Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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लेंटीवायरस एक रेट्रोवायरस है जिसमें आरएनए जेनेटिक सामग्री होती है। यह वायरस कैंसर सेल लाइनों के लिए ट्रांसजीन शुरू करने का एक कुशल और स्थिर तरीका प्रदान करता है। एक ट्यूब में न्यूरामीडास जोड़कर शुरू करें जिसमें लेंटीवायरस होता है जो हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जीएफपी को व्यक्त करता है। वायरस की बाध्यकारी दक्षता बढ़ाने के लिए ट्यूब को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
इसके बाद, एक गोली बनाने के लिए ट्यूमर सेल निलंबन युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र करें। कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए पॉलीब्रेन युक्त मैमोस्फीयर मीडिया जोड़ें। पॉलीब्रेन एक cationic बहुलक है जो लेंटीवायरल संक्रमण दक्षता को बढ़ाता है। अब एक छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से ट्यूमर कोशिकाओं की इष्टतम संख्या प्लेट । संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में लेंटीवायरस की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
सामग्री मिश्रण करने के लिए प्लेट को भंवर करें, और कार्बन डाइऑक्साइड की निरंतर आपूर्ति के साथ 96 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लेंटीवायरस सेल में प्रवेश करता है और आरएनए जारी करता है। वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज आरएनए को डबल फंसे डीएनए में परिवर्तित करता है जो मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है । प्लेट को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और सफल लेनदेन के लिए कोशिकाओं की निगरानी करें। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण ट्रांसड्यूड कोशिकाएं फ्लोरोरेस होती हैं।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम लेंटीवायरल वैक्टर के साथ पीडीएक्स-अलग ट्यूमर कोशिकाओं का लेनदेन करेंगे।
ट्यूमर कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, मैमोस्फीयर माध्यम के दो मिलीलीटर में पुनः पेंशन के लिए अलग कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। गिनती के बाद, कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र करें और मैमोस्फीयर माध्यम के दो मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें, पॉलीब्रेन के 20 माइक्रोलीटर के साथ पूरक। इसके बाद, प्लेट 2 बार 10 से पांचवें व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं को एक अल्ट्रा कम पालन छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट और 10 के संक्रमण की बहुलता पर कोशिकाओं को Lentiviral कणों में ।
कोशिकाओं के साथ वायरस मिश्रण और ३७ डिग्री सेल्सियस और ५% कार्बन डाइऑक्साइड पर ९६ घंटे तक के लिए सह संस्कृतियों इनक्यूबेट, पहले 24 घंटे के बाद ताजा मैमोस्फीयर माध्यम के ५०० माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए थाली भंवर । जब कम से कम 10% कोशिकाएं जीएफपी सकारात्मक होती हैं, तो कम से कम एक अच्छी तरह से बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंकु नली में ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और मैमोस्फीयर माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं।
कोशिकाओं के साथ धोने पूल और HBSS प्लस HEPES के 10 मिलीलीटर में ट्यूमर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । अंत में, बर्फ पर बेसमेंट मैट्रिक्स निकालने के 50 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और एम्बेडेड कोशिकाओं को पुनर्रोपण के लिए 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में लोड करें।
