Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare le cellule neurali ad alta risoluzione Nell'embrione di pesce zebra in primo luogo, la proteina fluorescente verde mirata alla membrana codificante il DNA viene iniettata in un embrione di pesce zebra in uno stadio cellulare, che si traduce in un'eredità a mosaico, consentendo così un migliore imaging delle cellule sparse. Gli embrioni vengono quindi immunomarcati con anti GFP e sezionati, consentendo la visualizzazione della morfologia delle singole cellule ad alta risoluzione in una preparazione fissa. In alternativa, gli embrioni vivi possono essere esaminati utilizzando la microscopia video time-lapse per visualizzare la dinamica cellulare.

Si ottengono risultati che mostrano la morfologia o la dinamica cellulare. Qui, il cervello posteriore del pesce zebra viene ripreso con la microscopia confocale. Ciao a tutti.

Sono PR Chandran del laboratorio della dottoressa Rachel Brewster nel dipartimento di scienze biologiche dell'Università del Maryland della contea di Baltimora. Oggi vi mostreremo una procedura per etichettare e visualizzare le cellule neurali nell'embrione di zebrafish a una risoluzione più elevata. Di solito usiamo questa procedura in laboratorio per studiare i meccanismi della neurorelazione nell'embrione di pesce zebra a livello cellulare.

Quindi iniziamo. Luogo bagnato. Kim pulisce il bordo di una capsula di Petri da 100 millimetri.

Fissare con cura un ago per microiniezione di vetro su una striscia di cera all'interno del piatto umidificato. Sotto uno stereomicroscopio da dissezione, allineare l'ago contro un vetrino graduato. Per ottenere una punta della dimensione appropriata, utilizzare una lama di rasoio pulita per picchiettare delicatamente l'ago dove ha un diametro di un micrometro.

Collegare l'ago alla pipetta dell'apparecchio per microiniezione, 0,5 microlitri di una soluzione di rosso fenolo e acqua su una pellicola para e riempire frontalmente l'ago dalle goccioline. Impostare la pressione di microiniezione a sette chili di pascal e iniziare con un impulso di 20 millisecondi Contare il numero di impulsi necessari per erogare tutto il liquido. Variare il tempo tra 10 e 30 millisecondi in modo che siano necessari circa 250 impulsi per l'erogazione.

0,5 microlitri di soluzione. Utilizzare una micropipetta per riempire l'ago con 0,5-1 microlitro di MG FPD NA in acqua, mescolato con rosso fenolo per la visualizzazione. Coprire il piatto umidificato per evitare l'evaporazione della soluzione dall'ago sotto lo stereomicroscopio.

Posizionare uno stadio cellulare separare gli embrioni di pesce in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita di embrione. Medio. Usa una pinza sottile per afferrare delicatamente il Corian e stabilizzare l'embrione. Spostare l'ago riempito con MGFP e rosso fenolo nell'area target per l'iniezione.

Per un'ampia gamma di espressioni di MGFP, iniettare nel tuorlo o nel citoplasma. Utilizzare l'apparecchio per microiniezione per erogare circa due nanolitri della soluzione MGFP. Osservare la posizione dell'indicatore rosso fenolo per confermare la corretta iniezione.

Rimuovere con cautela l'ago dall'embrione. Iniettare tutti gli embrioni nella capsula fino a 30 embrioni contemporaneamente. Evitare di esporre gli embrioni alla luce, incubare a 28,5 gradi Celsius per consentire agli embrioni di svilupparsi allo stadio desiderato sotto lo stereomicroscopio.

Usa una pinza fine per staccare delicatamente il Corian dagli embrioni. Utilizzare una pipetta per pasta per rimuovere il corian vuoto dal piatto, lasciando solo gli embrioni rivestiti di dec. Utilizzare una pipetta per pasta lucidata a fuoco per trasferire gli embrioni rivestiti iniettati in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Rimuovere quanto più terreno in eccesso possibile, quindi aggiungere un millilitro di ativo. Lavare gli embrioni a temperatura ambiente una volta XPB S3 volte per cinque minuti ciascuna. Sposta gli embrioni in una capsula di Petri riempita con un XPBS sotto lo stereomicroscopio.

