Name: 蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 学ぶヒト精子核における蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル。染色体13、18、21、X、Yの異数性スクリーニングにより、不妊男性の生殖リスク評価と遺伝的健康診断に有用な方法です。

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この作品はのGeneralitat de Catalunyaの（2005 - SGR00437）によってサポートされていました。著者は、彼の技術支援のためにJ.ブランコとF.ヴィダルその監督と励ましのため、およびJ.ルーカスに感謝。

I.サンプルの処理および細胞の固定<ol><li>液状化するまで、室温で20分間滅菌した容器に精液のサンプルのままにしておきます。 </li><li>遠心チューブに試料を移し、5分間千グラムで、それを回転させる。 </li><li>静かにパスツールピペットを用いて上清を除去して捨てる。 </li><li> 10mlの最終容量を得るためにボルテックスで混合しながら、低張液（塩化カリウム、0.075M）37予備加熱° C、滴ずつ、追加してください。 </li><li> 37水浴中にチューブを置きます℃で30分間。 </li><li> 5分間千グラム間遠心する。慎重にペレットを乱すことなく、デカンテーションで上澄み液を捨てる。 </li><li> 8ミリリットルの最終的な音量を得るためにボルテックスで混合しながら滴ずつ：ペレットを再懸濁させた後、作りたてのカルノア固定液（酢酸3時01メタノールの）追加。 </li><li>ホワイトペレットを得るために必要な回数だけポイント6と7を繰り返します。 </li><li>作りたてのメタノール追加：酢酸（3:1）（小さなペレットとそのような場合で広がり良好な細胞を得るために必要な細胞濃度に最終的な音量を調整するために滴ずつを、数滴は高い金額でのサンプルに対し、十分になります回収した精子から、最後のボリュームは）1-2 mlを達することができる。テストスライドは、油を塗っていないスライドに再懸濁したサンプルを滴下し、位相差顕微鏡下でそれを調べることによって行うことができます。これは、得られた細胞の分散をチェックし、必要に応じて、さらにスライドで、、それを訂正できるようになるようになる。 </li><li>拡張子を、40cmの高さの最小値からドロップunfrostedのスライドの中央に細胞懸濁液の二、三滴（以前に、それらを脱脂するために-20℃でメタノールに保存されている）。を作るためにプロトコル全体にサンプルの場所を有効にするには、ダイヤモンドの鉛筆を使ってスライドの反対側の精子の拡張子を含む領域をマーク。 </li><li>少なくとも24時間、-20 ° Cでスライドを保存する。 注意：メタノールの添加：酢酸（3:1）滴ずつ混合が精子凝集体の形成を避けるために非常に重要なステップですが。 </li></ol> II。脱凝縮<ol><li>スライドは、-20℃で保存は、（室温でそれらを残す）プロトコルを続行するために解凍する必要があります。 </li><li> 3分ごとに2倍の生理食塩水、クエン酸ナトリウム溶液（2xSSC）の2つの連続した​​コプリンジャーにスライドを配置。 </li><li>各コプリンジャーで2分間エタノール洗浄の一連のスライドを転送する。 70％エタノールで開始、100％で90％、仕上げによって従ってください。室温でそれを残してスライドを乾燥させます。 </li><li> 37℃でジチオスレイトール溶液中でスライド（1,4 - ジチオスレイトール5mmの1％トリトンX - 100、2 - アミノ-2 - （ヒドロキシメチル）-1,3 - プロパンジオール50mmのを）インキュベートしますインキュベーターでCは、クロマチンをdecondenseする。この製品は、精子核のプロタミンのジスルフィド架橋そのコイルDNAを破壊することによって動作します。精子核のDNAは高度に圧縮されるので、これは非常に重要なステップです。ジチオスレイトール溶液（DTT）のスライドのインキュベーション時間は、この製品に対するサンプルの反応性に応じて調整する必要があります。それは2〜15分ごとに異なる​​ことができますが、通常、この時間は、8分程度です。 </li><li>すぐに、各コプリンで3分間2xSSC二つの連続した​​コプリンジャーにスライドを転送する。 </li><li>各コプリンジャー（70％、90％および100％エタノール）で2分間エタノール洗浄の一連のスライドを配置することによって継続する。スライドを室温で乾燥させて。 注：あまりにも短い露光には、いくつかのシグナルの欠如につながるだろう、一方DTTに過度の暴露は、手順の最後にFISHシグナルを分散させるという結果に。 </li></ol> III。交配<ol><li> 73行でホルムアミド溶液（70％Formamide/2xSSC）℃で5分間でコプリンジャーにスライドをインキュベートすることにより、精子のDNAを変性させる。 </li><li>コプリンジャー当たり1分（70％エタノールで85％を開始し、100％で終了）のためにエタノール溶液を介してスライドを転送する。室温で乾燥させるスライドにしておきます。 </li><li>の直接5リットルを追加し、対応するすぐに使用できる15x15カバースリップ（AneuVysionアッセイマルチカラープローブパネル：CEP 18/X/YまたはLSI 21分の13）にプローブの混合物を。 </li><li>それはビデオに示されているように、慎重に標的領域とプローブの混合物をまとめるためにカバースリップの上にスライドを配置。ラバーセメントでそれを封印。 </li><li>予め温めておいた37にスライドを配置° Cハイブリダイゼーションチャンバー（HYBrite™）および6〜24時間37℃で反応させる。 注：精子のサンプルの変性が必須であるのに対し、プローブを変性の必要性は、製造業者によって決定されます。このプロトコルで使用されるプローブの混合物は、使用する準備ができていると、このケースでは、プローブの変性は不要です。 プローブの混合物の体積は、ハイブリダイズした領域のサイズに応じて異なります。 </li></ol> IV。洗浄ポストハイブリダイゼーション<ol><li>ハイブリダイゼーションチャンバーからスライドを取り出してください。 </li><li>ラバーセメントを取り外し、慎重に側に静かにスライドカバースリップを引き出します。 </li><li>排除する非特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、NP - 40は73で予め温めておいた0.4xSSC/0.3％でコプリンジャーに2分間、スライドを配置℃の水浴でC。 </li><li> 2xSSC/0.1％のNP - 40 1分間室温で洗浄溶液にスライドを移し。スライドを室温で乾燥させて。 </li><li>ターゲット領域（18 × 18カバースリップ用8リットル）に対比製品を追加。使用される最も一般的な製品は、4&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI、バイシス社）です。 </li><li>それはビデオに示されているように、カバーガラス（カバーガラスをマニキュアで密封することができるハイブリダイゼーションを維持するために）とハイブリダイズした領域をカバーする。 </li><li>彼らの見通しの分析まで暗所で-20℃でハイブリダイズしたスライドを保存する。これらの条件下でのスライドは、蛍光シグナルの強度を大幅に失われることなく、12ヶ月間まで保存できます。 注：反対は、非特異的プローブのハイブリダイゼーションを洗い流すだろうに対し、より高い温度または過度の洗浄時間は、いくつかの信号の除去をもたらすことができる。 追加された対比製品の体積がカバーするハイブリダイゼーション領域のサイズに応じて異なります。 </li></ol> V.の可視化準備はDAPI /テキサスレッド/ FITCとシングルバンドアクア、FITCおよびテキサスレッドのためのフィルタのためのトリプルバンドフィルターを備えた蛍光顕微鏡下で評価することができます。標準の評価基準は、精子の核1の正しい評価のために従う必要があります。 染色体X、Y、18用のプローブとハイブリダイズする準備は、これら3つの染色体のための信号が表示されます。すべての正常な精子一青の信号（18番染色体に相当する）、そして緑の信号（X -ベアリングの精子）や赤の信号（Y -ベアリング精子を）示す必要があります。 染色体13および21、13番染色体と21番染色体は赤色信号のための緑の信号のためのプローブとハイブリダイズする準備のためにすべての通常の精子に区別されなければなりません。

