Name: Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin, mikro prizmalar kullanarak fare neokorteksinin derin katmanlarını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tüm kortikal katmanları aynı anda görselleştirerek sinirbilim araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anthony J. Koleske, Doktora YFP fareler sağlamak için teşekkür ederiz.

Bölüm 1: micropism Optik ve Mikroskop Kurulum <ol><li> Kullandığımız microprisms Optosigma Corporation (Şekil 1) alınan BK7 camdan yapılan 1 mm, dik açılı prizmalar. Microprisms mümkün forseps kullanarak işlenir. </li><li> 2000 nm - micropism hipotenüs 400% 97 daha fazla yansıtma sağlamak için geliştirilmiş gümüş ile kaplanır. Bu lazer uyarma ışık ve yayılan floresan hem de iç yansıma sağlar. </li><li> Microprisms her zaman mümkün olduğunda forseps kullanarak işlenir. Eldiven prizma temiz tutmak için her zaman giyilir. </li><li> Biz küçük hayvan görüntüleme kapasitesine sahip bir özel inşa edilmiş iki foton mikroskop kullanıyoruz. Stereotaktik cihaza bağlı hayvan, 3-eksenli bir motorlu sahnede yer almaktadır. </li><li> Mikroskop ScanImage yazılımı çalıştıran bir Windows PC&#39;ye bağlı. ScanImage Pologruto ve ark 1 Matlab yazılı bir görüntü elde etme yazılımı . </li><li> Micropism görüntüleme için 1024 x 1024 veya 512 x 512 piksel çözünürlükte görüntüler topluyoruz. Buna ek olarak, biz genellikle 2 ms / satır veya 4 ms / satır tarayın. </li><li> İki tür hedeflerin deneylerde kullanılır: <ul><li> Geniş alan görüş görüntüleme için daha düşük bir sayısal açıklık (NA) hava hedefi (Tablo Reaktifler ve Ekipmanları). </li><li> 0 tarafından uyarılan küresel sapmaları en aza indirmek yeteneğine sahip bir cam düzeltme yakalı bir yüksek NA hava hedefi - 2 mm cam (bkz. Reaktifler ve Ekipmanları Tablo) . </li></ul></li><li> Hayvan, düşük bir büyütme amacı altında görüntüleme için hazır olduğunda, micropism üst lazer kare raster tarama desen aynı hizaya getirin. Bu yönlendirmek görüntü ve lazer güç verimli kullanımını sağlamaya yardımcı olacak. </li><li> Cam bir düzeltme yaka ile daha yüksek bir NA amacı kullanarak, yaklaşık 1 mm cam için doğru düzeltme yaka ayarlayın. Floresan görüntü deney sırasında göründüğünde, bir dikkatle, görüntü çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için düzeltme yaka optimize etmek için mikroskop içinde ulaşabilirsiniz. </li></ol> Bölüm 2: Sigara hayatta Hayvan Cerrahisi ve micropism Ekleme <ol><li> Tüm prosedürü uzunluğu, ilk kesi görüntüleme tamamlanıncaya kadar, deney hedeflerine bağlıdır. Tamamlamak için 40 dakika hayatta olmayan cerrahi prosedür ve micropism yerleştirme Ancak, yaklaşık 30 almak için bekleniyor olabilir. </li><li> Fare (P30-P60) tartılır ve uygun cerrahi işlemler için uygun bir uçak anestezi ketamin (100 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) bir IP enjeksiyon kullanarak. </li><li> Tüm deney boyunca, hayvan anestezi seviyesini değerlendirmek için her 15-20 dakikada bir kontrol edilmelidir. Hayvan tepki sağlam bir ayak tutam ilave bir doz ketamin / xylazine gereklidir. Tipik bir ek doz ilk dozun üçte biri ve gerekirse acil IP enjeksiyon için bir şırınga içinde önceden hazırlanmış olabilir. </li><li> Fareyi doğru uyuşturulduktan sonra, hayvanın kafasına saç çoğunluğu # 40 bıçak ile bir düzenleyici kullanarak kazınıyor. </li><li> Nair ® görüntüleme sırasında micropism şekilde alabilirsiniz kılların ücretsiz bir yüzey oluşturmak yardımcı olmak için baş kalan kıllar için uygulanır. Nair ® 5 dakika sonra, bir pamuk uçlu çubuk yardımıyla temizlenir. </li><li> Anestezi hayvan düzgün bir fare stereotaktik cihazın içine yerleştirilir. Cerrahi işlemler ve görüntüleme oturumları sırasında hayvan 36 santigrat derece sıcaklıkta su dolu ısıtma yastığı tutulur. </li><li> Hayvanın kafa ile düzgün bir yerde sabit, temiz bir kesi kafatası medial satır aşağı cilt ayırmak için bir neşter kullanılarak yapılır. </li><li> % 3 hidrojen peroksit küçük bir miktar pamuk uçlu bir bez üzerinde yerleştirilir ve kafatası, kafatası ve cilt arasındaki membranlar temizlemek için uygulanır. </li><li> Hidrojen peroksit de bregma kraniotomi gerçekleştirmek ve micropism eklemek için bilerek, önemli bir dönüm noktası ortaya çıkarmak için yardımcı olur. </li><li> Kraniotomi başlamadan önce, kulak bar ve snack bar, düzgün bir tablo ile temel düzeyde olduğu gibi açıkta kalan kafatası