Name: Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin, fare kemik iliğinden primer hematopoietik hücre izolasyonu ve elektroporasyon ile transfeksiyon yöntemlerini. Bu protokol mast hücreleri ve bazofiller için gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Femur ve süresince tibialar itibaren Kemik İliği Hasat <ol><li> 12-haftalık fare (BALB / c farelerde kullanarak ancak herhangi bir fare suşu ile bu işlemi yapabilirsiniz) - 6 femur ve süresince tibialar kemik iliği hasat prosedürün ilk adımı. Başlamak için, CO 2 inhalasyon (gösterilmeyecektir) fare euthanize. Hasat femur ve her birinin arka ayakları süresince tibialar. Sonra, bir tıraş bıçağı ile, kalça ve diz eklemleri kaldırmak için her iki ucunda femur kesmek ve kemik iliği maruz. </li><li> Benzer bir şekilde, diz ve ayak bileği komşu bölgeleri kaldırmak ve süresince tibialar iliği açığa çıkarmak için her iki ucundaki kesti. </li><li> 26-gauge iğne ile 3 ml şırınga alın ve RPMI takviye ile% 10 FBS, penisilin, streptomisin ve beta-mercaptoethanol (BME = 100 um) ile doldurun. Cımbız kullanarak, kemik RPMI medya içeren Petri üzerinde tutun. Şırınga iğnesi kemiğin bir ucunu takın ve kemik iliği dışarı atılması için piston bastırın. Şırınga iğnesi artık iliği dışarı floş kemik içinde yukarı ve aşağı hareket ettirilebilir. </li><li> Tüm kemikler için prosedürü tekrarlayın ve sonra kültürler kurulması ile devam. </li></ol> Kültürler kurulması <ol><li> Kemik iliği kültürleri kurmak için, bir hücre süspansiyonu doku kırmak için birkaç kez aşağı kızarmış kemik iliği pipet ve. </li><li> 50 ml konik tüpün üstüne bir 70 mikron filtre koyun ve hücre süspansiyonu filtre ekleyin. </li><li> Petri kabı RPMI ile bir kez yıkayın, sonra 70 mikron filtre durulama ekleyin. </li><li> 1 ml şırınga pistonu kauçuk ucunu kullanarak, 70 mikron filtre üstünde kalan kemik iliği adet eziyet. </li><li> RPMI ile filtre bir kez yıkayın. </li><li> Filtre yıkadıktan sonra, hücre süspansiyonu için 1200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> PBS içinde resuspending hücre pelletini yıkayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin. Biz genellikle bir fare kemikleri (iki femurları artı iki süresince tibialar) ~ 90 milyon hücre edinin. Hücrelerinin sayımı sonra, onları tekrar 1200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> RPMI ve kısım son konsantrasyon ml başına 1 milyon hücre olduğunu yeterince RPMI içeren doku kültürü şişeleri içine küçük bir miktar hücrelerin tekrar </li><li> Ilgi hücre tipi kalkınmayı teşvik etmek sitokinler ekleyin. Bu durumda, sitokin interlökin-3 (IL-3 = 10 ng / ml), bazofil ve mast hücrelerinin gelişimini teşvik etmek eklenir. Bazofiller edinmek için, 10 gün boyunca kuluçkaya yatmaktadır. Mast hücreleri için, 5 hafta boyunca kuluçkaya yatmaktadır. Mast hücreleri oluştururken, medya ve IL-3 haftada bir kez değişmiş olmalıdır. </li><li> Burada mast hücreleri sadece kaplama sonra nasıl görünmelidir bir bakış. Bu görüntü, bazofil ve mast hücreleri interlökin-3 ilave edildikten sonra 10 gün mast iliği hücreleri farklılaşma göstermektedir. </li><li> İstenen hücre tipi bir kere elde edildiğinde, elektroporasyon adım ile devam edin. </li></ol> Electroporating Hücreler <ol><li> Elektroporasyon adım başlamak için, kültür şişelerinde hücrelerinin sayısını belirlemek. </li><li> Hücreler genellikle mL başına 10 milyon bir yoğunluk electroporated, bu yüzden konik tüpler için gerekli hücre sayısı transfer tüpler ve 1200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> Santrifüj sonra, medya aspirat, 1X PBS ile hücreleri yıkayın ve tekrar 1200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> PBS aspire ml başına 10 milyon hücre hücre süspansiyonu yapmak için Bio-Rad Gene Verici elektroporasyon tampon ekleyin. </li><li> Hücrelerin resuspending sonra, son bir konsantrasyonda ml başına 10 ila 20 mikrogram istenen plazmid DNA ekleyin. </li><li> 96-iyi elektroporasyon plaka üzerinde seçtiğiniz kuyu içine hücre süspansiyonu kısım 150 mikrolitre. </li><li> MXcell plaka odasında elektroporasyon plaka koyun ve kapağını kapatın. </li><li> Mast hücrelerinin