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

このプロトコルは、精子のFISHの準備を取得するために人間の精液のサンプルを処理する方法について説明します。それがこのプロトコルを使用すると、雄の配偶子の染色体異常を分析することが可能です。精子異数性のスクリーニングは、基礎研究の文脈でと不妊男性に与えられた生殖アドバイスのいずれかのアプリケーションを持っています。臨床診断に最も広く研究されている染色体はX、Y、13、18と21ですが、染色体と遺伝子座の広い範囲の他の市販のプローブが使用可能であり、またこれらの実験で使用することができます。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジチオスレイトール (DTT)</td><td>材料</td><td>ロシュ・グループ</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール</td><td>材料</td><td>ロシュグループ</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>材料</td><td>Merck &amp;株式会社</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; マルチカラーDNAプローブキット&lt;ul style=&quot;パディング：2px;&quot;&gt;&lt;リチウム&gt;20倍塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウム緩衝液&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;リスト項目&gt;CEP 18/X/Y DNAプローブ&lt;/li&gt;&lt;リチウム&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;リチウム&gt;LSI 13/21 DNAプローブ&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>材料</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;パディング：2px;&quot;&gt;&lt;リチウム&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;リチウム&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5804R</td><td>ツール</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>材料</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー（ガラス製）</td><td>材料</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー（プラスチック製）</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (15x15)</td><td>材料</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (18x18)</td><td>材料</td><td>クニッテル・グレイザー</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドペンシル</td><td>材料</td><td>ハマッシャー</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>材料</td><td>Merck &amp;株式会社</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>材料</td><td>ロシュグループ</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫</td><td>ツール</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手袋</td><td>材料</td><td>三洋</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>ツール</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>材料</td><td>オリンパス株式会社</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ツール</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>材料</td><td>Merck &amp;株式会社</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>材料</td><td>ラボシステム</td><td>フィンピペット (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット交換用チップ</td><td>材料</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>ネイルラッカー</td><td>材料</td><td>クオ・コスメティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60落射蛍光顕微鏡</td><td>ツール</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td>DAPI/Texas Red/FITC用の3波長フィルター、およびAqua、FITC、Texas Red用の単波長フィルターを搭載しています。</td></tr><tr><td>パステールピペット</td><td>材料</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>ツール</td><td>ニコン製機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット (3ml)</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>材料</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>ラバーセメント</td><td>材料</td><td>最良テスト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>材料</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>スライド保存ボックス</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>滅菌容器</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>材料</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>材料</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>三回蒸留水</td><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>材料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>材料</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>垂直層流 &lt;電子顕微鏡&gt;クリーンベンチ&lt;/em&gt;</td><td>ツール</td><td>ブルディノラ</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>ツール</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>恒温水槽</td><td>ツール</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（fish）プロトコル

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidiesは、ヒトで最も頻繁に染色体異常です。これらの異常のほとんどは、両親のgametogenic過程で減数分裂のエラーに起因する。人間の男性では、これらのエラーは、子孫にこれらの異常を送信するリスクの増加を表す数値染色体異常を持つ精子の生産につながることができます。 このような理由から、精子の核のin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光の技法は、広く臨床診断のコンテキストに組み込まプロトコルになっています。この練習では、遺伝的生殖アドバイスを求める患者の配偶子の数値染色体異常の頻度の推定値を提供します。 日付に、最も頻繁に精子のFISH分析に含まれる染色体は染色体X、Y、13、18および21です。 このビデオの記事は、順を追って説明し、人間の精液のサンプルを処理し、解決する方法、精子のクロマチンをdecondenseと変性する方法、どのように精子FISHの準備を取得するために進むために、そして顕微鏡での結果を可視化する方法。最も関連性の高い手順の特記事項は、最高の結果を達成するために与えられている。

このビデオの記事では、良質の蛍光を達成するために精液のサンプルを処理する方法を順を追って、説明します<em&gt;その場で</em人間の精子で&gt;ハイブリダイゼーション。得られた製剤は、臨床診断のコンテキストで異数スクリーニングに用いることができる。

