Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

Bu prosedür, P4 ile P5 aşamasındaki farelerden serebellumun çıkarılmasıyla başlar. Yeni doğmuş farelerin meningesleri ve koroid pleksusu, her bir serebellumdan tek tek uzaklaştırılır ve ardından bunlar 15 mililitrelik konik bir tüpte toplanır. Serebellumlar papain ile disosiye edilir ve nazik tritasyonla tek hücre süspansiyonuna getirilir.

Bu süspansiyon, 70 mikron gözenek boyutuna sahip bir naylon ağ filtreden yerçekimi yardımıyla süzülür. Süzülen sıvı, süreksiz bir perca gradyanının üzerine nazikçe eklenir ve granül hücreleri glia hücrelerinden, nöronlar ve Perkin geni nöronlarından ayırmak için santrifüjlenir. Gradyanın ara yüzeyindeki hücreler toplanır ve polidizine kaplı plaklara hazırlanır.

Glial hücreleri daha fazla uzaklaştırmak için, granül hücreler toplanır, sayılır ve istenilen yoğunluklarda polilizin kaplı cam lamellerine veya plastik kültür plaklarına ekilir. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Patoloji Bölümü'nden Dr. Lloyd Green'in laboratuvarından Hey Young Lee. Bugün size postnatal farelerden serebellar granül nöronların izole edilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda granül nöro progenitor proliferasyonu ve diferansiyasyonunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedür, serebellar granül hücrelerini dissosiye etmek için diseksiyon alanında %70 ethanol kullanımıyla başlar; dissosiyasyon için Papin dissosiyasyon sistemini kullanıyoruz.

Yeni bir kite başlarken, albumin OVO equate MOID inhibitör çözeltisini hazırlayın. Bunun için, kit içerisinde sağlanan 32 mililitre Earl dengeli tuz çözeltisini veya EBSS'yi alın ve albumin OVO moid karışımına ekleyin. İçeriklerin çözünmesi için diğer bileşenleri hazırlarken bunu kenara ayırın.

Ardından, disosiyasyon kitindeki bir papain tüpüne beş mililitre EBSS ekleyin. Her bir tüp, P5 farelerden alınan dört ila 15 serebellumu disosiye etmek için yeterlidir. Daha sonra papain tüpünü, papain tamamen çözülene ve solüsyon berrak görünene kadar, %5 CO₂ 37 °C inkübatörde beş ila 10 dakika bekletin.

Diseksiyon sırasında çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Ardından, kit içindeki 1D NAS flakonuna 500 µL EBSS ekleyin. Flakona hafifçe vurarak nazikçe karıştırın.

DNAS makaslama denatürasyonuna duyarlı olduğundan, mil başına 20 ünite ve %0,005 DNA nihai konsantrasyonu elde etmek için pepane flakonuna bu çözeltiden 250 µL ekleyin; kalan DNA dosyasını sonraki adımlarda kullanmak üzere saklayın. Gereçler ve reaktifler hazır olduğunda, bu prosedür için cerebellumların diseksiyonuna ve meningeslerin çıkarılmasına geçin. Doğum sonrası dördüncü ve altıncı günler arasındaki C 57 black six fareler kullanılır.

Bu yaş aralığı, dış granüler tabaka veya EGL granül hücre öncüllerinin sayısının maksimum düzeyde olması nedeniyle granül hücre kültürü için idealdir. Başlamak için, 60 milimetrelik plastik bir doku kültürü kabına 15 mililitre HBSS glikoz ve steril bir 15 mililitrelik konik tüpe 10 mililitre ekleyin. Tüpü buza yerleştirin, yavru fare kafasını %70 etanol ile silin. Kafayı çıkarmak için cerrahi makas kullanın.

Başı çekerle içeri aktarın ve kafatasının arkası net bir şekilde görünecek şekilde pensetle tutun. Beyne erişmek için mikro diseksiyon makasını foramen magnum'a yerleştirin ve ardından doğrudan gözlere doğru kesin. İnce dumont penset kullanın.