transfeksiyon önce bir ön ayar veya saklanan bir protokol kullanarak sürece, elektroporasyon protokol MXcell içine programlanmış olmalıdır. Optimizasyonu deneyler sayesinde mast hücrelerinin yüksek transfeksiyon verimliliği kare dalga darbe protokolleri kullanarak ortaya keşfettiler. Biz 2000uF ve 1000 ohm 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms ve 350V/10ms kare dalga darbeleri teslim plaka üzerinde elektroporasyon koşulları değişecektir. Protokol ve cihaz üzerine yüklendikten sonra, hücrelerin electroporate &quot;Darbe&quot; tuşuna basın. </li><li> Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, bir doku kültürü plakası hücrelere aktarın. Biz genellikle interlökin-3 ml başına 10 nanogram 300 mikrolitre RPMI (% 10 FCS, penisilin, streptomisin ve beta-mercaptoethanol ile desteklenmiş) içeren bir 48-iyi doku kültürü plakası sıra her 150 mikrolitrelik elektroporasyon örnek aktarın. Hücreler 37 gece inkübe ° C, daha sonra ifade ve bastırılması için 24 saat sonra çalışılmalıdır. </li></ol> Transfection Sonuçlar Plazmid ml GFP başına 20 mikrogram kullanarak başarılı elektroporasyon sonra hücreler florasan mikroskobu görüntüsü, video gösterilir. Yaklaşık% 30 MXcell elektroporasyon sistem transfeksiyon verimliliği kullanılarak elde edilebilir. Sistem, hücre canlılığını korurken, transfeksiyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için şartlarda değişiklik sağlar.

Daha genomik bilgi ortaya çıkıyor ve böyle bir siRNA olarak yeni araçlar geliştirilmiştir, fizyolojik ilgili hücrelerin kullanımı, hastalık yolları, protein-protein etkileşimleri, ve sinyal iletimi anlayışımızı ilerletmek için her zamankinden daha önemli hale gelmiştir. İlköğretim hücreleri, dokuları veya sıvıları doğrudan elde edilen ve in vitro olarak yetiştirilmektedir. Bu hücreler, genetik materyalin eksojen tanıtım yoluyla yolları da dahil, bir dizi manipüle edilebilir. Bu plazmid DNA veya birincil hücre içine siRNA tanıtmak için en etkili yolu elektroporasyon olduğunu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Elektroporasyon geçici böylece ekzojen nükleik asitlerin hücre girmesine izin verir, hücre zarının geçirgenliğini artırmak amacıyla elektrik darbeleri hücreleri ortaya koyar. Transfeksiyon Bu yöntem, farklı hücre türleri / hatları ve, böylece mast hücrelerinin transfect kullanılabilir yanı sıra, diğer kemik iliği kaynaklı hücre arasındaki farklılıkların karşılamak için optimize edilebilir. Ayrıca, viral aracılı transfeksiyon aksine, elektroporasyon transfekte DNA boyutu sınırlar empoze, ne de kapsamlı bir hazırlık gerektirir değildir. Elektroporasyon lipid aracılı transfeksiyon aksine, daha az toksik olabilir ve transfekte nükleik asit endosomal yakalama sonuç vermez. Bio-Rad, bu hücrelerin MXcell elektroporasyon sistemi için özel olarak geliştirilmiştir. MXcell transfeksiyon verimliliği ve hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için şartlarda değişiklik sağlar. Transfeksiyon verimliliği optimize etmek ve hücre ölümü, voltaj elektroporasyon parametreleri de dahil olmak üzere bir çok en aza indirmek için, kondansatör, direnç ve nabız uzunluğu ayarlanabilir ve değerlendirilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell Elektroporasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Elektroporasyon Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

hazırlık elektroporasyon murin kemik İliği itibaren İlköğretim hematopoetik hücre kültürleri

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elektroporasyon birincil hücre içine plazmid DNA veya siRNA tanıtmak için en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve Gen Verici elektroporasyon tampon, özellikle memeli hücrelerinde ve birincil ve kök cells.This video gibi zor-transfect hücreleri, nükleik asitlerin transfect geliştirilmiştir birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri nasıl kurulacağını gösteren ve sonra MXcell sistemi elektroporasyon için hazırlamak. Biz femur ve tibia izole ederek başlar. Femur ve tibia hem de kemik iliği biçilir ve kültürler kurulur. Kültüre kemik iliği hücreleri daha sonra transfekte ve analiz edilir.

