Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Enjeksiyona hazırlanmak için, bir agarose ped üzerine halokarbon yağı izi bırakmak için bir solucan seçimi kullanın. Solucanları yağa yerleştirin ve nazikçe agar pedine iterek hareketsiz hale getirin. Yağın hayvanları tamamen kapladığından emin olun.
İğneyi kütikülden hafifçe itin ve gonad koluna nükleik asit veya ilgi bileşiği enjekte edin. Her gonad kolu, bireysel oositlere dönüşecek bir germline syncytium içerir. Distal gonad içine enjekte edilen malzeme bu oositlere dahil edilecek ve gelecek nesli etkileyecektir.
Solucanları enjekte ettikten sonra, yağı M9 tamponu ile değiştirin. Solucanlar hareket etmeye başladıktan sonra, bakteriyel yiyeceklerle bir NGM agar tabağına aktarın. Aşağıdaki protokolde, gonad mikroenjeksiyon yöntemi, dpy-10 genini hedeflemek ve düzenlemek için bir Cas9 kompleksi sunmak için kullanılır.
- Metin protokolünde açıklandığı gibi C. elegans ve agarose pedlerinin hazırlanmasıyla başlayın. Bir diseksiyon kapsamına bir agarose enjeksiyon pedi ve kapak kayması yerleştirin. Pedin bir kenarı boyunca küçük bir halokarbon yağı izi döşemek için bir solucan çekme kullanın. Daha sonra, NG agar plakasından ve yağ paletine birkaç solucan kaldırmak için yağla kaplanmış solucan çekmesini kullanın. Kirpik veya kedi bıyık gibi bir pipete bağlı ince bir saçla, solucanları agarose pedine hafifçe iterek paralel olarak konumlandırın. bir seferde bir solucan monte edin ve enjekte edin.
Bir kez yerleştirildikten ve pedlere bağlandıktan sonra, solucanları solucan çekmenin ucundan birkaç damla halokarbon yağı ile kaplayın.
Yüksek bir büyütmeye geçin ve iğneyi gonad koluna bitişik olarak, orta ila geç pachytene çekirdek yakınındaki bölgeye karşılık gelen yeniden konumlandırın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi solucana doğru hareket ettirin, kütiküle hafifçe bastırın. Sonra, bir elinizle, iğneyi kütikülden geçirmek için mikroskop aşamasının yanına dokunun. Enjeksiyon pedalını veya düğmesini bastırın, enjeksiyon karışımı ile gonad koluna yavaşça doldurun ve iğneyi çıkarın.
Solucanlar enjekte edildikten sonra, agarose pedideki örtüyü çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Çekilmiş bir kılcal pipet kullanarak, üzerlerine bir M9 tamponu pipetleme yaparak yağı solucanlardan çıkarın. Solucanları agardan serbest bırakmak için bu tedaviyi gerçekleştirin. 10 dakika sonra, solucanlar tamponda çırpınırken, çekilen kılcal pipet kullanarak OP50 bakterisi olan bir NG agar plakasına taşıyın. Solucanlar iyileşene ve hareket edene kadar plakayı iki ila üç saat boyunca 20 santigrat dereceye yerleştirin. OP50 ile agar plakaları Daha sonra plakaları 25 santigrat derece inkübatöre aktarın.