yatırmak için ayarlanır. Bu kraniotomi için daha iyi bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu gelen uyarma ışığı ile üst yüzeyine dik prizma yapar. Bu görüntüleme sırasında optik sapmaları en aza indirmeye yardımcı olacaktır. </li><li> Küçük bir diş çapak (~ 0.8 mm kafa boyutu), esnek bir uzatma kolu kullanarak bir Dremel ® araç bağlıdır. Cerrahinin için, yaklaşık olarak 7.000 ila 10.000 rpms hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Kadar bir kare oluk kemik yılında kurulan diş çapak kafatası boyunca yağsız. Meydanın iki tarafında yaklaşık 2-3 mm uzunluğunda ve 1,5 mm kaudal ve bregma lateral 1 mm merkezli. </li><li> Kemik incelmesi kafatasına küçük bir delik aracılığıyla yapılıncaya kadar devam etmektedir. Forseps ca bir çiftn uzak kafatası kemik flep kaldırın. </li><li> Dura micropism korteks eklenebilir önce kaldırılması gerekiyor. Kanama, kan birkaç dakika için yüzey koagüle sağlayarak en iyi kontrol edilir. Daha sonra, pıhtılaşmış kan micropism takmadan önce cerrahi sünger kullanarak kaldırılır. </li><li> Korteks ile prizma uyum yardımcı yardımcı olmak için, dikey yüz micropism forseps kolları paralel dizilmiş olan. </li><li> Prizma üst neokortikal yüzeyi ile aynı hizada olacak kadar düzgün düzenlenen prizma ile, tüm micropism eklenir. </li><li> Doğru takıldığında micropism, düzgün bir pozisyonda kalmalıdır. Sonucu herhangi bir kanama az ve küçük bir cerrahi sünger ile absorbe edilebilir. Prizma yerleştirildikten sonra hayvan görüntüleme için hazırdır. </li><li> Micropism bir hayvan olarak kullanıldıktan sonra, birkaç kez yeniden kullanılmış olabilir. Ancak, düzgün kalan herhangi bir biyolojik materyal kaldırmak için temizlenmesi gerekir. Bu, küçük bir hacim HCl asit, metanol içine dalış takip içine prizma daldırma ile yapılabilir. Temizlenen micropism sonra ileride kullanmak kadar objektif kağıdı ile sarılmış olabilir. </li></ol> Bölüm 3: Temsilci Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: dik açılı micropism görüntüler. Bu deneyde kullanılan Prizmalar, hipotenüs üzerine, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için geliştirilmiş bir gümüş kaplama ile bir milimetre, BK7 cam prizmalar. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Image katmanı V YFP piramidal nöronların. Derin kortikal yüzeyinden 900 mikron - micropism Geniş alan görünümü görüntüleme ~ 800 piramidal hücre gövdeleri büyük bir nüfus ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, katman doğru uzanan apikal dendritler Ben de çözülecektir. Ölçeği bar = 200 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: micropism uzaysal çözünürlük katman V piramidal nöronlar apikal dendritler dendritik dikenler çözmek için yeterli sağlar birlikte kullanılan yüksek sayısal diyafram objektif. Ölçek çubuğu = 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: micropism ve floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kullanılarak elde edilen bir görüntü. Görüntü kortikal hacmi ile dallara derin beyin bölgeleri ve küçük kılcal damarları uzanan dikey, büyük kalibreli damarları gösterir. Ölçeği bar = 200 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: neokorteks, daha yüksek bir sayısal diyafram objektif kullanımı, kılcal damar ağı daha ayrıntılı görüntülenebilir . Ölçek çubuğu = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6: Microprisms damarları aracılığıyla akan görüntüleme kırmızı kan hücreleri (eritrositler) sağlar. Eritrositlerde floresan boya emer ve bu nedenle geminin üzerinde koyu çizgiler olarak görülür. Gemi karşısında hat-tarama, bir RBC akı ve hız ölçümleri elde edebilirsiniz. Ölçek çubuğu = 10 mm (üst ve alt görüntü yatay çubuk) ve 250 ms (alttaki resim dikey çubuk).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Yale Üniversitesi IACUC tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Bir görüntüleme deneyde micropism kullanmak oldukça basit ve neokorteks in vivo çalışmalar için birçok avantaj sunuyor. Bu tekniği kullanarak Temsilcisi örnekler katman V kortikal nöronların sarı floresan protein eksprese eden transgenik farelerin alınan görüntüleri içerir. Microprisms kullanarak bir katman V büyük piramidal hücre gövdeleri bir koleksiyon, yaklaşık 1 mm kortikal yüzey altında görebilirsiniz. Ayrıca, Tufts (Şekil 2) içine uzaklaşan önce tüm yüzeysel katmanları üzerinden yayılan apikal dendritler görülmek...