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Plazmid DNA veya siRNA'nın primer hücrelere aktarılmasında elektroporasyonun en etkili yöntem olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Pulser...

Bu prosedür, fare femur ve tibia kemiklerinin hasat edilmesiyle başlar. Kalça, diz ve ayak bileği eklemleri çıkarıldıktan sonra, kemiğin açık ucuna RPMI medyumu enjekte edilerek ilik izole edilir. Tek hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, kemik iliği hücreleri mast hücrelerine farklılaştırılır, 96 kuyucuklu elektroporasyon plakalarına yüklenir ve ardından transfekte edilir.Gene Pulse veya MX Cell elektroporasyon sistemi kullanılarak, kare dalga puls protokolleri ile yaklaşık %30 oranında transfeksiyon verimliliği elde edilebilir. Prosedürün ilk adımı, 6 ila 12 haftalık bir farenin femur ve tibia kemiklerinden kemik iliğinin toplanmasıdır.Başlamak için fareyi CO2 inhalasyonu ile ötanize edin, her farenin arka bacaklarından femur ve tibia örneği toplayın. Ardından jiletle, kalça ve diz eklemlerini çıkarmak ve iliği benzer şekilde açığa çıkarmak için femur'un her iki ucunu kesin. Diz ve ayak bileği bitişik bölgelerini çıkarmak ve iliği açığa çıkarmak için tibia örneğinin her iki ucunu kesin.Ardından, 26,5 gauge iğneye sahip bir şırınga alın ve %10 FBS, penisilin, streptomisin, beamer, capita etanol ve L-glutamin ile desteklenmiş RPMI çekin. Cımbız kullanarak kemiği, içinde RPMI medyumu bulunan bir Petri kabının üzerinde tutun. Şırınga iğnesini kemiğin bir ucundan içeri yerleştirin ve kemik iliğini dışarı boşaltmak için pistonu bastırın.Şırınga iğnesi, kalıntı iliği dışarı atmak için kemiğin içinde yukarı ve aşağı hareket ettirilebilir. İşlemi tüm kemikler için tekrarlayın ve ardından kültürlerin oluşturulmasına geçin. Kemik iliği kültürlerini oluşturmak için, dokuyu bir hücre süspansiyonuna dönüştürmek amacıyla yıkanmış kemik iliğini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.Ardından, 50 milliliter konik tüpün üzerine 70 mikron filtre yerleştirin ve hücre süspansiyonunu filtreye ekleyin. Sonra, Petri kabını bir kez RPMI ile durulayın. Daha sonra durulama sıvısını 70 mikron filtreye ekleyin ve bir milliliter şırınga pistonunun kauçuk ucunu kullanarak 70 mikron filtrenin üzerinde kalan kemik iliği parçalarını ezin.Filtreyi yıkadıktan sonra, filtreyi bir kez RPMI ile yıkayın. Hücre süspansiyonunu 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini PBS içinde yeniden süspanse ederek yıkayın.Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Genellikle bir farenin kemiklerinden (iki femur ve iki tibia) yaklaşık 90 milyon hücre elde ederiz. Hücreleri saydıktan sonra, 1200 RPM hızında beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Hücreleri az miktarda RPMI içinde tekrar süspande edin ve final konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde yeterli miktarda RPMI içeren doku kültürü flasklarına paylaştırın. Ardından, ilgilendiğiniz hücre tipinin gelişimini desteklemek için sitokinler ekleyin. Bu durumda, bazofillerin ve mast hücrelerinin gelişimini teşvik etmek için sitokin interleukin three eklenir; bazofil elde etmek için 10 gün, mast hücreleri üretirken ise beş hafta inkübe edin.Besiyeri ve IL three haftada bir kez değiştirilmelidir. Kemik iliği hücrelerinin ekimden hemen sonra nasıl görünmesi gerektiği burada gösterilmiştir. Bu görüntü, interleukin three eklenmesinden 10 gün sonra kemik iliği hücrelerinin bazofillere ve mast hücrelerine farklılaşmasını göstermektedir.