Name: Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Découvrez la mesure de la dynamique calcique globale et proche membrane dans les astrocytes en culture utilisant la microscopie à fluorescence et en réflexion totale interne. Cette méthode permet d'étudier simultanément les signaux calciques dans les cellules gliales.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Uehara Memorial du Japon (ES) ainsi que la Fondation de Whitehall, l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies et un prix de Stein-Oppenheimer de dotation (au BSK).

Procédures expérimentales La procédure expérimentale se compose de deux parties principales qui sont décrits d&#39;une façon par étapes ci-dessous. Partie 1: PRÉPARATION DES CULTURES hippocampique astrocyte Brièvement, mélangé hippocampique astrocyte-neurone cultures ont été préparés en utilisant un protocole bien établi 1,2,3. Nous avons optimisé la procédure de céder saine astrocytes mis en culture. Toutes les procédures énumérées ci-dessous doit être effectuée dans un environnement stérile, comme une hotte à flux laminaire. Préparation des lamelles <ul><li> 22 lamelles mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poly-D-Lysine (PDL, Sigma P0899), des aliquotes (1 mg / ml) </li><li> La laminine aliquotes (20 pg / ml): ajouter 49 ml d&#39;eau stérile à 1 mg / ml solution laminine (Sigma L2020), faire 1,2 aliquotes ml et conserver à -20 ° C </li></ul><ol><li> Dissoudre PDL dans l&#39;eau stérile (50 pg / ml) </li><li> Autoclaver les lamelles, rincez à l&#39;eau stérile et le placer dans PDL (20 ml pour 100 lamelles). Laisser à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Remplacer PDL à l&#39;eau stérile (3 lavages extensifs). Puis sécher les lamelles et conserver à 4 ° C. </li><li> Le jour avant l&#39;étalement des lamelles les astrocytes place individuelle dans un puits stérile sur une plaque à 6 puits (Multiwell fond plat Plaques avec couvercles, stériles de BD Bioscience). Mettez 400 pi de la laminine sur chaque lamelle et incuber pendant la nuit, dans l&#39;incubateur pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol> Dissection Dissection des médias: <ul><li> 500 ml de Earle solution saline équilibrée (EBSS) (1X), liquide (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ml solution HEPES (Sigma, H0887) </li></ul> Les médias hippocampe: <ul><li> 412,5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) (1X), liquide contient des sels de Earle, mais pas de rouge de L-glutamine ou du phénol (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml de glucose (Sigma, D-(+)-glucose anhydre SIGMA ULTRA G7528) 1 M dans du MEM </li><li> 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml de solution de pyruvate de sodium (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml d&#39;HEPES solution 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml de N-2 Supplément (100X), liquide (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml de sérum de cheval, inactivé par la chaleur (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Solution de papaïne: <ul><li> Ajouter 5 ml de milieu de dissection dans Worthington PAPAÏNE-022 flacon (LK003178; concentration finale de 20 U / ml) et incuber à 37 ° C pendant 60 min. </li></ul><ol><li> Décapitez ratons âgés de P1 (généralement 2 chiots) suivant les lignes directrices révisées et approuvées par les réglementations nationales et de vos soins locaux des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation. </li><li> Enlever la peau et le crâne et le cerveau dans une boîte de Pétri remplie avec les médias de dissection froide. </li><li> Suppression des méninges, disséquer les deux hémisphères et disséquer hippocampes. </li><li> Hacher les hippocampes dans ~ 1X1 pièces mm et digérer en solution papaïne à 37 ° C pendant min 11-13. </li><li> Une fois les morceaux de tissu sont installés, retirez soigneusement la papaïne et ajouter 5 ml de milieu de l&#39;hippocampe pour éliminer toute trace de l&#39;enzyme. Répétez cette étape et remettre dans le milieu de l&#39;hippocampe (2 ml). </li><li> Triturer les cellules ~ 5 fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes gauche, avec trois flammes poli pipettes de trous progressivement plus petits (1000 um, ~ ~ 500 um et 300 um). </li><li> Une fois trituré, passer les cellules à travers une passoire de cellules (taille des pores, 70 um, BD Biosciences). Compter les cellules dans 10 pl de suspension. Réglez