Name: 单机在体内录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 了解大鼠视交叉单细胞在体电生理记录技术，使用特制钨染色玻璃电极从麻醉大鼠视网膜神经节细胞记录动作电位。该方法有助于研究视觉处理和视网膜退行性病变。

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感谢 Dan Green 博士在开发这些实验技术过程中提供的技术指导。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01-EY016849A 和史密斯家族新研究者奖支持。

第一部分：玻璃包钨电极的制备
<ol>
 <li>将一个石墨环放入烧杯中，烧杯内装有溶于水的浓硝酸钠溶液（0.71 g/mL）和氢氧化钾溶液（0.34 g/mL）1，然后将烧杯置于改装过的缝纫机的缝纫臂下方。</li>
 <li>用胶带将钨丝（直径0.5 mm，长度6 cm）固定在缝纫臂上，使其部分浸入溶液中（1–2 cm）。</li>
 <li>通过将正极导线连接到缝纫臂、负极导线连接到石墨环，在钨丝两端施加2 V电压。</li>
 <li>启动缝纫机，使钨丝以约4 Hz的频率反复浸入溶液中，持续2分钟，通过电解作用将金属蚀刻成尖锐的尖端。</li>
 <li>将蚀刻后的钨丝安装到手动显微操作器上，并在显微镜引导下（40倍放大）将其尖端与玻璃移液管（外径0.25 mm，内径0.175 mm）的管轴对齐，该玻璃移液管经玻璃拉制仪拉制成1 mm尖端。为防止插入钨丝时玻璃移位，可用橡皮泥暂时将其固定在显微镜载物台上。</li>
 <li>小心地将钨丝从玻璃移液管未拉细的一端推进，沿管轴穿过，直至从1 μm的开口端穿出。视频中可见一小块玻璃从尖端断裂，表明钨丝与玻璃之间配合紧密。用于大鼠视神经纤维记录时，钨丝应从尖端伸出约5–10 mm。</li>
 <li>在玻璃移液管未拉细的一端涂上氰基丙烯酸酯胶水，待其固化后测量电极的电学阻抗，通常1 MΩ的电极性能最佳。</li>
</ol>
第二部分：立体定位装置设置与峰电位序列记录
<ol>
 <li>视频中展示了刺激显示系统，以及用于定位并将电极插入大脑的立体定位装置和微驱动装置。</li>
 <li>为进行视网膜锋电位序列记录，需先将大鼠麻醉，随后使其瘫痪。标准操作流程（未在视频中展示）包括外科手术植入股静脉导管用于给药，以及气管（Y型管）导管用于瘫痪期间的机械通气。实验对动物为终末性操作。</li>
 <li>完成准备操作后，将动物置于加热毯上，并使用耳杆和门齿杆将其头部固定于立体定位仪中，位置依据大鼠脑图谱2确定。</li>
 <li>插入直肠探头，通过恒温控制单元调节加热毯，以维持体温在37°C。</li>
 <li>使用金属针作为导联，用于记录心电图并监测心率。</li>
 <li>在颅骨顶部切开皮肤，暴露颅骨骨板交界处（前囟）。安装定制设计的横梁框架，通过横梁上的孔在颅骨上前囟周围标记一个圆圈，随后暂时移除横梁。</li>
 <li>通过将引导针置于前囟上方对立体定位系统进行校准。在标记位置钻出一个直径5 mm的孔，去除骨质以暴露脑组织。在颅骨开口周围放置一圈软泥，形成密封，随后将横梁重新安装到位。</li>
 <li>若动物已维持稳定麻醉状态一段时间，则注射麻痹剂以防止数据采集期间发生眼球运动。呼吸停止后，启动机械通气。定制程序全程监测通气及生理参数，并在任何参数超出正常范围时提示实验人员采取补偿措施。</li>
 <li>将钨电极从引导针后端装入，并缓慢下插入脑内。穿透脑组织后，在横梁的孔中填充琼脂（未展示），并将微驱动组件夹紧固定于横梁上以确保机械稳定性。随后缓慢推进钨电极（2μm/sec），直至其尖端位于颅骨下方约8–9 mm处，即视交叉所在位置。</li>
 <li>视网膜神经节细胞的锋电位序列通过其对视觉刺激的反应进行识别。在分离出单根视神经纤维后，记录细胞的视觉感受野在视觉空间中的分布，并利用漂移光栅或其他感兴趣的视觉刺激模式表征其反应特性。系统的稳定性支持持续数小时的单细胞单位记录3。</li>
</ol>
材料
成年Brown-Norway大鼠（250–400 g）购自商业供应商，并在受控的12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。使用盐酸氯胺酮和赛拉嗪（分别为70和2 mg/kg，Henry Schein公司）经腹腔注射诱导麻醉，并通过右股静脉插管（外径0.13 mm，Small Parts公司）持续静脉输注氯胺酮和赛拉嗪（30和1 mg/kg/hr）以及葡萄糖、生理盐水和三碘季铵酚（40 mg/kg/hr，Fischer公司）维持整个实验期间的麻醉状态。混合液中加入三碘季铵酚以麻痹眼球运动。根据心率和血压变异性评估，按需调整泵（WPI公司）的输注速率，以维持稳定的麻醉深度。麻痹后，动物通过气管插管由机械呼吸机（Harvard Apparatus，型号683）进行通气，频率为60–80次/分钟（潮气量2 cc），并根据需要调整通气频率，以维持呼气末CO2浓度在30%（使用在线式二氧化碳监测仪Novametrix公司，型号710Sp测量）。体温通过恒温毯控制系统（Harvard Apparatus公司）进行调节。实验全程通过LABVIEW程序连续监测体温、呼气末CO2、心率和血压。视觉刺激呈现在一台Sony Multiscan 17e CRT显示器上（平均亮度30 cd/m2），刷新率为100 Hz，分辨率为800×600像素。数据采集和显示器输出由基于Matlab和LabView编写的定制软件控制，并结合视频图像处理器（Cambridge Research Systems公司，Bits++）和心理物理学工具箱4实现。动物通过接触镜（Ocular Instruments公司）在16.5 cm距离处观察刺激显示屏幕（40.4 × 30.2 cm），实验过程中定期滴加眼用溶液以保持角膜湿润。为最大化可用于刺激的视野，将动物反向固定于立体定位仪（Stoelting公司）上，该装置置于浮动平台（TMC公司）上方14 cm处，显示器安装在定制设计的滑轨上，可在平台上沿以鼻部为中心的±100度弧线移动。此设置提供了一个可重新定位的显示区域，垂直方向覆盖眼平面上方60度至下方35度，水平方向左右各延伸±42度。钨电极使用来自Small Parts公司的金属丝和Friedrich and Dimmock公司提供的定制硼硅酸盐玻璃管制作。采用标准微电极拉制仪（Sutter Instruments，型号P-97）塑形玻璃尖端。电极阻抗测试仪购自Bak-Electronics公司。电极推进使用电机驱动的微操纵系统（Newport公司，StepperMike）。心电图和视神经信号通过高输入阻抗多通道放大器（FHC公司，X-Cell 3x4）进行放大和滤波。心跳信号由窗口鉴别器（WPI公司，型号121）检测。神经动作电位由数字锋电位鉴别器（FHC公司，APM）检测并以0.1 ms分辨率进行时间标记。锋电位鉴别器由视频图像处理器发出的触发信号控制，从而使锋电位时间与刺激精确同步。

