Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

Burada izole etmek için bir yöntem ve postnatal fare kültür serebellar granül nöron progenitör hücreleri ve serebellar granül nöronlar sunuyoruz.

Bu prosedür, beyinciğin P dörtten P beşe çıkarılmasıyla başlar. Yenidoğan fareler, meninksler ve koroid pleksus, daha sonra 15 mililitrelik konik bir tüpte toplanan bireysel beyinsellikten çıkarılır. Serebella papain ile ayrışır ve hafif bir tasyon ile tek hücreli bir süspansiyona getirilir.

Bu süspansiyon, 70 mikron gözenek boyutuna sahip naylon bir ağ aracılığıyla yerçekimi ile süzülür. Akış, süreksiz bir perca gradyasının üzerine nazikçe katmanlanır ve granül hücrelerini gliadan nöronlara ve Perkin gen nöronlarına ayırmak için santrifüjlenir. Degradenin arayüzündeki hücreler toplanır ve poli de lisin kaplı plakalar üzerine ppl'lenir.

Glial hücreleri daha fazla uzaklaştırmak için, granül hücreleri toplanır, sayılır ve poli de lisin kaplı cam örtü fişleri veya plastik kültür plakaları üzerine istenen yoğunluklarda kaplanır. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Patoloji Bölümü'nde Dr.Lloyd Green'in laboratuvarından merhaba genç Lee. Bugün size doğum sonrası farelerden serebellar granül nöronlarını izole etmek ve kültürlemek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda granül nöro progenitör proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedür, serebellar granül hücrelerini ayırmak için diseksiyon alanında% 70 etanol kullanmakla başlar, Papin ayrışma sistemini kullanırız.

Yeni bir kite başlarken, albümin OVO eşit MOID inhibitör çözeltisini hazırlayın. Bunu yapmak için, kitte verilen 32 mililitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisi veya EBSS'yi alın ve albümin OVO moid karışımına ekleyin. İçeriğin çözülmesini sağlamak için diğer bileşenleri hazırlarken bir kenara koyun.

Daha sonra, ayrışma kitinden bir papain şişesine beş mililitre EBSS ekleyin. Her flakon, dört ila 15 serebellayı P beş fareden ayırmak için yeterlidir. Daha sonra papain şişesini, papa tamamen çözülene ve çözelti berrak görünene kadar beş ila 10 dakika boyunca% 5 CO 2 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Diseksiyon sırasında çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Ardından, kitten 1D NAS şişesine 500 mikrolitre EBSS ekleyin. Şişeye hafifçe vurarak hafifçe karıştırın.

DNAS saf denatürasyona duyarlı olduğundan, mil başına 20 birim ve% 0.005 DNA'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için bu çözeltiden 250 mikrolitre pepane şişesine ekleyin, kalan DNA dosyasını sonraki adımlarda kullanmak üzere saklayın. Aletler ve reaktifler hazır olduğunda, bu prosedür için serebellayı diseksiyona ve meninksleri çıkarmaya devam edin. C 57 siyah altı fare, doğum sonrası dördüncü ve altıncı günler arasında kullanılır.

Bu yaş aralığı, granül hücre kültürü için en uygunudur, çünkü 15 mililitre HBSS glikozu 60 milimetrelik bir plastik doku kültürü kabına ve 10 mililitreyi steril 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetlemeye başlamak için dış granül tabakasının veya EGL granül hücre progenitörlerinin sayısı maksimumdur. Tüpü buzun üzerine yerleştirin, yavrunun başını %70 etanol ile silin. Kafayı çıkarmak için perce makası kullanın.

Kafayı kaputun içine aktarın ve kafatasının arkası net bir şekilde görülebilecek şekilde forseps ile tutun. Beyne erişmek için mikro diseksiyon makasını ustabaşı magnumuna sokun ve ardından doğrudan gözlere doğru kesin. İnce dumont kullanın.

