Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- I et rør, der indeholder M9 buffer, indsamle op til 150 hermafrodit orme på det ønskede udviklingsstadium. Fjern bakterier fra ormene ved vask med M9 buffer og centrifuging prøven.
Se røret under et dissekerende mikroskop, når du fjerner supernatanten for at forhindre tab af prøve. Overfør ormene til en glasskål med et minimalt volumen M9-buffer. Tilsæt levamisole for at bedøve ormene.
Find ormens og svælgets hoved eller foregut, som indeholder to pæreformede strukturer. Brugte to nåle til at skære gennem ormen bag svælget. Sørg for, at du afslutter dissektionen hurtigt for at undgå at påvirke vævet.
Når neglebåndet er forstyrret, udstråles eller skubbes de to gonadarme ud af kroppen på grund af ormens indre tryk.
I dette eksempel vil vi dissekere gonads fra voksne orme til immunfluorescensanalyse.
- Pick 100 til 150 orme på det ønskede udviklingsstadium og samle dem i en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder 100 mikroliter af M9 buffer. Derefter fylde mikrocentrifuge rør med 900 flere mikroliter af M9 buffer og centrifuge det ved 1.000 gange g i 1 minut ved stuetemperatur.
Under et dissekerende mikroskop skal du forsigtigt fjerne 900 mikroliter af M9-bufferen. Gentag derefter vasken to gange mere for at fjerne de fleste af de vedhæftede bakterier.
Dernæst ved hjælp af en 200-microliter micropipette spids med en udvidet boring, overføre orme i 100 mikroliter af M9 buffer til en flad bund glas ur parabol. Derefter tilsættes 1 til 3 mikroliter af 0,1 molar levamisole til fadet og hvirvle det forsigtigt. Nu, vedhæfte to 25-gauge nåle til to sprøjter til at gøre en dissekering værktøj til hver hånd.
Under et dissekerende mikroskop skal du placere hver nål under og over hver orm og lave et fint snit på hver orm nær den anden svælgpære ved hjælp af en saks som bevægelse. Skær alle dyrene mindst en gang alle inden for fem minutter, for at levamisolen forbliver effektiv.
- Det er meget vigtigt, at dissektionen af dyrene i skålen er afsluttet på under fem minutter.
- Hvis en ekstruderet gonad ikke er synlig, skal du bare springe over det dyr.