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

所有实验程序均经波士顿大学机构动物护理和使用委员会批准。

光纤记录是一种适用于研究视网膜信息编码与传递机制的实验方法，尤其适用于需要保持眼球完整性的实验设计。此外，若将电极置于视交叉或视束处，则可通过单次电极穿刺同时记录交叉与非交叉视神经纤维的活动，从而在几乎相同的生理状态下研究双眼的信号传递特性。尽管光纤记录在猫中较为常见，但在其他视觉研究常用动物模型（如啮齿类动物）中却较少应用，可能因其体型较小所致。我们曾尝试多种 commercially available 电极（具有相似阻抗和材料），但均无法在大鼠中有效获取单根纤维的活动信号，更无法像我们的电极那样持续记录数小时。这表明，我们电极特有的几何结构——具有细长而尖锐的尖端，而非商业电极常见的宽钝尖端——对于稳定可靠地分离视网膜神经节细胞轴突的动作电位序列至关重要。除了介绍此类电极的制备方法外，我们还展示了专为in vivo视觉神经生理学研究设计的立体定位系统。该系统可有效保护高阻抗微电极免受环境振动和电磁噪声干扰，这对于长时间记录轴突产生的微小动作电位（相较于胞体）尤为关键，特别是在附近放置有计算机显示器的情况下。本系统具备卓越的稳定性与信噪比，典型记录时间可达一小时以上，噪声水平通常仅为数十微伏。这些特性使该装置特别适...

单单位 在体内的 大鼠视交叉记录

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

视觉世界的信息通过视网膜神经节细胞轴突中的动作电位序列传送到大脑，这些轴突构成了视神经。体内在多种动物模型中对神经节细胞簇发放电的记录揭示了关于早期视觉系统如何处理和编码视觉信息的大量知识。然而，在最常用的动物模型之一——大鼠中，此类记录却较为罕见，这可能归因于难以检测到由小直径轴突产生的动作电位。由于存在大量涉及大鼠的视网膜疾病模型，因此有必要在不干扰眼球的情况下（如避免使用眼内或侵入性方法）表征神经节细胞的功能特性。in vitro记录。在此，我们演示一种从麻醉大鼠视交叉处记录神经节细胞峰电位序列的方法。我们首先介绍如何制备钨丝-玻璃电极，该电极可采集大鼠单个神经节细胞轴突的电活动。这些电极的性能优于我们试用过的所有商用电极。随后，我们展示自行设计的立体定位系统in vivo视觉神经生理学实验，以及动物准备和在视交叉中进行可靠且稳定电极放置的操作步骤。