İstenen hücre tipi elde edildikten sonra elektroporasyon adımına geçiniz. Elektroporasyon adımına başlamak için kültürdeki hücre sayısını belirleyiniz. Flask hücreleri genellikle mililitre başına 10 milyon yoğunlukta elektropore edilir.Gerekli hücre sayısını konik tüplere aktarın ve tüpleri 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra medyumu aspire edin, hücreleri bir kez XPBS ile yıkayın ve tekrar 1200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından PBS'i aspire edin ve mililitre başına 10 milyon hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlamak için BioRad gene pulsar elektroporasyon tamponu ekleyin.Hücreleri yeniden süspanse ettikten sonra, mililitre başına 10 ila 20 mikrogram nihai konsantrasyonda istenen plazmid DNA'yı ekleyin. Hücre solüsyonunu nazikçe karıştırın ve 96 kuyucuklu bir elektroporasyon plakası üzerindeki seçtiğiniz kuyucuklara 150 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın. Ardından, kemik iliği hücrelerinin transfeksiyonu ve elektroporasyonu öncesinde, elektroporasyon plakasını MXL plaka haznesine yerleştirin ve kapağı kapatın.Önceden belirlenmiş bir protokol veya optimizasyon deneyleri aracılığıyla kaydedilmiş bir protokol kullanılmadığı sürece, protokol MXL'ye programlanmalıdır; kemik iliği hücrelerinin en yüksek transfeksiyon verimliliğinin kare dalga puls protokolleri kullanılarak elde edildiğini keşfettik. Bin ohm dirençte 2000 micro phs'de kare dalga pulslar iletmek için plaka üzerindeki elektroporasyon koşullarını değiştireceğiz. Protokol ayarlanıp cihaza yüklendikten sonra, hücreleri pulse etmek için pulse düğmesine basın; elektroporasyon tamamlandıktan sonra hücreleri bir doku kültürü plakasına aktarın.Genellikle her 150 µL elektroporasyon örneğini, 10 ng/mL İnterlökin 3 içeren 300 µL RPMI bulunan 48 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki kuyucuğa aktarırız. Hücreler 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir, ardından 24 saat sonra ekspresyon ve supresyon açısından analiz edilir. Bu, hücrelerin floresan mikroskopi görüntüsüdür.MX hücre elektroporasyon sistemi kullanılarak, mililitre başına 20 mikrogram GFP plazmidi ile başarılı bir elektroporasyon gerçekleştirdikten sonra yaklaşık %30'luk transfeksiyon verimlilikleri elde edilebilir. Sistem, hücre canlılığını korurken transfeksiyon verimliliğinizi maksimize etmek için koşulları değiştirmenize olanak tanır. MX hücre sistemi, özellikle bu fare hematopoetik hücreleri gibi primer memeli hücreleri için oldukça kullanışlıdır.Farelerden kemik iliği hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve MX hücre elektroporasyon sistemi kullanılarak diferansiye mast hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini göstermiş olduk. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu prosedür, Gen Verici MXcell elektroporasyon sistemi hızlı ve kolay bir fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) veya diğer birincil hücreler için en iyi elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. Sorun giderme için dikkat edilmesi gereken noktalar da ilgili video tartışılmıştır.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Burada, ex vivo polivinil alkol bazlı genişleme kullanarak fare hematopoetik kök hücre kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve analiz etmek için bir protokol ve ayrıca lentiviral transdüksiyon ve elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme yöntemleri sunulmaktadır.

Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Öğrenin, fare kemik iliğinden primer hematopoietik hücre izolasyonu ve elektroporasyon ile transfeksiyon yöntemlerini. Bu protokol mast hücreleri ve bazofiller için gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verim sağlar.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Daha fazla video keşfet