Usa una pinza fine per tenere l'embrione vicino alla regione della coda. Usa un secondo set di pinze o un attizzatoio per cercare di rimuovere quanto più yo possibile senza toccare la regione del telaio posteriore. Guardando sotto lo stereomicroscopio, usa la pinza fine per sollevare l'embrione dal piatto e inserirlo in uno stampo di sezionamento riempito con il 4% di punto di fusione basso. Aros.

Posiziona l'embrione verso un'estremità dello stampo. Lasciare solidificare gli aros a temperatura ambiente. Utilizzare una spatola per rimuovere il blocco aros indurito dallo stampo con un sollevamento della lama tagliare uniformemente l'estremità inferiore del blocco.

Utilizzare una goccia di super colla per ancorare il blocco al palco del vibrato, con il lato tagliato verso il basso, se lo si desidera. Allinea più blocchi sul palco. Attacca il tavolino al vibrato.

Assicurati che la lama tagli completamente ogni embrione, ma non completamente attraverso il blocco. Riempi il livello con una sezione XPBS. Gli embrioni vengono tagliati con cura sul retro di un blocco di arou e lo trasferiscono in una capsula di Petri riempita con un XPBS.

Separare le sezioni sotto lo stereomicroscopio. Utilizzare una pinza fine per posizionare le sezioni desiderate in una capsula a più pozzetti riempita con un XPBS. Usa un pozzetto diverso per ogni embrione.

Colorare le sezioni con DPI e immuno label con anti GFP. In caso contrario, eseguire l'imaging entro 48 ore. Monta fino a sei sezioni per vetrino e posiziona un vetrino coprioggetto sopra le sezioni per l'imaging confocale.

Conservare le diapositive al buio per evitare lo sbiancamento delle foto. L'imaging dal vivo, gli embrioni iniettati MGFP devono essere protetti dalla luce. Usa il forcipe per rivestire gli embrioni 30 minuti prima che raggiungano lo stadio di sviluppo desiderato.

Trasferire gli embrioni rivestiti in una soluzione sedativa di terreno embrionale con 0,01% di trica incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Una goccia di pipetta dell'1% è lieta in acqua su un piatto di coltura con fondo di vetro da 35 millimetri in modo che riempia lo stampo. Lasciare solidificare gli agro.

Utilizzare il tubo capillare di vetro da 90 millimetri per praticare tre fori nella goccia di aros sotto lo stereomicroscopio. Esaminare il fondo del pozzetto e rimuovere eventuali residui di aros con una pinza. Riempire il piatto con il terreno embrionale sotto lo stereomicroscopio.

Usa una pipetta per pasta per trasferire un embrione in ogni foro dell'aros. Usa una pinza fine per orientare l'embrione in modo che l'area di interesse, in questo caso la testa dorsale, sia appoggiata al vetro. Coprite il piatto.

Trasportare con cura la piastra sul tavolino di un microscopio confocale. Usa i riscaldatori d'ambiente per mantenere gli embrioni a 28,5 gradi Celsius durante l'imaging. Ecco una sezione attraverso il cervello posteriore di un embrione di tipo selvatico a quattro o cinque somiti, doppiamente marcato con GFP mirata alla membrana in verde e D in blu, solo una cellula è marcata con GFP legata alla membrana, consentendo l'imaging ad alta risoluzione della morfologia e dell'organizzazione cellulare.

Questa è un'immagine comparabile del cervello posteriore di un mutante nardi din per cinque somiti. Questa immagine rivela che le cellule dei nardi e dei mutanti non riescono a orientarsi correttamente verso la linea mediana durante la neurorivelazione. A differenza del metodo per marcare le cellule con MGFP, l'etichettatura del rombencefalo con un marcatore generale della superficie cellulare come la beta-catenina non consente di visualizzare la morfologia delle singole cellule.

L'imaging time-lapse del cervello posteriore di un embrione marcato con MG FP rivela che i comportamenti cellulari che guidano la relazione neurologica nel pesce zebra sono molto dinamici e coinvolgono l'estensione delle sporgenze della membrana mentre le cellule migrano e si intercollano. Vi abbiamo appena mostrato come preparare embrioni di pesce zebra sia fissi che vivi per l'imaging di singole cellule ad alta risoluzione. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.