FDU solüsyonunun hemen kullanım öncesinde hazırlanması gerektiğini belirtmek önemlidir.

Hazırlığa ateşle devam edin. Titrasyon basamakları için cam pastör pipetlerini cilalayın. Cam pipetin ucu, daraltmak ve düzeltmek için döndürülerek birkaç saniye boyunca alevde tutulur.

Başlangıçtaki alevle cilalama işlemi steril bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilmelidir. Diseksiyona başlamak için P sıfır ile P bir arası dönemdeki yeni doğmuş sıçan yavrularını toplayın. Kontaminasyonu azaltmak için yeni doğmuş sıçan yavrusu hızlıca %70 ethanol ile silinir.

Dekapite sonrası baş, ventral tarafı yukarı bakacak ve kuyruk kısmı size dönük olacak şekilde diseksiyon pedine yerleştirilir. Kesilmiş trake kolayca görülebilir olmalıdır. Kesilen başı diseksiyon pedine sabitlemek için steril şırınga iğneleri şu şekilde kullanılır.

Bir raptiyeyi ağız tavanından geçirerek pedin üzerine sabitleyin ve ikinci raptiyeyi kesilmiş omurilikten geçirerek pede sabitleyin. Diseksiyon pedini mikroskobun altına taşıyıp okülerlerden baktıktan sonra, trakea çevresindeki deri ve yağları temizlemek için iki çift pens kullanın. Çok derine inmemeye dikkat ederek, trakeanın her iki yanında birbirine neredeyse paralel uzanan bir çift kas ortaya çıkacaktır.

Diseksiyon sırasında, fazla kanı temizlemek için steril bir pastör pipeti ile uygulanan soğuk steril PBS veya soğuk serumsuz RPMI 1640 besiyeri ile irrigasyon yapmanız gerekecektir. Bu işlem, çalışma hızınıza bağlı olarak bir veya birden fazla kez gerçekleştirilebilir. Ardından, önce bir taraftaki kası kesip çıkarmak için pensler kullanılır.

Kas çıkarıldıktan sonra, karotis arteri görünür hale gelecektir. Bu arter trakeanın yanında uzanır ve Y şeklinde bir şeride benzeyen bir yapıya ayrılır. Bu bifurkasyon önemli bir referans noktasıdır ve tespit edildiğinde, superior servikal ganglionları bulmak nispeten kolay olacaktır.

Arter en uç kısmından kesilir ve pensle hafifçe yukarı kaldırılır. Arterin diğer ucu ise bağlı bırakılır. Bu işlem tamamlandığında, superior servikal ganglion görünür hale gelecektir.

Bifurkasyon noktasında artere gevşekçe tutunmuş, badem şeklinde, parlak görünümlü küçük bir doku kütlesi olduğu ve iplik benzeri pre ve/veya postganglionik bağlantılara sahip olduğu görülmelidir. Üst servikal ganglionu nazikçe ayırmak ve soğuk, serumsuz RPMI 1640 ortamı içeren küçük 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirmek için ikinci bir pens kullanılır. Ardından, aynı protokol izlenerek trakeanın diğer tarafındaki ganglion çıkarılır.

Tüm ganglionlar diseke edildikten sonra, yabancı dokulardan mümkün olduğunca arındırılırlar. Mikroskop altında bakıldığında, ganglionlara yapışmış karotis arteri yağı veya diğer doku parçaları olduğu fark edilebilir; bu istenmeyen materyalleri ayıklamak için doku pensleri kullanılır. Pre- ve/veya postganglionik konnektifler de budanarak uzaklaştırılır.

Her bir ganglion yaklaşık 10.000 nörona sahiptir. Nöronlar ekildikten sonra, temizlenmiş nöronlarını yeniden büyüteceklerdir. Ganglionlar daha sonra, RPMI 1640 besiyeri içeren steril 15 mililitre konik polipropilen tüplere yerleştirilir.

Ardından, sempatik nöron kültürü oluşturulur. Ganglionlar 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir ve supernatant atılır. Ganglionlar 0,5 ila 1 mL 0,25% tripsin solüsyonunda yeniden süspande edilir ve ardından ganglionlardaki hücrelerin disosiasyonuna yardımcı olmak için 37 °C'lik bir su banyosuna veya inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirilir.