视网膜神经节细胞通过一系列动作电位将视觉信息从眼睛传递到大脑。本文演示如何记录单个神经节细胞的动作电位 体内 从麻醉大鼠中获取。

关于视觉世界的信息以动作电位序列的形式，通过构成视神经的视网膜神经节细胞轴突传递至大脑……

今天我们将演示一种我们开发的记录系统，用于在活体大鼠视交叉部位进行记录。此类记录在大鼠中极为罕见，部分原因是构成视神经的视网膜神经节细胞轴突非常细小，难以对单个细胞进行记录；而大鼠是视网膜变性研究中常用的动物模型，因此这类记录具有产生大量有用信息的潜力。实现此类记录的关键在于我们设计的钨染色玻璃电极，其具有细长而尖锐的尖端，能够以高信噪比记录细直径轴突的动作电位。我们将为您演示这些电极的制备过程，并向您展示如何将动物固定在立体定位仪上，随后为您提供从单个神经节细胞记录锋电位序列的示例。电极制备需要三种主要设备：用于拉制微移液管的标准玻璃微电极拉制仪，用于打磨钨丝的缝纫机，以及配备40倍物镜的标准显微镜。此外，需要一个带有连接电极的石墨环，并将其置于氢氧化钾和硝酸钠的浓溶液中。将该装置放置在缝纫臂下方，然后用胶带将一段细钨丝固定在缝纫臂上，使其部分浸入溶液中。接着，将导线一端连接到石墨电极，另一端连接到缝纫臂。在另外两个伏特电压下，将电压施加到引线上并打开缝纫机。这会使杜斯顿浸入溶液中，并通过电磁作用将其 sharpen 两分钟。钨丝 sharpen 完成后，小心地从缝纫臂上取下，然后浸入水中以去除多余的溶液，最后置于显微镜下，使用 40 倍物镜观察。玻璃微量移液管的尖端开口直径很小，约为一到两微米。然后将 sharpened 钨丝小心地插入微量移液管的后端，并使用机械显微操作器推动。钨丝需非常小心地穿过玻璃管末端。钨丝与玻璃之间必须紧密贴合，通常需要施加足够的压力，使少量玻璃断裂脱落。可在微电极的后端施加少量万能胶，以将钨丝固定在玻璃上。至此，电极制备完成，可使用金属电极阻抗测试仪测量其阻抗。通常我们寻找接近一兆欧姆的阻抗。然后将电极放入保护盒中妥善保存，因为电极非常脆弱。视觉刺激呈现在放置于可移动平台上的显示器上。使用加热毯来控制动物的体温，立体定位仪可实现对微驱动装置的粗略移动，如图所示。皮下导针屏蔽层中的金属套管以及记录电极可起到降低噪声水平的作用。将导针插入脑内，并使用微驱动装置通过导针缓慢下放电极。此处展示的是将金属套管降低到横杆上，横杆将放置在动物的颅骨上。导引针将如图所示从横杆下方伸出，金属套管与横杆之间的电接触有助于降低噪声水平。然后将动物放置在加热毯上。小心插入耳杆。此时重要的是确保头部保持水平。然后插入门齿杆，以确保头部在各个方向上都固定稳固。使用凡士林插入直肠探头。该探头用于测量体温，并据此控制加热毯的温度。体温应维持在36至37摄氏度之间。插入单导联心电图电极至皮肤，以监测心率，心率通常约为每分钟300次。心率是评估麻醉深度的良好指标。动物的生命体征通过定制软件持续监测。这些指标包括血压、二氧化碳分压、体温和心率。随后去除颅骨顶部的皮肤，暴露颅骨。必须彻底清洁颅骨，以便观察用于定位视交叉的颅骨标志。然后安装横杆组件。该组件用于在颅骨上

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神经科学

单机在体内</em从大鼠视交叉>录音

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小鼠视网膜经视网膜电图记录：视杆细胞与视锥细胞的光反应

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离体视网膜电图（ex vivo ERG）可用于直接记录动物或人离体完整视网膜中视网膜细胞的电活动。本文展示了如何改造常用的活体视网膜电图（in vivo ERG）系统，以用于离体视网膜电图（ex vivo...

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我们展示了在清醒大鼠中进行手术植入和记录程序，以测量来自眼睛（视网膜电图）和大脑（视觉诱发电位）的视觉电生理信号，该方法更接近人类情况，因为记录过程无需麻醉，避免了麻醉带来的干扰。...

清醒大鼠无线视网膜电图和视觉诱发电位的植入与记录

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