Name: 活体鼠脑微循环显微镜使用一个封闭的颅窗口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用活体显微镜技术观察小鼠脑部微循环动态变化的方法。通过植入慢性颅窗，研究人员可实时追踪血流动力学指标和炎症反应，为神经科学研究提供重要的在体成像手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予 LJMC 的资助，项目编号分别为 R01-HL87290、R01-HL87290-S1 和 R01-AI082610。

1. 开颅手术
需要提前对8至10周龄的小鼠进行开颅手术，操作步骤如前所述1，但不将钛棒植入动物头部。慢性颅窗是一种稳定的制备方法，可在植入后数月内持续观察软脑膜微循环。通常，我们在颅窗植入术后2至3周进行实验研究。
2. 活体显微成像
<ol>
 <li>开颅术后两到三周，检测小鼠体温，随后使用异氟烷进行轻度麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1-2%）。采用轻度麻醉旨在防止实验过程中动物产生应激反应和不适。</li>
 <li>动物随后被置于立体定位仪上，呈俯卧位，并使用耳杆仔细固定头部。通过左右杠杆调节水平。使用加热垫维持核心体温。由于患脑型疟疾的小鼠会出现低体温，因此需要针对每只动物调整温度设置。</li>
 <li>用浸有矿物油的棉签轻轻清洁颅窗上的盖玻片，借助体视显微镜和数码相机（Nikon Coolpix 995，日本）拍摄窗下血管的全景图像。将图像打印并标注标识与日期，用于后续测量血管直径和红细胞（RBC）流速时作为定位参考图。</li>
 <li>将小鼠转移至活体显微镜载物台（定制 Leica-McBain，加利福尼亚州圣地亚哥）。利用牙科丙烯酸树脂形成的凹槽，在颅窗上滴加一滴水，调节焦距。使用20倍水浸物镜（LUMPFL-WIR，数值孔径0.6，Olympus）进行测量。持续观察同一血管，以便与基线水平进行直接比较，从而在小样本群体中获得更可靠的统计结果。图像通过数字低照度高速相机（Hamamatsu C9300-221，日本）或低照度模拟相机（COHU 4815，加利福尼亚州圣地亚哥）采集，相机连接至录像带记录仪（JVC，日本）、时间戳设备（MicroImage Video Systems，宾夕法尼亚州博伊尔敦）和彩色监视器（PELCO，加利福尼亚州克洛维斯）。在开始录制前对录像带进行正确标识，时间戳可记录事件发生的时间段，便于后续识别所记录的事件。</li>
 <li>首先检查血管以评估制备质量，并确认血液是否在所有血管中流动。然后选择待测量的血管，应包括不同直径的微静脉和微动脉（在我们的小鼠软脑膜制备中，大多数血管直径介于20至80μm之间），并覆盖窗体暴露区域内不同位置的血管。通过观察血管分支处血流方向（即血流是向外分布还是向内汇集），可轻松区分微动脉与微静脉。在我们的研究中，共对12条血管进行测量。每个测量位点的精确位置均在软脑膜血管图像上标注。</li>
 <li>对于每个位点，使用图像剪切仪（Image Shear，Vista Electronics，San Diego，CA）测量血管直径。2选定位置后，将血管图像调整至垂直位置，并对图像进行剪切，直至相对的边缘对齐，记录此时的读数。通过使用测微尺校准台（Reticle Calibration Stage Micrometer，Edmund Optics Inc.，Barrington, NJ）对每种特定放大倍数进行预先校准，可将该数值转换为微米。</li>
 <li>每次记录至少持续30秒，以追踪红细胞。追踪时采集血液样本，使用羰基氰染料Dil（Molecular Probes，Carlsbad，CA）对红细胞进行荧光标记，并通过尾静脉输注，以获得 体内 浓度约为 0.4–0.5%3在感染的动物中 疟原虫伯氏疟原虫 表达绿色荧光蛋白的 ANKA（PbA）（PbA-GFP，由马里亚疟疾研究与参考试剂资源中心 MR4，Manassas, VA 提供，CJ Janse 和 AP Waters 捐赠），无需灌注标记细胞。视频图像以每秒 150 帧的速度记录。该速率设置旨在使每个视频帧中捕获一个至六个细胞图像，以测定最高达 8 mm/s 的细胞运动速度。视频图像通过个人计算机使用 Adobe Premier 4.0 软件进行数字化处理，并利用 SigmaScan Pro 4.0 软件（SPSS，Chicago, IL）获取每个细胞图像的 x-y 坐标数据。4细胞位置通过人工确定，而非图像分析，因为训练有素的观察者肉眼即可对细胞中心位置作出良好估计，该位置通常与大多数细胞取向下观察到的荧光最强位置相一致。对每个细胞进行多次位置和速度测定，并取平均值以获得红细胞平均流速。</li>
 <li>当离线进行红细胞流速测量时，每只小鼠的总观察时间不超过10–15分钟，以尽量减少麻醉对心脏的抑制作用。</li>
 <li>一旦获得血管直径和红细胞流速的测量值，即可使用以下公式计算每条血管中的血流量：Q = V × π(D/2)²2，其中 Q = 血流量，V = 红细胞流速，D = 血管直径。</li>
 <li>这些操作可随时间重复进行。例如，在小鼠脑型疟疾模型中，我们从感染后第4天开始进行每日测量。每只小鼠每天获得的数值均以第0天（感染前）为基准进行归一化处理，第0天的数值定义为100%。</li>
 <li>除了血管直径和血流测量外，还可进行其他评估，例如对灌注情况进行更精确的评估，以及分析白细胞和/或血小板在软脑膜血管中的滚动与黏附。这些测量可通过荧光标记物辅助完成。在疟疾研究中，还可利用表达GFP的PbA菌株检测循环或黏附的疟原虫。</li>
