Name: 在原位议定书蝴蝶蛹使用Riboprobes翼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学习使用核糖核酸探针对Bicyclus anynana蝴蝶蛹翅进行原位杂交的优化方案。该方法可精确检测蛹期不同时间点的基因表达模式，为鳞翅目发育生物学研究提供可靠技术框架。

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感谢 Jayne Selegue、Margaret Hollingsworth、Jin Berry、Ryo Futahashi、Najmus Sahar Mahfooz、Aleksandar Popadic、Bob Reed 以及 Roche 技术支持团队在本实验方案问题排查过程中提供的帮助。同时感谢 William Piel 对视频编辑提供的建议。

第1天
<ol>
<li>配制以下溶液：
<ul>
<li>10× PBS</li>
<li>1× PBS</li>
<li>1× PBT</li>
<li>ddH2O
<ul>
<li>加入 DEPC 至终浓度为 0.1%，并剧烈振荡溶液。&nbsp;</li>
<li>高压灭菌。</li>
</ul>
</li>
<li>4% 多聚甲醛固定液 — 使用 PBS-DEPC 配制</li>
<li>蛋白酶 K 溶液 — 若出现沉淀，取样前需剧烈涡旋混匀</li>
<li>消化终止缓冲液</li>
<li>预杂交缓冲液</li>
<li>50:50 PBT:预杂交缓冲液</li>
<li>杂交缓冲液
<ul>
<li>所有溶液应保持无 RNase 状态。使用经烘烤处理（250°C 烘烤 4 小时）的玻璃器皿或一次性塑料器皿。血清移液管在配制溶液时非常有用</li>
</ul>
</li>
</ul>
</li>
<li>在 PBS 中解剖特定发育时间点的蛹翅</li>
<li>将翅组织直接转移至 24 孔培养板的孔中，加入固定缓冲液，于室温下进行固定</li>
<li>固定组织 2 小时</li>
<li>用 PBT 洗涤 5 次，每次 5 分钟</li>
<li>将翅组织在蛋白酶 K 溶液中孵育 3 分钟</li>
<li>用消化终止缓冲液冲洗 2 次</li>
<li>用 PBT 洗涤 5 次，每次 5 分钟</li>
<li>用 50:50 PBT : PHB 洗涤 2 次，每次 5 分钟</li>
<li>用 PHB 洗涤 1 次，持续 10 分钟</li>
<li>在 55°C 下于 PHB 中孵育至少 1 小时</li>
<li>热变性 RNA 探针（每孔需 20–50 ng，80°C 处理 5 分钟），然后加入杂交缓冲液（每孔需 100 μl）</li>
<li>将探针加入各孔中，在 55°C 下孵育 48 小时&nbsp;</li>
</ol>
第3天
<ol>
<li>用 PHB 在 55°C 下洗涤 4 次，每次 5 分钟</li>
<li>在 55°C 的 PHB 中孵育过夜</li>
</ol>
第4天
<ol>
<li>配制以下溶液：
<ul>
<li>抗体封闭缓冲液</li>
</ul>
</li>
<li>在 50:50 PBT : PHB 中洗涤 1 次，每次 5 分钟</li>
<li>在 PBT 中洗涤 4 次，每次 5 分钟</li>
<li>将翅在封闭缓冲液中 4°C 孵育 1 小时</li>
<li>将翅在 1:2000 稀释的抗-Dig 抗体溶液中 4°C 过夜孵育</li>
</ol>
第5天
<ol>
<li>准备以下溶液：
<ul>
<li>检测缓冲液</li>
</ul>
<ul>
<li>显色液——避光（用铝箔包裹）</li>
</ul>
</li>
<li>在室温下用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟</li>
<li>用 PBT 洗涤 7 次，每次 5 分钟</li>
<li>用检测缓冲液冲洗翅片 2 次</li>
<li>在 1 ml 显色液中显色——每次显色时间必须密切监测，即使使用相同的探针和显色液，显色时间也可能发生变化——通常在 5–10 分钟后开始检查，随后延长间隔，最长可过夜。未观察样品时，应将培养板用铝箔包裹以避免光照。</li>
<li>用终止显色缓冲液冲洗 5 次</li>
<li>封片保存翅片。</li>
</ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

现有方案的优化

已成功利用来自Precis coenia蝴蝶的幼虫翅盘进行原位杂交实验（Carroll等，1994；Keys等，1999；Weatherbee等，1999）。本实验方案改编自Carroll实验室提供的详细书面方案，该方案可应要求获取，用于幼虫翅染色。我们所做的修改旨在适应幼虫与蛹期翅组织之间的差异。在进行蛹后翅解剖时，应去除围膜，不得将其保留在反应孔中。与原方案相比，本方案中的初始固定时间更长，但省略了后续固定步骤。我们发现，蛋白酶K溶液需稀释10倍，以适应脆弱的蛹期翅组织，同时仍能保证探针有效渗透。此外，我们还发现，在抗体染色前对翅组织进行封闭可显著降低背景信号，而将抗体孵育时间延长至4°C下过夜则可增强信号强度。


应用

该实验方案具有多种应用。能够在发育中的蛹翅上定位候选基因的表达，是推断该基因在翅或翅型发育过程中发挥某种功能作用的第一步（Marcus 等，2004；Ramos 等，2006）。如果在其他系统中已知相互作用的多个基...