Beşinci adım, deriyi soymak ve beyni açığa çıkarmak için kafatasını kaldırmak üzere pens kullanılmasıdır. Ardından cerebellum ve çevresindeki midbrain koparılmalıdır. Bunu HBSS glukoz içeren kaba aktarın.

Serebellum hala çevredeki dokuya bağlıyken, serebellumu manipüle etmenin ve meningesleri çıkarmanın daha kolay olduğunu unutmayın. Ardından, dokuyu bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Sonrasında, serebellumu plakaya sabitlemek için bir set pens kullanın.

Serebellumu ve loblar arasını nazikçe soyarak meningesleri uzaklaştırmak için beş numara ince dumont pens kullanın. Serebellum yüzeyinde kan damarlarını fark edeceksiniz.

Bu kan damarları, meningesleri belirlemek için uygun bir yoldur. Cerebellum keçeleşmiş beyaz bir görünüm alana kadar meningesleri çıkarmaya devam edin. Ardından cerebellumu orta beynin geri kalanından ayırın.

Hayvanı ventral tarafı üzerine çevirin ve ventral cerebellum ile bitişik orta beyin arasında kırmızımsı bir şerit gibi görünen koroid pleksusu çıkarın. Cerebellum diseke edilir edilmez, buz üzerindeki 15 mililitrelik konik tüp içindeki soğuk HBSS glukoz çözeltisine yerleştirin. Üç beyni diseke ettikten sonra, diseksiyon çözeltisini taze HBSS glukoz ile değiştirin.

Serebellar diseksiyona daha fazla aşina oldukça, diseksiyon süresini yavru başına altı dakikayı geçmeyecek şekilde azaltmaya çalışın. Diseksiyonlar tamamlandığında, hücre süspansiyonu aşamasına geçin. Serebellar diseksiyonlardan hücre süspansiyonu oluşturma adımına gidin.

İlk olarak, tüpteki glukozlu HBSS'yi uzaklaştırın ve yerine papain çözeltisi ekleyin. Kit dokunun küçük parçalara ayrılmasını önerse de, bu yaşta bunun gerekli olmadığını gördük. Dokuyu ve papain çözeltisini %5CO 2 37 derece inkübatörde 15 ila 20 dakika bekletin.

Dört ila sekiz serebellum için 15 dakika inkübe edin. Daha fazla sayıda örnek için inkübasyon süresini yarım saate kadar uzatın. Tüpü her üç ila dört dakikada bir nazikçe çalkalayın.

İnkübasyon tamamlandığında, tation adımına başlayın ve steril bir P 1000 aerosol pipet ucunu, FBS ile iki kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak kaplayın. Şimdi karışımı tetikleme hızına getirin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için nazikçe pipetlediğinizden emin olun.

Dokuyu ayrıştırmak için pipetle yaklaşık 10 kez yukarı aşağı hareket yapmak yeterlidir. Çözelti bulanıklaşmalıdır. Ayrışmamış büyük doku parçalarının tüpün dibine çökmesi için süspansiyonun 30 ila 60 saniye bekletilmesine izin verin.

Tritürasyon için ateşle cilalanmış cam pipetler kullanılabilse de, serum kaplı steril P 1000 uçlarının da aynı derecede etkili olduğunu gördük. Ardından, serum kaplı bir pipet ucu kullanarak süspansiyon halindeki hücreleri taze bir 15 ml konik tüpe aktarın; bu aşamada dipte kalan ilişkisiz doku parçalarını almamaya dikkat edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu yaklaşık 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj sırasında, oda sıcaklığında resüsponsiyon süspansiyon ortamını hazırlayın. Bunun için, steril bir tüpe 2,7 mililitre EBSS ekleyin. Ardından, yeniden konstitüe edilmiş albumin OVO MOID inhibitör çözeltisinden 300 mikrolitre ekleyin.

Son olarak, 150 µL DNA çözeltisi ekleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini hemen seyreltilmiş DNA albumin inhibitör çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Peleti yeniden süspande etmek için yine serum kaplı bir pipet ucu kullanın.

