Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til at begynde med overføre unge voksne orme på en frisk agarose pad på et dias. Derefter tilsættes et par dråber af 12 millimolar levamisole løsning til at lamme orme.
Epidermis af en voksen orm er en tynd enkeltlagsstruktur bestående af multi-nukleeret syncytia, der skyldes cellefusionshændelser. Den apikale overflade af epidermis udskiller en fleksibel kollagen kutikula, mens den basale overflade er dækket af et tyndt lag ekstracellulær matrix kaldet basal lamina.
Dernæst sår den apikale overflade af epidermis med en laser. Cytoplasma fra de beskadigede celler kan lække ud, fremstår som en boble på såret stedet.
Laserbestråling har en fordel i forhold til andre teknikker, såsom nålesår, da det forårsager lokaliseret forstyrrelse af kutikula og epidermale celler uden at beskadige indre væv. I eksempelprotokollen vil vi se processen med lasersår i C. elegans.
- For præcist at såre nematoder, denne protokol bruger en femtosecond laser knyttet til spinning disk confocal mikroskop. Linje eller punkt scanninger ved hjælp af femtosecond lasere, som dem i to-foton mikroskoper, bør også være tilstrækkeligt.
- Begynd med at samle 10 unge voksne på en agar pad. Lamme dem i en to microliter dråbe af 12 millimolar levamisole løsning. Derefter dække dem med et dæk slip og vente et par minutter, mens de lammer.
- Det er vigtigt, at et dyr er fuldstændig lammet.
- Sørg for, at femtosekund lasereffekten er indstillet til 140 milliwatt, målt før målet, og laser gentagelseshastigheden er på 80 megahertz. Nu skal du finde ormene under en roterende disk confocal mikroskop. Brug en 100x mål med en høj numerisk blænde, fokusere på den laterale forreste eller bageste syncytial epidermis af målet ormen.
Fokus på den apikale overflade af den epidermale celle, skinne laseren i to 200 millisekund pulser adskilt af 20 millisekunder. Dette bør være tilstrækkeligt til at såre epidermis. Vent et øjeblik og observere den lokale forstyrrelse af cytoplasma, som vil fremstå som boblende. Hvis en fluorescerende markør er til stede, lokaliseret blegning kan observeres.