Beş numara, cildi soymak ve beyni ortaya çıkarmak için kafatasını kaldırmak için forseps. Sonra beyinciği ve çevresindeki orta beyni çimdikleyin. HBSS glikoz içeren tabağa aktarın.

Beyincik hala çevre dokuya bağlıysa, beyinciği manipüle etmenin ve meninksleri çıkarmanın daha kolay olduğunu unutmayın. Daha sonra, dokuyu bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Ardından, beyinciği plakaya sabitlemek için bir set forseps kullanın.

İnce dumont kullanın. Beş numara, meninksleri beyincikten ve loblar arasından nazikçe soymak için forseps. Beyincik yüzeyinde kan damarları fark edeceksiniz.

Bu kan damarları, meninksleri tanımlamanın iyi bir yoludur. Beyincik keçeleşmiş beyaz bir görünüm alana kadar meninksleri çıkarmaya devam edin. Sonra beyinciği orta beynin geri kalanından ayırın.

Ventral tarafına çevirin ve ventral beyincik ile bitişik orta beyin arasında kırmızımsı bir şerit gibi görünen koroid pleksusu çıkarın. Beyincik diseke edilir edilmez, buz üzerindeki 15 mililitrelik konik tüpte soğuk HBSS glikozuna yerleştirin. Üç beyni inceledikten sonra, diseksiyon solüsyonunu taze HBSS glikozu ile değiştirin.

Serebellar diseksiyona daha aşina hale geldikçe, diseksiyon süresini yavru başına altı dakikadan fazla olmayacak şekilde azaltmaya çalışın. Diseksiyonlar tamamlandığında, hücre süspansiyonu ile devam edin. Serebellar diseksiyonlardan bir hücre süspansiyonu oluşturma adımı.

İlk olarak, HBSS glikozunu tüpten çıkarın ve papain çözeltisi ile değiştirin. Kit, dokuyu küçük parçalara ayırmayı önerse de, bu yaşta bunun gerekli olmadığını görüyoruz. Doku ve papain solüsyonunu 15 ila 20 dakika boyunca% 5 CO 2 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Dört ila sekiz serebella için 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha büyük bir sayı için yarım saate kadar kuluçkaya yatırın. Tüpü her üç ila dört dakikada bir hafifçe çalkalayın.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek steril bir P 1000 aerosol pipet ucunu FBS ile kaplayın. Şimdi karışımı tetik hızı. Hava kabarcığı oluşmasını önlemek için nazikçe pipetlediğinizden emin olun.

Pipet ile yaklaşık 10 yukarı ve aşağı hareket dokuyu ayırmak için yeterlidir. Çözüm bulanık olmalı. Süspansiyonun 30 ila 60 saniye oturmasına izin verin, böylece ilişkisiz bir dokunun herhangi bir büyük parçası tüpün dibine çöker.

Ateşle parlatılmış cam pipetler tatasyon için kullanılabilse de, serum kaplı steril P 1000 uçların da aynı şekilde çalıştığını görüyoruz. Daha sonra, süspanse edilmiş hücreleri serum kaplı bir pipet ucu kullanarak 15 millik yeni bir konik tüpe çıkarın, alttaki ilişkisiz doku parçalarını çıkarmamaya dikkat edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca yaklaşık 200 G'de santrifüjleyin.

Sıkma sırasında oda sıcaklığında, resus süspansiyon ortamını hazırlayın. Bunu yapmak için steril bir tüpe 2,7 mililitre EBSS ekleyin. Daha sonra sulandırılmış albümin OVO MOID inhibitör çözeltisinden 300 mikrolitre ekleyin.

Son olarak, 150 mikrolitre DNA çözeltisi ekleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı atın ve seyreltilmiş DNA albümin inhibitörü çözeltisinde hücre peletini hemen yeniden süspanse edin. Yine, peleti yeniden süspanse etmek için serum kaplı bir pipet ucu kullanın.