le volume du milieu de l&#39;hippocampe dans le but d&#39;avoir 400 000 cellules / ml. </li><li> Aspirer le laminine hors les lamelles, et avant le couvre peut sécher, la plaque 200 pl de la suspension cellulaire par lamelle. </li><li> Laissez-les à joindre pendant 60 min dans l&#39;incubateur, puis ajouter 2 ml de milieu de l&#39;hippocampe par puits. </li><li> Le lendemain, aspirer ancienne moyennes hippocampe pour enlever les cellules mortes et les débris et ajouter 2 ml de pré-chauffé moyennes hippocampique frais. </li></ol> Entretien Les médias Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml de sérum B27 supplément gratuit (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml de L-glutamine (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Nourrissez les cultures astrocytes neurone deux fois par semaine avec milieu neurobasal, à commencer quatre jours après placage. Préincuber les médias à environ 30 minutes dans l&#39;incubateur dans un flacon aéré pour équilibrer la température et le CO 2. Partie 2: imagerie calcique Mémoire tampon d&#39;enregistrement hippocampe: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (Tous les produits chimiques de Sigma) pH 7,4 (ajusté avec NaOH). Chargement colorant indicateur de calcium dans les astrocytes <ol><li> Placer la culture dans un puits sur une plaque à 6 puits remplis avec 2 ml de tampon d&#39;enregistrement hippocampe contenant 2,5 uM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) et 0,05% Pluronic ® solution F-127 de 20% dans le DMSO (Invitrogen, P-3000MP) et incuber à température ambiante pendant 10-30 min. </li><li> Retirer Fluo-4 solution et laver lamelles 3 fois avec un tampon d&#39;enregistrement de l&#39;hippocampe et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Placer la lamelle sur la chambre, propre et de l&#39;autre côté de la lamelle avec un liquide de nettoyage pour lentilles. </li><li> Mettez une petite goutte d&#39;huile d&#39;immersion (DF type à immersion d&#39;huile à partir Cargille) sur l&#39;objectif et de mettre la chambre (chambre ouverte pour 25 mm rond lamelle de Warner Instruments) sur la platine du microscope (Olympus IX71). </li><li> Regardez les cellules en utilisant la lumière de transmission de voir comment les cellules regard, et les amener au point. Puis éclairent les cellules avec 488 nm à partir d&#39;un monochromateur (V polychrome de Till Vision) et de déterminer si le signal de fluorescence du fluo-4 est uniforme et détectable dans les astrocytes. </li><li> Utilisez le PEV et l&#39;éclairage TIRF pour mesurer le calcium dans les astrocytes. </li></ol> Microscopie TIRF En bref, nous utilisons un microscope Olympus IX71 équipé d&#39;une caméra Andor IXON DV887DCS EMCCD. Le contrôle de l&#39;excitation et l&#39;acquisition des images est réalisé en utilisant le logiciel TILLVision. Les poutres de 454/488/515 nm Argon (100 mW) et 442 nm état solide (45 MW) lasers sont combinés et contrôlée avec un laser TILL Polyligne combineur, condenseur à double port et de la FRBR acoustoptical filtre accordable et le contrôleur (AOTF; tous de TILL Photonics) et nourris dans une fibre à large bande pour l&#39;entrée en Kineflex le condenseur FRBR. Nous utilisons un Olympus 60X 1,45 NA pour atteindre l&#39;objectif FRBR. Le gain de la caméra est ajusté pour chaque astrocyte pour fournir le meilleur rapport signal sur bruit des images. Le contexte et les principes de microscopie TIRF ont été récemment revu 4, 5. La plupart des composants optiques que nous utilisons ont été achetés auprès TILL Photonics, qui fait maintenant partie de Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondeur de pénétration TIR peut être calculé à partir des équations ci-dessous. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Équation" /> d = profondeur de pénétration Indice de réfraction n1 = de verre n2 = indice de réfraction de la cellule a = angle d&#39;incidence NAi = ouverture numérique de l&#39;incidence Afin d&#39;assurer le laser est aligné de façon optimale pour la FRBR, nous trouvons qu&#39;il est utile d&#39;observer 100 nm bille fluorescente (Invitrogen, F8803). Nous présentons des images fixes et des vidéos de perles avec le PEV et la microscopie TIRF. Lorsque dans les FRBR, on observe une augmentation spectaculaire de signal-bruit et les perles d&#39;affichage diffusion brownienne. Nous estimons qu&#39;il est utile d&#39;observer le comportement de 100 nm avec des perles microscopie