Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
ראשית, מניחים רפידות שומן או MFPs בצלחת עם פתרון טריפסין-EDTA ודגרת למשך הרצוי כדי לשבור את הידבקויות מטריצת התא. לשטוף את MFPs עם מים deionized ומתח דרך מסננת. מניחים רקמות במזווה עם בר ערבוב ומוסיפים טריטון X-100. מערבבים כדי ליזות תאים מבלי להשפיע על גורמי הגדילה במטריצה החוץ תאית של הרקמה.
מסננים את ה- MFPs ושוטפים במים שעברו דה-אוניזציה. מעבירים רקמות בחזרה אל הכף, ומוסיפים חומצה deoxycholic כדי lyse התאים הנותרים. לאחר מכן, מסננים את ה- MFPs ומניחים בכומתה המכילה מים שעברו דה-אוניזציה עם פניצילין-סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. דגירה הכומתה ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
מסננים MFPs ומניחים אותם לתוך כיף המכיל אתנול וחומצה peracetic. החומצה peracetic מגביר את הנוקשות של המטריצה החוץ תאית של הרקמה. מערבבים זמן מה וחוזרים על הצעד המאמץ. לשטוף את MFPs עם PBS ולאחר מכן עם מים deionized. העבר את ה- MFPs המתוחים למזווה המכיל פרופאן-1-ol.
מערבבים במשך זמן מה, מסננים את התוכן, ושוטפים MFPs עם מים deionized. יבש את ה-MFPs ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. בפרוטוקול הבא, נבצע את decellularization של רפידות שומן mammary מורין.
ראשית, למקם את MFPs במנות שישה סנטימטרים עם חמישה מיליליטר של פתרון טריפסין-EDTA. לרסס ולנגב את הכלים עם 70% אתנול דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. השתמש מסננים 0.7 מילימטר לשטוף את MFPs עם מים deionized על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין שוטף.
לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. מניחים את הרקמות המיובשות בכומתה טרום אוטוקלאב המכילה מוט ערבוב בגודל מתאים, ומכסים את הרקמות עם 60 מיליליטר של 3% t-octylphenoxy polyethoxyethanol לכל גרם של רקמה. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לזרוק את תכולת הכוואות לתוך מסננת.
לשטוף את הכומתה עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני בין שטיפות. לאחר מכן, לייבש לזמן קצר את הרקמה על משימה עדינה לנגב ולשקול. מניחים את הרקמות ואת הסורגים מערבבים בחזרה לתוך אותם כוסות לכסות אותם עם 60 מיליליטר של 4% חומצה deoxycholic לכל גרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה.
לאחר מכן, השליכו את תכולת הכוויה לתוך מסננת רשת. לשטוף את הכומתה עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני בין שטיפות. לייבש בקצרה את הרקמה שטף על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו.
מניחים את הרקמות המיובשות לתוך אותו כיף יחד עם מים deionized טרי בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין. מכסים את הכומתה בחוזקה בסרט פרפין ומשאירים ב 4 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לנקז את תכולת הכף לתוך מסננת. לייבש לזמן קצר את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לאחר מכן, הניחו את ה- MFPs באותה מזווה עם מוט ערבוב בגודל מתאים.
מכסים את הרקמה עם 60 מיליליטר של פתרון המכיל 4% אתנול ו 0.1% חומצה peracetic לכל גרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. השלך את תכולת הכומתה למסננת של 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני ומניחים את התוכן בחזרה לתוך הכומתה. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של 1X PBS לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה פעם נוספת. לאחר מכן, השליכו את תכולת הכומתה למסננת של 0.7 מ"מ. באמצעות מלקחיים, לעסות את הרקמה באופן ידני ומניחים את התוכן בחזרה לתוך הכומתה. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה פעם נוספת. לייבש לזמן קצר את הרקמה שטף על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת ולהשתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. מניחים את התוכן בחזרה לתוך הכף ומכסים את הרקמות עם 60 מיליליטר של 100% n-propanol לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לייבש לזמן קצר את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת 0.7 מילימטר ולהשתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. מניחים את התוכן בחזרה לתוך הכף ולשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על תהליך שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, לייבש לזמן קצר את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. להעביר את הרקמה לצינור שכותרתו 15 מיליליטר להקפיא ב שלילי 80 מעלות צלזיוס לילה.