Şimdi süreksiz bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Bunu yapmak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe beş mililitre albümin oval MOID inhibitörü çözeltisi ekleyin. Hücreleri tüpün kenarı boyunca nazikçe ekleyerek hücre süspansiyonunu çözeltinin üzerine katmanlayın, ardından altı dakika boyunca yaklaşık 70 G'de santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, ayrışmış hücreler tüpün dibinde peletlenirken, zar parçaları arayüzde kalır. Granül hücrelerinde zenginleştirilmiş kültürler elde etmek isterseniz, daha fazla saflaştırmaya gerek yoktur. SUP natantını atın ve peleti hemen 50 mikrolitre DNA ile dört mililitre% 10 FBS ortamında yeniden süspanse edin.

Bu süspansiyonu, 70 mikronluk zayıf bir boyuta sahip naylon bir ağdan yerçekimi ile süzün. Bu adım, büyük nöronal olmayan hücreleri uzaklaştırır ve daha iyi bir tek hücre süspansiyonu sağlar. Ardından, aşağıdaki çağrı başına gradyan ayırma adımını atlayın ve hücre kaplama adımına geçin.

Veya granül hücrelerini glia ve büyük inter nöronlardan daha fazla saflaştırmak isterseniz, çağrı başına gradyana geçin. Adım, snat'ı atın ve hemen yeniden canlandırın. Peletleri 50 mikrolitre DNA ile iki mililitre HBSS glikozunda askıya alın.

Yine, süspansiyonu naylon bir ağdan süzün Perca gradyan ayrımına başlamadan önce, iki ateşle parlatılmış mera pipeti yapın. Pipetin ucunu, kenarı pürüzsüz olana ve pipet deliği orijinal boyutunun yaklaşık yarısı olana kadar nazikçe alevlendirin. Açıklığı çok küçük yapmamaya dikkat edin.

Şimdi çağrı başına gradyanı yapın. Çağrı çözeltisi başına 10 mil% 35'i 50 mil steril konik bir tüpe yerleştirin. Ardından, steril bir omurga iğnesi takılı 10 mil steril bir şırıngaya çağrı başına 10 mil% 60 yükleyin.

Şırınga ucunun tüpün dibine temas etmesine izin vererek, çağrı başına %60'lık çözeltiyi %35'lik çözeltinin altına nazikçe katmanlayın. İki katman arasında keskin bir arayüz tutmaya özen gösterin. Ardından, hücreleri degradenin en üstüne ekleyin.

Ateşle parlatılmış bir pipet kullanarak, arayüzü bozmadan hücreleri tüpün yan tarafına nazikçe ekleyin. Hücreleri katmanladıktan sonra, tüpü dikkatlice santrifüje yerleştirin. Yaklaşık 18 G'de santrifüjlemeye başlayın, hızı her 20 saniyede bir bir adım artırın, böylece 1800 G'ye ulaşmak yaklaşık iki dakika sürer, 1800 G'de 10 dakika sonra, hızı her 20 saniyede bir kademeli olarak bir adım azaltın.

Döndürme tamamlandığında, degradenin üst arayüzünü çıkarın ve atın. Bu arayüz büyük ggl bikini hücreleri ve inter nöronlar içerir. Ardından, arayüzdeki hücreleri dikkatlice çıkarmak için ateşle parlatılmış bir pipet kullanın.

Hücreleri 50 mil'lik bir tüpe aktarın. Hacim 15 milden büyükse, bunları iki adet 50 millik tüpe bölün ve üç hacim HB S'S glikozunda yeniden süspanse edin ve birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Daha sonra 1100 G'de beş dakika santrifüjleyin. Şimdi süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS ve 50 mikrolitre D ns reus içeren dört mil ortam ekleyin.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için ateşle parlatılmış bir pipet kullanarak peleti nazikçe askıya alın. Hücreler yeniden askıya alındıktan sonra, prepl ile devam edin. Hücreler, toplanan hücreleri poli de lizin kaplı bir tabak üzerinde 20 dakika boyunca bekletir.