<table><tbody><tr><td>固定缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>4% 多聚甲醛溶于 PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0.1% Tween 20 溶于 PBS</td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液</td><td></td><td></td><td></td><td>2.5&amp;#109;g/ml 蛋白酶K溶于PBT</td></tr><tr><td>消化终止缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml 甘氨酸溶于 PBT</td></tr><tr><td>预杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>配制50 ml PHB：12 ml DEPC处理水 + 25 ml 甲酰胺 + 12.5 ml 20 x SSC + 50 µl Tween 20 + 500 µl 10 mg/ml 鲑鱼精DNA（无RNase，使用前经热变性处理）。</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>在预杂交缓冲液中加入1 mg/ml糖原</td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris（pH 6.8），150 mM NaCl，0.5% IGEPAL（NP40），5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>抗DIG抗体</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>碱性磷酸酶偶联</td></tr><tr><td>DIG洗涤与封闭缓冲液试剂盒</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount水性封片介质</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>封片介质</td></tr></tbody></table>

利用核糖探针进行蝴蝶蛹翅原位杂交的实验方案

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

本文以视频形式展示了利用核糖探针在蝴蝶Bicyclus anynana蛹翅中进行原位杂交的实验方案。原位杂交是发育生物学中的常用技术，可用于在转录水平研究发育组织中基因表达的空间和时间模式。当尚未开发出针对基因转录产物蛋白的特异性抗体，或基因组中存在多个高度同源的基因拷贝而现有抗体无法区分时，原位杂交可作为替代方法。尽管针对幼虫翅盘的原位杂交技术已在蝴蝶研究领域应用多年，但本方案已针对更大且更脆弱的蛹翅组织进行了优化。

为了研究眼蝶属（Bicyclus anynana）蛹期翅组织中的基因表达，我们提供了一种使用核糖探针进行原位杂交的优化实验方案。同时，我们还提供了该方案的进一步优化指南，以便将其应用于其他鳞翅目物种的蛹期翅组织。

本文以视频形式展示了利用核糖探针在蝴蝶Bicyclus anynana蛹翅中进行原位杂交的实验方案。原位杂交……

这是一项针对蛹期蝴蝶翅膀的染色方案。首先，我们从饲养笼中收集预蛹，将其放置在托盘上，然后通过延时摄影记录其精确的化蛹时间。这使我们能够在化蛹后的特定时间点进行染色处理。这一点很重要，因为不同的蛋白质对应的 mRNA 在交配后不同时间表达。在此，我们在含有硅胶基底的培养皿中解剖蛹翼，关键步骤是将蛹翼取出并放入固定液中，使其尽可能平整。如果在此阶段蛹翼不平整，则之后将永远无法变得平整。在适当的固定时间后，我们移除固定液并清洗五次。使用PBT时，蛋白酶处理步骤较为关键，该步骤用于通透组织，以便探针进入，因此必须通过这些漂洗和洗涤步骤在适当的时间终止反应。鲑鱼精子DNA可作为廉价的DNA来源，防止探针非特异性结合到组织各处。精子是预杂交缓冲液的组分之一。因此，这里我们将精子加入预杂交缓冲液中，随后将配制一种溶液，即1:50:50的P-B-T-P-H-B溶液，由等体积的PBT和预杂交缓冲液混合而成。该溶液作为中间溶液，用于将翅样本从其中浸泡的PBT溶液轻柔地转移至预杂交溶液中。因此，这里有一个中间步骤，翅膀最初将置于这种50 50溶液中。此时，翅膀在PHP中孵育10分钟，随后在55摄氏度下再次于PHP中孵育1小时。在此期间，我们将配制杂交缓冲液，即预杂交缓冲液与糖原的混合物。在此步骤中，我们将糖原加入 PHV 中，以配制少量杂交缓冲液。随后，我们将把变性的探针加入此缓冲液中。因此，我们正在预热一个加热金属块，同时离心在 -20°C 保存的探针，并将适量探针转移至离心管中，在 80°C 下变性约五分钟。此处我们同时变性两个探针，因此需将杂交缓冲液加入探针中，然后将 100 微升探针混合液分别加入每个孔中。为了完成此步骤，我们将使用封口膜覆盖所有孔，因为翅样本将在55摄氏度下继续孵育两天，而封口膜可防止蒸发。孵育两天后，通过用PHP溶液洗涤翅样本来去除探针，最后一次洗涤液需在翅样本上保留额外的12至24小时。最后，翅样本需经过一系列洗涤步骤，使其重新回到PBT溶液中。在此过程中，再次使用50:50混合溶液作为中间步骤。在此阶段，向翅样本中加入抗体封闭液，并将碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体加入PBT中，使其浓度约为1:2000。每孔将加入约300微升该抗体溶液，随后将翅样本置于冰箱中，4℃孵育过夜。次日，通过PBT进行一系列洗涤以去除未结合的抗体，然后在室温下用检测缓冲液将翅样本漂洗两次。最后，向每个孔中加入一毫升显影液，并迅速用铝箔覆盖翅膀。大约10分钟后，我们进行检查，发现翅膀开始呈现紫色，但颜色仍略浅。因此再次用铝箔覆盖，数分钟后再次检查，此时翅膀颜色已稍变深。请注意，经过不同探针孵育的翅在显色过程中变暗的速度略有不同，因此我们决定再次覆盖样本，最终在20分钟后使用显色终止缓冲液终止反应。此时翅已准备好进行封片，我们在已标记的载玻片上加入一滴封片介质，用镊子夹取翅并将其

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在原位议定书“蝴蝶蛹使用Riboprobes翼

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位...

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

通过结合RNA整体染色的方法 原位...

RNA 原位杂交在整装胚胎及细胞组织学中的应用：适用于海洋软骨鱼类

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