30 dakika sonra, tripsini seyreltmek ve nötralize etmek için 10 mililitre komple besiyeri eklenir. Ardından çözeltiler 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj edilir. Daha sonra süpernatant atılır ve gangliyalar iki mililitre final besiyerinde yeniden süspanse edilir.

Geniş ağızlı, önceden hazırlanmış alevle cilalanmış pipet uçlarından biri kullanılarak, gangliyonlar 20 kez aşağı yukarı çekilip itilerek hücrelerin daha fazla ayrışması sağlanır. Ardından tüp, birkaç dakika boyunca buza yerleştirilir. Sonrasında, ağzın daha da daraltılması için pipet tekrar alevle cilalanır.

Pipet soğuduktan sonra, gangliyonlar 20 kez daha tritüre edilir. Hücrelerin disosiye olduğunun göstergesi olarak besiyeri giderek daha bulanık hale gelecektir. Bu adım, hücrelerin disosiye olma durumuna bağlı olarak bir veya iki kez daha tekrarlanır.

Bir süre sonra, ganglionlar nöronlara ayrışmış olacak ve tüpte hiç sağlam ganglion görünmeyecektir. Bu aşamada ayrışmayan bazı doku materyalleri kalabilir. Ayrışmamış kalıntıların dibe çökmesi için tüp birkaç dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.

Süpernatantın yaklaşık 50 µL'si hariç tamamı dikkatlice toplanır ve başka bir tüpe aktarılır. İlişkisiz döküntülerin transferini önlemek için tüpün dibinde 50 µL bırakılır. Ayrıştırılmış hücreleri içeren tüpe daha fazla nihai besiyeri eklenir.

Eklenen nihai besiyeri hacmi, nöronların kültürü için kullanılan kültür plağının türüne göre değişir. Örneğin, 24 kuyucuklu bir kap kullanılacaksa, her kuyucuğa 0,5 mililitre nihai besiyeri ile bir gangliyon ekleyin.

Tipik bir sıçan batınında 12 yavru bulunur ve bu da 24 ganglion sağlar. Bu sayı, 24 kuyucuklu 1 plakayı ekmek için yeterlidir ve nihai medyumun toplam hacmi 12 mililitredir. Nihai medyumda uridin beş FDU kullanımı, küçük bir glia ve diğer hücre tipi popülasyonunun proliferasyonunu önleyecek ve ölümünü teşvik edecektir.

Kültürde bulunan hücreler, besiyerinin üçte ikisi değiştirilerek her 48 saatte bir beslenir. Besleme işlemi taze RPMI'ye %1 at serumu, NGF, uridin ve beş FDU eklenerek gerçekleştirilir. Başlangıçta kültür, nöron içermeyen ve yuvarlak görünümlü sempatik nöronlar içerir.

Kısa nöronlar, diseksiyondan 24 saat sonra görünür hale gelir ve zamanla kademeli olarak yoğunlaşarak daha fazla dallanırlar. Yeni doğmuş sıçan yavrularının superior servikal ganglionlarından primer sempatik nöronların nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken şunları hatırlamak önemlidir: birincisi, ganglionları temizlerken zaman ayırın ve dikkatli olun; tüm kalıntıları, kan damarlarını ve yağları temizleyin.

Bu adım, az çok homojen ve yabancı hücre tiplerinden arındırılmış bir kültür elde edilmesini sağlamak açısından önemlidir. İkincisi, disosiasyon aşamasında sabırlı olun ve nöronların büyük kümeler halinde kalmaması için onları ayırmaya zaman ayırın. Plakalara yerleştirildikten sonra, büyük kümeler süreci zorlaştıracaktır.

Nöronların kesilmesi veya enfekte edilmesi gibi sonraki uygulamalarda, immün boyama da engellenebilir ve nöronların sayılmasını gerektiren tüm deneyleri yürütmek aynı şekilde zor olacaktır. Son olarak, besiyerinin penisilin streptomisin ile takviye edilmesine gerek yoktur. Kültürlere her besleme yapıldığında ek penisilin streptomisin eklenmesine gerek yoktur; hücrelerin ilk ekildiği an yeterlidir.

Besiyeri her değiştirildiğinde ortama taze uridine five FDU ekleyin. Laboratuvarımız, sinir büyüme faktörü yoksunluğuna yanıt olarak gelişen apoptozu incelemek için sempatik nöronal kültür kullanmıştır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.