Saggio olfattometro a quattro modi: un metodo per valutare le risposte di Odorant-Cued in Drosophila

- Un olfattometro a quattro strade è una camera chiusa con porte unidirezioni ad ogni angolo, attraverso la quale può fornire fino a quattro odori, creando quadranti con profili di odore distinti. Iniziare un esperimento trasferendo le mosche sveglie nella camera. Evitare l'anestesia, in quanto ciò può influire sul loro comportamento durante l'esperimento.

Esporre le mosche all'aria pulita e osservare i loro movimenti per assicurarsi che nessun odore contamini l'olfattometro e influenzi il comportamento della mosca. Quindi, preparare gli odori di prova in fiale separate e collegarli alla camera principale attraverso le porte di sola senso. Esporre le mosche agli odoranti per un periodo predefinito, rimuovendo lo stimolo dopo la fine dello studio.

Nel seguente protocollo, useremo un olfactometro a quattro quadranti con un sistema di erogazione dell'aria per analizzare il comportamento della mosca in risposta al propionato di etile, un odorante repellente e aceto di sidro di mele, che è attraente.

- Con almeno cinque minuti di anticipo, accendete il regolatore di temperatura e impostatelo su 25 gradi Celsius. Quindi, collegate le camere odoranti all'arena tramite un tubo di plastica. Controllare la portata d'aria in ogni quadrante dell'arena utilizzando un misuratore di portata elettronico. Assicurarsi che il controllo, l'odore e i flussi d'aria siano entrambi funzionanti a 100 millilitri al minuto.

- Le mosche sono molto sensibili al flusso d'aria ed è fondamentale che il flusso d'aria per ogni quadrante sia verificato prima di ogni esperimento.

- Pulire l'arena e le lastre di vetro utilizzando il 70% di etanolo. Pulire tutte le parti da due a tre volte e consentire loro di asciugarsi completamente all'aria prima di procedere. Successivamente, fissare le piastre di vetro all'arena. Quindi, trasferire le mosche nell'arena senza anestesia. Utilizzando la gravità, lasciarle entrare attraverso il foro in una delle piastre di vetro, quindi coprire il foro con una rete circolare.

Ora, posizionare l'arena a carico di mosca nella camera leggera. Quindi collegare i quattro flussi d'aria di controllo a ogni angolo dell'arena. Chiudere la porta della camera e lasciare che le mosche si acclimatino al nuovo ambiente per 10-15 minuti.

Dopo il periodo di acclimatazione, eseguire un esperimento di controllo da 5 a 10 minuti in cui le mosche sono esposte a quattro flussi d'aria di controllo. È essenziale analizzare immediatamente i dati. Se le mosche non sono distribuite uniformemente nell'arena, l'arena deve essere ripristinata.

- È fondamentale testare il comportamento delle mosche di controllo solo per pulire l'aria. Ciò verificherà rapidamente che tutte le condizioni di fondo siano normali. La perdita di luce, lo squilibrio di temperatura, l'arena inclinata o una contaminazione da odore possono causare problemi.

- Se necessario, scartare le mosche e pulire di nuovo l'arena. Se si sospetta una contaminazione da odoro, sostituire tutti i tubi. Continuare a ripetere il test di controllo con nuove coorti fino a quando gli animali non mostrano alcuna preferenza per nessuno dei quattro quadranti. Collegare quindi la camera di odoro di prova all'impostazione utilizzando una valvola a tre vie oppure ricollegare i tubi ed eseguire un esperimento di test per 5-10 minuti. Per registrazioni sperimentali più lunghe, arrestare e riavviare rapidamente il programma di tracciamento ogni 20 minuti oppure i file di dati saranno troppo grandi.

Tra un test e l'altro, scartare le mosche, pulire l'arena e le lastre di vetro con il 70% di etanolo e sostituire i tubi del connettore. Mantenere il flusso d'aria secca andando a scaricare continuamente il sistema. Per garantire l'efficienza, è bene avere due arene in modo che la pulizia possa essere eseguita durante le corse.

- Se più esperimenti vengono eseguiti lo stesso giorno, prestare estrema attenzione per assicurarsi che non venga lasciato alcun odore nel sistema da una corsa precedente. Normalmente questo non è un problema con basse concentrazioni di odore o con CO2. Ma per stimoli altamente concentrati, può essere necessario un intervallo di 24 ore tra le esecuzioni degli esperimenti.