TIRF sur une base régulière (~ une fois par semaine) pour être sûr que la FRBR optimale se produit, plutôt que de l&#39;éclairage oblique, compromis qui se produirait si l&#39;angle critique ne sont pas égaux à α (voir fig 1). Application de la protéine G agonistes des récepteurs couplés Les astrocytes expriment une variété de GQ récepteurs couplés aux 6, 7, y compris les récepteurs de glutamate métabotropique et des récepteurs P2Y (agoniste, ATP, ADP). L&#39;activation de ces récepteurs conduit à une augmentation significative du taux de calcium intracellulaire dans les astrocytes. Par exemple, on peut facilement observer des élévations de calcium intracellulaire pendant l&#39;application de l&#39;ATP (30 uM) à 8-10 astrocytes. Nous utilisons une solution rapide de commutation de Warner Instruments appelé le Système VC-77SP perfusion rapide Étape (http://www.warneronline.com/index.cfm). Avec cette méthode peut être des solutions appliquées en moins de ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figure 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> Cartoon FIGURE 1. Et des photographies de l&#39;imagerie mis en place. A. montre une photographie du microscope monté sur une airtable, alors que (B) montre une photographie de l&#39;assemblage laser, les contrôleurs et les boîtes de faisceau. C montre une photo de la platine du microscope à la chambre de montée pour l&#39;imagerie. Sur la gauche du dispositif de perfusion rapide peut être vu (avec le moteur pas à pas et tubes thêta). Sur la droite du headstage d&#39;un amplificateur Axopatch 200A est vu. La caricature schématise le trajet de la lumière dans la mise en place et comment TFRI est atteint. Le laser est focalisé sur le plan focal arrière de l&#39;objectif 60X 1,45 NA et sa position est ajustée décentré afin qu&#39;elle émerge dans l&#39;huile d&#39;immersion à l&#39;angle critique α. A ce point le faisceau souffre d&#39;une réflexion interne totale et se désintègre avec une λ distance (voir l&#39;équation dans le texte principal) dans le milieu de l&#39;indice de réfraction plus faible. Dans ce cas, il s&#39;agit de la mémoire tampon d&#39;enregistrement entourant les astrocytes et les astrocytes eux-mêmes. Le résultat est une excitation optique (et donc d&#39;imagerie) des molécules dans ~ 100 nm de la membrane plasmique. Dans le dessin animé de la cellule de ceci est montré que le vert &quot;excité&quot; récepteurs membranaires, alors que ceux au sein de la cellule ou sur la surface supérieure de la cellule ne sont pas excités. Un compte rendu complet de la microscopie TIRF a été fournie par Steyer et Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figure 2" /> FIGURE 2. Images de 100 perles fluorescentes nm acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. montre des images du PEV d&#39;un champ de vue avec des perles de plusieurs dizaines de nm 100 fluorescentes. Le point rouge flèches aux perles qui se sont installés sur la lamelle de verre, tandis que les flèches bleues au point de perles qui se diffusent dans l&#39;eau. B. montre une image TIRF du même champ de vision, comme indiqué en A. Dans ce point de vue que les perles adhérente représentée par les flèches rouges sont visibles. C&#39;est parce que ces s&#39;étaient installés sur le verre et coverlsip étaient donc dans le domaine de ~ 100 nm évanescente. Les perles montré dans une des flèches bleues ne sont pas dans cette région et sont donc invisibles dans les images FRBR. Les parcelles inférieures montrent un rendu 3D des images. Il est clair qu&#39;une augmentation importante de signal-bruit est produit pour les billes dans le champ évanescent lorsque observées par microscopie TIRF. En fait, pour ces images le signal-bruit pour le PEV a été de 7,1 ± 0,6, tandis que pour la FRBR il était de 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figure 3" /> FIGURE 3. Images des astrocytes chargées avec Fluo-4 colorant indicateur de calcium acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. PEV images d&#39;un champ de vue avec cinq astrocytes. B. Une image TIRF du même champ de vue montré dans la note B. que les images de A et B sont sensiblement différentes. C&#39;est parce qu&#39;avec la FRBR seul éclairage de la membrane plasmique des régions en apposition à proximité de la lamelle de verre sont imagés. Les panneaux inférieurs montrent ATP évoqué transitoires du calcium intracellulaire imagées avec le PEV et la microscopie TIRF.