Şimdi süreksiz bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Bunun için, 15 mililitrelik konik bir tüpe beş mililitre albümin oval MOID inhibitör çözeltisi ekleyin. Hücre süspansiyonunu, hücreleri tüpün kenarından nazikçe ekleyerek çözeltinin üzerine katmanlar halinde yerleştirin, ardından yaklaşık 70 G'de altı dakika boyunca santrifüj edin.

Oda sıcaklığında, ayrışmış hücreler tüpün dibinde çökecek, membran fragmanları ise ara yüzeyde kalacaktır. Granül hücreleri açısından zenginleştirilmiş kültürler elde etmek istiyorsanız, daha fazla saflaştırmaya gerek yoktur. SUP süpernatantı atın ve peleti derhal 50 µL DNAs içeren 4 mL %10 FBS ortamı içerisinde yeniden süspande edin.

Bu süspansiyonu, 70 mikron gözenek boyutuna sahip bir naylon süzgeçten yer çekimi yardımıyla süzün. Bu adım, büyük nöron dışı hücreleri uzaklaştırır ve daha iyi bir tek hücre süspansiyonu sağlar. Ardından, sonraki Percoll gradyan ayırma adımını atlayın ve hücre ekim adımına geçin.

Veya granül hücrelerini glia ve büyük internöronlardan daha fazla saflaştırmak isterseniz, percoll gradyan adımına geçiniz. Süpernatantı atınız ve pelletlemi hemen iki mililitre glukozlu HBSS içinde 50 microliters DNase ile resüspandeyiniz.

Süspansiyonu tekrar bir naylon süzgeçten filtreleyin. Percoll gradyan ayırımına başlamadan önce, ateşle uçları düzeltilmiş iki adet Pasture pipeti hazırlayın. Pipetin ucunu, kenarlar pürüzsüzleşene ve pipet ağzı orijinal boyutunun yaklaşık yarısına inene kadar nazikçe alevle ısıtın. Açıklığı çok küçük yapmamaya dikkat edin.

Şimdi per call gradyanını hazırlayın. 50 ml'lik steril konik tüpe 10 ml %35'lik per call çözeltisi koyun. Ardından, steril spinal iğne takılı 10 ml'lik steril bir şırıngaya 10 ml %60'lık per call doldurun.

Şırınga ucunu tüpün dibine değdirerek, %60'lık çözeltiyi %35'lik çözeltinin altına yavaşça katmanlar halinde ekleyin. İki katman arasında net bir ara yüz oluşmasına dikkat edin. Ardından, hücreleri gradyanın üst kısmına ekleyin.

Ateşle parlatılmış bir pipet kullanarak, ara yüzü bozmadan hücreleri tüpün kenarından boyunca nazikçe ekleyin. Hücreleri tabakalama işleminin ardından tüpü dikkatlice santrifüje yerleştirin. Santrifüjleme işlemini yaklaşık 18 G hızında başlatın. Hızı her 20 saniyede bir kademe artırarak 1800 G hızına ulaşmanın yaklaşık iki dakika sürmesini sağlayın. 1800 G'de 10 dakika geçtikten sonra, hızı her 20 saniyede bir kademe azaltarak kademeli olarak düşürün.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, gradyanın üst arayüzünü kaldırın ve atın. Bu arayüz büyük ggl bikini hücrelerini ve inter nöronları içerir. Ardından, arayüzdeki hücreleri dikkatlice almak için ateşle cilalanmış bir pipet kullanın.

Hücreleri 50 ml'lik bir tüpe aktarın. Hacim 15 ml'den fazla ise, hücreleri iki adet 50 ml'lik tüpe bölün, üç hacim HB S'S glikoz içinde yeniden süspande edin ve birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Ardından 1100 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi süpernatanı uzaklaştırın ve 10% FBS ile 50 µL D ns reus içeren dört ml besiyeri ekleyin.

Tek hücre süspansiyonu oluşturmak için peleti alevle cilalanmış bir pipet kullanarak nazikçe süspande edin. Hücreler yeniden süspande edildikten sonra prepl işlemine geçin. Hücreler, poli-D-lizini kaplı bir kap üzerinde 20 dakika boyunca prelate edilir.