37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir inkübatörde. Kuluçka sırasında, astroglia ve daha ağır hücreler yerleşecek ve bulaşıklara yapışacak, küçük granül nöronlar ve nöron progenitör hücreleri yüzer veya gevşek bir şekilde bağlı kalacaktır. 20 dakika sonra, gevşek bir şekilde yapışmış granül hücrelerini çıkarmak için tabağa hafifçe vurun.

Daha sonra hücre süspansiyonunu taze bir poli de lisin kaplı plakaya aktarın ve inkübasyonu tekrarlayın. Daha sonra, granül nöronları ve nöron progenitör hücrelerini 15 mil konik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Daha sonra peleti bir mil C serbest ortamda yeniden süspanse edin ve bir hemo sitometre kullanarak sayın.

Son olarak, orta yoğunlukta plakaya istenen hücre yoğunluğuna ulaşmak için serum içermeyen ortam ekleyin. Altı duvar plakası için. Dört duvar plakası için yaklaşık üç buçuk ila 4 milyon hücre kullanın.

650.000 hücre kullanın. Hücreleri %5 CO2 içeren 37 derecelik bir inkübatörde tutun. İlk kaplamadan 24 saat sonra ortamı tamamen değiştirin, daha sonra her iki ila üç günde bir değiştirin.

İşte sağlıklı granül nöron ve progenitör hücre kültürlerinin bazı görüntüleri. Kaplamadan 24 saat sonra ve kaplamadan altı gün sonra. Bu hücreler kültürde iki haftaya kadar tutulabilir.

Kaplamadan sonraki 24 saat içinde, sağlıklı hücrelerin kapak fişlerinin veya plastik kuyunun etrafına eşit olarak yayılacağını ve süreçleri yansıtacağını unutmayın. Hücre kümelenmesi ve hücre süreçlerinde varislerin varlığı, hücrelerin sağlıksız olduğunu veya poli de lisin substratının toksik olduğunu gösterir. Diyagramda görüldüğü gibi, granül nöron progenitörleri kaplama ve eksprese edici belirteçler üzerine farklılaşmaya başlar.

Farklılaşmalarının temsilcisi. Granül nöron progenitörlerinin proliferasyonunun, ortama sonik kirpi eklenerek önemli ölçüde uzatılabileceğini belirtin. Laminin, nörit büyümesini teşvik etmek için polilisine ek olarak bir substrat olarak da eklenebilir.

Granül hücre kültürünün bu özellikleri, granül nöronlarının biyolojisini veya nöronlara progenitör hücre farklılaşmasının düzenlenmesini incelemek için bir sistem sunar. Size az önce MAO, serebellar, büyük nöro, progenitörler ve nöronları nasıl izole edeceğinizi ve kültürleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, yaklaşık verimin 4 2 5 çarpı 10 olduğunu hatırlamak önemlidir.

Yavru başına altı hücreden ve kaplama yoğunlukları, santimetre kare başına beşinci hücrelerin merkezi arasında ve beş katı arasında değişebilir. Bu nedenle, periko gradyan adımı atlanırsa, doğum sonrası sekiz gün beş fare yavrusu, ellerimde altı dört kuyulu kültür plakası için yeterli hücre verebilir, periko gradyan adımının kullanılması hücrelerin verimini yaklaşık 2230% 5 azaltacaktır. Bununla birlikte, kültürlerdeki granül nöronlarının yüzdesi 90'dan 95 ila %99'a yükselir, bebek karyolası başına gradyan ayırma adımı olmadan elde edilen granül hücrelerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Gran Neuron progenitör proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesi. Bununla birlikte, kültürler birkaç günden fazla kullanılacaksa in vitro nöronal olmayan hücreleri çoğaltarak gran nöronların kontaminasyonunu azaltmak için bebek karyolası başına gradyan adımının dahil edilmesi önerilir.

Ayrıca, yanlış tamponlama daha fazla hücre ölümüne yol açtığından, bebek karyolası başına gradyan yapmak için kullanılan çözeltilerin taze olduğundan emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.