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<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
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<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Il est bien établi que les astrocytes affichage des élévations de calcium intracellulaire. Ils se produisent spontanément, peut être déclenchée par l&#39;activité neuronale ou par application d&#39;agonistes à activer les récepteurs à la surface des astrocytes 11. Une question importante et controversée est de savoir si astrocytes élévations de calcium intracellulaire peut déclencher la libération de molécules de signalisation qui activent les récepteurs des neurones 11, 12. Ceci est controversée, car il ya eu des preu...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Micro Cover Slips, Ronds, No. 1</td><td>Outil</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromure</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminine provenant de la membrane basale de sarcome murin Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée d'Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Minimum Essentiel (MEM) (1X), liquide, contenant les sels d'Earle&amp;rsquo;s, mais sans L-glutamine ni rouge de phénol</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Solution liquide de pénicilline-streptomycine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pyruvate de sodium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Solution de HEPES 1 M</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Supplément N-2 (100X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval, inactivé par la chaleur</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Réactif</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal&amp;#8482; (1X), liquide sans rouge de phénol</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Supplément sans sérum B-27 (50X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour cellules</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits plates BD Falcon avec couvercles, stériles</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Acide HEPES libre</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Fluo-4 AM 1 mM dans le DMSO</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Pluronic&amp;#174; F-127 20 % dans le DMSO</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Huile d'immersion TYPE DF</td><td>Microscope</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Chambre ouverte pour lamelles rondes de 25 mm, volume de 100 &amp;mu;l</td><td>Outil</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme P-2 pour chambres série 20, sans chauffage</td><td>Outil</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles carboxyl-modifiées FluoSpheres, 0,1 &amp;mu;m, fluorescentes jaune-vert (505/515), 2 % de solides</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Le cerveau contient des cellules gliales. Les astrocytes, un type de cellules gliales, ont longtemps été connues pour fournir un rôle passif de soutien pour les neurones. Cependant, plus de preuves suggèrent que les astrocytes peuvent aussi participer activement à la fonction cérébrale par des interactions fonctionnelles avec les neurones. Toutefois, de nombreux aspects fondamentaux de la biologie des astrocytes restent controversées, clairs et / ou expérimentalement inexploré. Une question importante est la dynamique des transitoires du calcium intracellulaire dans les astrocytes. Cette question est pertinente parce que le calcium est bien établi comme un messager important secondes et parce qu&#39;il a été proposé que les élévations de calcium astrocytaire peut déclencher la libération de transmetteurs d&#39;astrocytes. Cependant, il n&#39;a pas été toute description détaillée ou satisfaisante du calcium à proximité de la membrane plasmique de signalisation dans les astrocytes. Fluorescence totale de réflexion interne (FRBR) microscopie est un outil puissant pour analyser physiologiquement pertinents événements de signalisation dans environ 100 nm de la membrane plasmique des cellules vivantes. Ici, nous utilisons la microscopie TIRF et décrire la façon de surveiller à proximité de la membrane plasmique et la dynamique globale du calcium intracellulaire presque simultanément. Le raffinement et l&#39;application systématique de cette approche a le potentiel pour informer sur les détails précis de la signalisation calcique astrocytaire. Une compréhension détaillée de la dynamique du calcium dans les astrocytes pourrait fournir une base pour comprendre si, comment, quand et pourquoi les astrocytes et les neurones subissent calcium-dépendante des interactions fonctionnelles.

