Fire-vejs Olfactometer Assay: En metode til at vurdere Lugt-Cued Svar i Drosophila

- En fire-vejs olfactometer er et lukket kammer med envejs-havne på hvert hjørne, hvorigennem det kan levere op til fire lugte, skabe kvadranter med forskellige lugt profiler. Begynd et eksperiment ved at overføre vågen fluer ind i kammeret. Undgå anæstesi, da dette kan påvirke deres adfærd under forsøget.

Udsæt fluerne for ren luft og observere deres bevægelser for at sikre, at ingen lugtstoffer forurener olfactometeret og påvirker flyveadfærden. Derefter forbereder testlugtanterne i separate hætteglas og forbinder dem til hovedkammeret gennem envejsportene.

Fluer har en tendens til at undgå kvadranter med frastødende lugte, mens de bevæger sig mod og bosætter sig i kvadranter med attraktive lugte.

I den følgende protokol vil vi bruge et firekvadrant olfactometer med et luftleveringssystem til at analysere flyveadfærd som reaktion på ethylpropionat, et afvisende lugtstof og æblecidereddike, hvilket er attraktivt.

- Mindst fem minutter i forvejen skal du tænde for temperaturregulatoren og indstille den til 25 grader Celsius. Derefter skal du forbinde lugtkamrene til arenaen via et plastrør. Kontroller luftstrømmen i hver kvadrant af arenaen ved hjælp af en elektronisk flowmåler. Sørg for, at kontrol- og lugt- og luftstrømmene begge kører med 100 milliliter i minuttet.

- Fluer er meget følsomme over for luftstrømmen, og det er afgørende, at luftstrømmen for hver kvadrant verificeres før hvert eksperiment.

- Rengør nu arenaen og glaspladerne ved hjælp af 70% ethanol. Tør alle delene ned to til tre gange og lad dem lufttørre fuldt ud, før du fortsætter. Næste, klem glaspladerne til arenaen. Overfør derefter fluerne ind i arenaen uden anæstesi. Brug tyngdekraften, lad dem komme ind gennem hullet i en af glaspladerne og dæk derefter hullet med et cirkulært net.

Placer nu den fluebelastede arena i det lysekammer.

Efter akklimatiseringsperioden skal du køre et 5 til 10 minutters kontroleksperiment, hvor fluer udsættes for fire kontrolluftstrømme. Det er vigtigt at nu analysere dataene med det samme. Hvis fluerne ikke er jævnt fordelt i arenaen, skal arenaen nulstilles.

- Det er afgørende at teste adfærd kontrol fluer til bare ren luft. Dette vil hurtigt kontrollere, at alle baggrundsforhold er normale. Utætte lys, temperatur ubalance, vippes arena, eller en lugt forurening kan alle forårsage problemer.

- Kassér om nødvendigt fluerne og rengør arenaen igen. Hvis der er mistanke om en lugtforurening, skal du udskifte alle slangen. Fortsæt med at gentage kontroltesten med nye kohorter, indtil dyrene ikke viser nogen præference for nogen af de fire kvadranter. Derefter skal du forbinde testlugtkammeret til opsætningen ved hjælp af en trevejsventil eller tilslutte slangen igen og køre et testeksperiment i 5 til 10 minutter.

Mellem test, kassér fluerne, rengør arenaen og glaspladerne med 70% ethanol, og udskift stikrørene. Hold den tørre luftstrøm i gang. For effektivitet er det godt at have to arenaer, så rengøring kan udføres under løb.

- Hvis der køres flere forsøg samme dag, skal du være yderst omhyggelig med at sikre, at der ikke efterlades lugt i systemet fra et tidligere løb. Dette er normalt ikke et problem med lave koncentrationer af lugtstof eller med CO2. Men for stærkt koncentrerede stimuli kan der være behov for op til en 24-timers forskel mellem eksperimentkørsler.