<table><tbody><tr><td>Geliştirilmiş gümüş yansıtıcı kaplamalı-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Geliştirilmiş gümüş yansıtıcı kaplamalı-(R77)</td></tr><tr><td>Flüorescein-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>0.28 NA, 4x hava objektifi</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>0.60 NA, 40x hava objektifi</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>0-2 mm lamella düzeltmeli</td></tr></tbody></table>

derin kortikal katmanlar bir micropism kullanarak in vivo görüntüleme

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Biz bir micropism şeklinde derin bir beyin görüntüleme probu kullanarak kortikal doku in vivo görüntüleme için bir protokol mevcut. Microprisms boyutu 1 mm ve hipotenüs, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için bir yansıtıcı kaplama var. Micropism prob aynı anda bir bakış açısı ile görüntüleri birden fazla kortikal tabakalar genellikle sadece dilim hazırlıkları görülmektedir. Görüntüler ile büyük bir alan görünümü (~ 900 mm). Buna ek olarak, hayatta olmayan bir cerrahi işlem ve mikroskop kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Temsilcisi sonuçları, yüzeysel kortikal tabaka boyunca uzanan ve Tufts uzanan apikal dendritler gösteren Thy-1 YFP-H fareler katmanı V piramidal nöronlar görüntüleri içerir. Çözünürlük katmanı V nöronların soma yakın görüntü dendritik dikenler için yeterli oldu. Floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kortekste kan damarlarının karmaşık ağ ortaya koymaktadır. Kılcal damarlar yoluyla akan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) Line-tarama RBC hız ve akı oranları elde edilebilir ortaya koymaktadır. Bu roman micropism prob derin hücresel yapılar ve in vivo olarak kortikal fonksiyon görselleştirmek zarif ama güçlü bir yeni bir yöntem.

Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

Mikoprizma şeklinde bir derin beyin görüntüleme probu kullanarak kortikal dokunun in vivo görüntülenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Mikroprizmalar 1 mm boyutundadır...

Floresan Mikroskopi teknikleri, özellikle beyin dokusu gibi ışığın yüksek oranda dağıldığı materyallerde, dokunun derinliklerindeki yapıları görüntüleme konusunda sınırlı bir kapasiteye sahiptir. İki fotonlu mikroskopi durumunda bile, neokortikal yüzeyden 500 mikron daha derinlerde bulunan nöral yapıların yüksek kaliteli in vivo görüntülerini elde etmek oldukça zor olabilir. Burada, yeşil çizgi 500 mikronluk derinliği göstermektedir.Genel olarak, neokortikal dördüncü, beşinci ve altıncı katmanlar yüzeyden 500 mikrondan daha uzaktır. Neokortekse yerleştirilen bir milimetrelik cam bir mikro prizmanın, yüzeysel ve derin kortikal katmanlara ışığı nasıl iletebileceğini ve bu katmanlardan nasıl geri alabileceğini göstereceğiz. Bu tekniğin bir fare üzerinde kullanılmasıyla, bir milimetrelik bir görüş alanı elde etmek ve tipik olarak yalnızca dilimlenmiş beyin dokularında bulunan bir görüntüleme perspektifinde altı kortikal katmanın tamamını eş zamanlı olarak görselleştirmek mümkündür.Mikro prizmalar, dendritik dikencikleri ve mikrokılcal damarlardaki eritrosit akışını ayırt edebilecek uzamsal çözünürlükleri korurken, beşinci katman piramidal hücre gövdelerini uzun apikal dendritleri ve ne

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir...

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.

Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Bu protokol, sosyal durum manipülasyonu (sosyal izolasyon ve sosyal birleşme) sırasında serbest davranan farelerde minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak hipotalamik nöronların in vivo kalsiyum görüntülemesini detaylandırır. Bu yöntem, sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğu temsil eden hipotalamik aktivitenin tek nöron çözünürlükte görüntülenmesini sağlar ve sosyal homeostazın mekanik çalışmalarını mümkün kılar.

In Vivo'da Farelerde Sosyal Davranışları Anlamak İçin Hipotalamus'ta Minyatürize Mikroskopla Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin, mikro prizmalar kullanarak fare neokorteksinin derin katmanlarını canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, tüm kortikal katmanları aynı anda görselleştirerek sinirbilim araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

Daha fazla video keşfet