Nous décrivons comment mesurer près de la membrane et la dynamique globale du calcium intracellulaire dans les astrocytes cultivés en utilisant la réflexion interne totale et de la microscopie à épifluorescence.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Le cerveau contient des cellules gliales. Les astrocytes, un type de cellule gliale, sont connus depuis longtemps pour jouer un rôle de soutien passif auprès des neurones. Cependant, ...

Dans la première partie de cette vidéo, nous allons démontrer comment préparer la co-culture d'astrocytes et de neurones. Pour ce faire, plusieurs hippoCampi provenant de rats P un sont collectés dans un tube, digérés au propane, dissociés par ation, puis ensemencés sur des lamelles. La deuxième section montrera comment mesurer la dynamique calcique intracellulaire dans les astrocytes, ce qui implique le chargement d'un colorant indicateur calcique flu oh quatre dans les astrocytes et la mesure de la dynamique calcique globale par microscopie epi, ainsi que la mesure de la dynamique calcique proche de la membrane par microscopie turf.En modifiant rapidement et automatiquement l'illumination, on peut observer presque simultanément le calcium global et le calcium proche de la membrane. Bonjour, je suis Aji omi, chercheur postdoctoral au laboratoire Budget COS du Département de physiologie de l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie calcique des asto sites.Nous utilisons cette procédure dans notre étude en laboratoire sur la dynamique calcique globale et près de la membrane dans un ostéocyte. En modifiant rapidement et au

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La préparation de coupes de cerveau de courte durée isolé hippocampes, ainsi que les enregistrements électrophysiologiques simultanées d'astrocytes et les neurones...

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

Imagerie calcique spontanée pour la dynamique spécifique des compartiments dans les astrocytes

Nous décrivons ici une adaptation des protocoles utilisés pour induire la plasticité homéostatique dans les neurones de l'étude de la plasticité des G récepteurs couplés à la protéine astrocytaires. Récemment utilisé pour examiner les changements dans le groupe I mGluR astrocytes chez les souris jeunes, la méthode peut être appliquée pour mesurer l'échelle des différents RCPG astrocytaires, dans les tissus de souris adultes in situ et in vivo, et d'avoir une meilleure appréciation de la...

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Les propriétés et les fonctions des signaux intracellulaires Ca2+ des astrocytes dans le striatum restent incomplètement explorées. Nous décrivons des méthodes pour exprimer des indicateurs calciques génétiquement codés dans les astrocytes striataux à l’aide de virus adéno-associés de sérotype 2/5 (AAV2/5), ainsi que des procédures pour imager de manière fiable les signaux Ca2+ dans les astrocytes striataux in situ.

Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Le protocole AWESAM décrit ici est optimal pour la culture des astrocytes murines isolément des autres cellules du cerveau une manière rapide, simple et peu coûteux. AWESAM astrocytes présentent spontanée Ca2 + signalisation, la morphologie et génétique des profils d’expression semblables aux astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d'analyse d'image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

Ce protocole fournit une description complète d’une méthode permettant l’enregistrement simultané des signaux calciques provenant des neurones et des astrocytes à travers plusieurs régions cérébrales liées à la mémoire et démontre son application dans un paradigme d’apprentissage et de comportement mémoire.

Une méthode de photométrie à fibres bicolores pour enregistrer l’activité astrocyte-neurone dans plusieurs régions cérébrales lors de l’apprentissage et des comportements de mémoire

Découvrez la mesure de la dynamique calcique globale et proche membrane dans les astrocytes en culture utilisant la microscopie à fluorescence et en réflexion totale interne. Cette méthode permet d'étudier simultanément les signaux calciques dans les cellules gliales.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

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