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

異数性は、ヒトにおいて最も頻度の高い染色体異常である。これらの異常の大部分は、配偶子形成過程における減数分裂のミスに起因する。

ヒト精子核における蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）プロトコルは、臨床診断の分野で広く導入されています。この手法の応用例の一つに、精子の倍数性スクリーニングがあります。不妊男性への生殖に関するアドバイスの一環として、これらの個体では一般集団よりも数的な異常の出現率が高く、しばしば精液パラメータの異常を示します。これは、これらの異常を子孫に伝達するリスクが高まることを意味します。本日は、13番、18番、21番、XおよびY染色体の解析を目的とした、脱凝縮精子核における蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）プロトコルについて解説します。検体を採取した後、液状化が起こるまで室温で20分間放置します。プロトコルを開始するために、検体を遠心分離管に移します。実験の最初に使用する溶液は、37 °Cに予熱した高張液と、3:1の割合のメタノール酢酸です。これらは調製直後のものを使用してください。その後、サンプルを1,000 ×gで5分間遠心分離します。次に、上清を静かに取り除き、液量が約 10 milliliters になるまで高張液を滴下します。このチューブを 37 °C で 30 分間静置した後、サンプルを再度遠心分離します。遠心分離により精子がチューブの底に集まるため、低張液をメタノールに置換することができます。白いペレットが得られるまで、メタノール酢酸の交換に伴う酢酸遠心分離を必要回数繰り返さなければなりません。この際、さらにメタノール酢酸を追加する必要があります。最終容量は、以降の工程で得たい細胞分散状態に応じて調整してください。最終ステップとして、-20°Cで保存したメタノール入りのリードスライド上に固定試料を滴下し、展延標本を作成します。後の再局在化に備え、スライド上の精子展延領域を特定しておくと便利です。これは、スライドの裏面にダイヤモンドペンシルを用いて容易に行うことができます。最適な細胞分散が確認されたら、スライドを-20°Cで最低24時間保存してください。プロトコルを進める前に。実験のこのパートでは、生理食塩水、クエン酸ナトリウム溶液、エタノール系列、DRE、fatalおよびfideを使用します。スライドの解凍後、固定したサンプルを2×SSCを含む2つのコプランジャーに順次浸し、洗浄および脱水させる必要があります。各コプランで3分間かかります。その後、スライドをエタノール・コプラン瓶に、濃度の低い順にそれぞれ2分間浸します。次の段階に進むために、ここでスライドを乾燥させる必要があります。精子核内のDNAは高度に凝縮されているため、変性させる前にクロマチンを脱凝縮させる必要があります。これは37 °CのDTT溶液を用いて行うことができます。DTTは、精子核内でDNAを巻き付けているプロタミン のジスルフィド結合を切断することで作用します。スライドのDTTにおけるインキュベーション時間は、精液検体の本剤に対する反応性に応じて調整する必要があります。通常は8分程度ですが、2分から15分の間で変動することがあります。この時間の後、スライドを直ちに2×SSCに移して3分間、さらに再び3分間処理し、続いてエタノール・コプランジャーにそれぞれ2分間浸します。プローブハイブリダイゼーションでは、単鎖DNAを用いることが不可欠です。そのため、プローブを添加する前に変性段階が必要であり、フォームアミド溶液中、73 °Cで5分間のインキュベーションを行います。スライド処理の締めくくりとして、最終的なエタノール溶液への移行が必要であり、各コプランジャーにスライドを1分間浸します。これで、臨床診断のために実施されるFISH法におけるスライドのハイブリダイゼーション準備が整いました。最も一般的に解析される染色体には、性染色体および第13番、18番、21番染色体が含まれます。これらの染色体を解析するために、Vysis社のマルチカラーDNAプローブキットを使用します。本製品には、緑色およびアクア色でそれぞれ標識された染色体X、Y、および18のαサテライト領域用のプローブ混合液が入ったバイアル1本と、緑色およびオレンジ色でそれぞれ標識された染色体13および21用のプローブ混合液が入ったバイアルもう1本が含まれています。添加するプローブ混合液の量は、ハイブリダイゼーションを行いたい領域のサイズによって異なります。15 × 15のカバーガラスの基準として、5 µLの量で十分です。