37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde. İnkübasyon sırasında, astroglia ve daha ağır hücreler çökecek ve kaplara yapışacak; küçük granül nöronlar ve nöron öncül hücreleri ise yüzer durumda kalacak veya gevşekçe yapışacaktır. 20 dakika sonra, gevşekçe yapışmış granül hücrelerini yerinden ayırmak için kaba hafifçe vurun.

Ardından hücre süspansiyonunu taze polilisin kaplı bir plakaya aktarın ve inkübasyonu tekrarlayın. Daha sonra, granül nöronları ve nöron progenitör hücrelerini 15 ml'lik konik bir tüpe toplayın ve 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından peleti 1 ml C içermeyen ortamda yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak sayım yapın.

Son olarak, orta yoğunlukta ekim yapmak için istenen hücre yoğunluğuna ulaşmak amacıyla serumsuz besiyeri ekleyin. Altı kuyruklu plakalar için. Dört kuyruklu plakalar için yaklaşık 3,5 ila 4 milyon hücre kullanın.

650, 000 hücre kullanın. Hücreleri %5CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde tutun. İlk ekimden 24 saat sonra besiyerini tamamen değiştirin, ardından sonraki her iki ila üç günde bir değişime devam edin.

İşte sağlıklı granül nöron ve progenitör hücre kültürlerine ait bazı görüntüler. Ekimden 24 saat sonra ve ekimden altı gün sonra. Bu hücreler kültürde iki haftaya kadar tutulabilir.

Ekme işleminden sonraki 24 saat içinde, sağlıklı hücrelerin lamellerin veya plastik kuyucuğun etrafına eşit şekilde yayılacağı ve uzantılar oluşturacağı unutulmamalıdır. Hücrelerin kümeleşmesi ve hücre uzantıları üzerinde varisitelerin oluşması, hücrelerin sağlıksız olduğunu veya poli-lisin substratının toksik olduğunu gösterir. Diyagramda görüldüğü üzere, granüler nöron öncül hücreleri ekimle birlikte farklılaşmaya başlar ve belirteçleri eksprese eder.

Diferansiyasyonlarının temsili. Granül nöron progenitörlerinin proliferasyonunun, medyuma sonic hedgehog ekleyerek önemli ölçüde uzatılabileceğini belirtiniz. Nörit çıkışını teşvik etmek için polilizinle birlikte bir substrat olarak laminin de eklenebilir.

Granül hücre kültürünün bu özellikleri, ya granül nöronların biyolojisinin ya da progenitör hücrelerin nöronlara farklılaşmasının düzenlenmesinin incelenmesi için bir sistem sunar. Size MAO serebellar granül nöro progenitörlerinin ve nöronlarının nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, yaklaşık verimin 4-5 × 10⁵ olduğunu hatırlamak önemlidir.

Yavru başına altı hücre elde edilir ve ekim yoğunlukları santimetrekare başına beş hücrenin beş katı arasında değişebilir. Bu nedenle, Percoll gradyan adımı atlanırsa, beş günlük sekiz post-natal fare yavrusu altı adet dört kuyuklu kültür plakası için yeterli hücre sağlayabilir. Benim deneyimlerime göre, Percoll gradyan adımının kullanılması hücre verimini yaklaşık %22-30 oranında azaltacaktır. Bununla birlikte, kültürlerdeki granül nöronların yüzdesi %90-95'ten %99'a yükselir. Percoll gradyan ayırma adımı olmadan elde edilen zenginleştirilmiş granül hücreler, granül nöron progenitör proliferasyonu ve diferansiyasyonunun düzenlenmesini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, kültürlerin in vitro ortamda birkaç günden fazla kullanılması gerekiyorsa, granül nöronların prolifere olan nöronal olmayan hücreler tarafından kontamine edilmesini azaltmak için Percoll gradyan adımının dahil edilmesi önerilir.

Ayrıca, per kol gradientini hazırlamak için kullanılan çözeltilerin taze olduğundan emin olun; çünkü yetersiz tamponlama daha fazla hücre ölümüne yol açar. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.