どちらのプローブ混合液も、利便性のためにハイブリダイゼーションバッファー中であらかじめ変性されており、脱凝縮および変性処理済みのスライドに直接添加することができます。また、これらの実験に使用可能な、幅広い染色体や遺伝子座を対象とした他の市販プローブも利用可能です。ただし、通常、これらのプローブを標的サンプルに添加する前には、事前の変性処理が必要となります。このような状況では、メーカーの指示に従うだけで十分です。標的領域をカバーガラスで覆い、ゴムセメントで封印します。その後、スライドを37 °Cに予熱したハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、その温度で6～24時間インキュベートします。プロトコルの最終段階では、異なる濃度のクエン酸ナトリウム塩溶液と界面活性剤NP 40で調製したこれら2種類の洗浄液を使用します。インキュベーション時間が経過した後、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、ラバーセメントを除去します。その後、カバーガラスを慎重に取り除きます。図に示すように、スライドを73 °Cに予熱した第1洗浄液に2分間浸します。次に、室温の第2洗浄液に移し、さらに1分間浸します。これら2回の洗浄により、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルを除去します。これら2回の洗浄後、プロトコルの最終ステップを完了させるため、スライドが乾燥するまで待ちます。この段階で、細胞核の可視化を容易にするために対比染色剤を添加します。この目的で最も一般的に使用される薬剤の一つにDAPIがあります。添加する液量は、18 × 18 mmのカバーガラスを基準として、ハイブリダイゼーション領域の大きさに合わせて調整する必要があります。DPIを8 µL添加します。カバーガラスをネイルポリッシュで封止すれば、標本の観察準備は完了です。あるいは、解析まで-20 °Cで保存することも可能です。可視化に使用する顕微鏡は、dpi、Texas Red、FITC用の3色フィルター、およびaqua、FITC、Texas Red用の単色フィルターを備えたOlympus BX 60 epi蛍光顕微鏡です。3色フィルターを使用すると、x、Y、および18番染色体でハイブリダイズさせた標本において、これら3つの染色体のシグナルが表示されます。aqua用の単色フィルターを使用すると、18番染色体の蛍光シグナルのみを可視化できます。正常な精子1個につき、これらのシグナルが1つ観察されるはずです。しかし、FITCのみのシングルバンドフィルターを使用すると、一部の精子にX染色体に相当する緑色の蛍光シグナルが認められます。緑色のシグナルを欠く精子は、Y染色体に由来する赤色のシグナルを示すはずであり、これはTexas red用フィルターを通じて特異的に可視化できます。トリプルバンドフィルターを用いて1321ハイブリダイゼーションを可視化することで、これら2つの染色体のシグナルを区別することが可能です。緑色のシグナルは第13番染色体に対応しており、FITC用のシングルバンドフィルターを用いて特異的に視覚化できます。Texas Red用のシングルバンドフィルターを用いることで、第21番染色体のシグナルを特異的に視覚化することが可能です。正常な精子はすべて、これら2つのプローブそれぞれに対して1つのシグナルを示すはずです。まとめとして、本プロトコルの主要な段階を説明します。繰り返しになりますが、高品質な伸展を得るためには、メタノール酢酸を1滴ずつ滴下し、固定工程を正確に行う必要があります。また、脱凝縮過程での精子凝集の形成を避けるため、DTT溶液中のインキュベーション時間は、当該製品に対する精液試料の反応性に応じて調整しなければなりません。精子をDTTに過剰に曝露させると、プロトコルの最終段階でシグナルが分散し、逆に曝露が不十分であると、プローブのハイブリダイゼーションが起こらず、一部のシグナルが消失します。精子サンプルの変性は必須ですが、プローブの変性はメーカーの指示に従って調整する必要があります。ハイブリダイゼーション後の2回の洗浄における時間と温度を厳密に管理することが重要です。温度が高すぎたり、洗浄時間が長すぎたりすると、一部のシグナルが消失することがあります。一方で、その逆（温度が低すぎる、または洗浄時間が短すぎる）の場合は、非特異的なシグナルが除去されません。最後に、良好な可視化とシグナルの判定には、適切な特異的フィルターを備えた落射型蛍光顕微鏡の使用が不可欠です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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