 <li>为评估灌注情况，我们使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的白蛋白溶液（Sigma，St Louis, MO，每只小鼠50 μg），为量化白细胞在软脑膜血管上的黏附，我们使用与德克萨斯红（TxR）标记的全白细胞标志物CD45抗体（Invitrogen，Carlsbad, CA，每只小鼠4 μg）。具体操作中，将25 μL白蛋白-FITC溶液（2 mg/mL）与20 μL抗-CD45-PE抗体溶液（200 μg/mL）混合后，注入预热的尾静脉。注射后可立即进行成像；但若需测量渗漏，则让白蛋白-FITC循环15分钟后再成像。白蛋白-FITC和GFP（PbA-GFP感染性红细胞）发射的绿色荧光（518 nm）通过ALPHA Vivid: XF100-2滤光片（Omega Optical, Brattleboro, VT）进行激发与采集，而抗-CD45-TxR荧光（615 nm）则使用Vivid Standard: XF42滤光片进行激发与采集。</li>
 <li>荧光标记的白蛋白可实现对血管网络（包括穿支血管）的更佳可视化，在脑型疟疾等疾病状态下，特别有助于检测无灌注或低灌注的血管。此外，该方法还可用于评估血管渗漏。5.</li>
 <li>荧光标记的抗CD45抗体可便于识别和定量白细胞在软脑膜血管上的滚动和黏附。为避免定量过程中的偏倚，我们在预先设定用于测量血流的同一位置进行白细胞滚动和黏附的定量。白细胞黏附的定量方法是在100 μm血管长度内计数白细胞的数量。白细胞滚动的定量方法是在30秒内，计数在同一100 μm血管长度中移动速度显著慢于血流速度的白细胞数量。</li>
</ol>
3. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="小鼠视网膜研究示意图、操作流程图解与视网膜成像，生物学研究。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 1"> 
图 1.（步骤 2.6） 通过颅窗观察到的小鼠软脑膜血管网络图像。
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="用于红细胞流速测量和白细胞黏附分析的显微镜装置示意图" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 2"> 
图 2.（步骤 3.1–3.5） 小鼠软脑膜微循环活体显微观察实验装置示意图。1：活体显微镜；2：20倍水浸物镜；3：光源；4a：数字低照度高速相机；4b：模拟相机；5：固定于立体定位架上的小鼠；6：计算机显示器；7：模拟剪切图像显示器，显示如何通过图像剪切法（箭头）测量血管直径。
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="用于追踪颗粒运动的连续显微图像；显示时间序列中的六个阶段 A-F。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 3"> 
图 3.（步骤 3.6–3.8） 通过高速荧光录像中红细胞的追踪测量微血管内红细胞流速。图片 A 至 F 为一条软脑膜血管的连续图像，显示单个红细胞穿过相机限定的显微视野。通过手动确定 15 个或更多红细胞在视野中逐帧移动的位置，并结合预先校准的距离，可借助 Excel 电子表格计算每条血管中的平均红细胞流速。
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="小动脉血流图；感染PbA与未感染；感染天数；相对于基线的百分比变化。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图4"> 
图4.（步骤3.9） 一项代表性实验数据，显示恶性疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA, PbA）感染小鼠（n = 5）与未感染对照小鼠（n = 5）随时间变化的软脑膜血流情况。对照组小鼠的软脑膜血流随时间相对稳定，而PbA感染小鼠在脑型疟疾发病时（第6天）血流显著下降。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="细菌生物膜生长的显微镜图像；荧光显微镜；实时监测。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图5"> 
图5.（步骤4.3） 通过抗CD45-Texas Red荧光抗体染色显示，感染了Plasmodium berghei ANKA的小鼠软脑膜血管上黏附有大量的白细胞。

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

此处描述的活体显微成像方法为详细观察小鼠软脑膜微循环提供了一种独特而强大的工具。该方法可单独识别单个微动脉和微静脉，并测量多种参数的变化，包括血管直径、红细胞流速、血流量、白细胞、血小板及其他血细胞的黏附与滚动、血管渗漏、组织pH值和pO₂值，以及潜在的其他多种应用。 体内 血管反应可在药物干预或病理过程中迅速评估。此外，微循环行为可随时间进行动态追踪。我们已利用该技术研究由脑型疟疾引起的软脑膜微循环变化 P. berghei 在小鼠中研究 ANKA，并已证明该模型中的神经系统综合征与微循环功能障碍相关，其特征为脑血流量减少、血管收缩、灌注受损，最终导致血管衰竭6.

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>碳菁染料 Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD45-TxR 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

该实验模型旨在利用以下方法评估小鼠软脑膜微循环在急性和慢性、生理及病理生理状态下的血流动力学、炎症和代谢情况， 体内 荧光显微镜。在小鼠左侧顶枕皮层上方植入封闭式颅窗。通过该颅窗，利用落射照明和荧光照明实时记录局部微循环，并对血管直径和红细胞（RBC）流速进行测量。红细胞流速采用实时互相关法和/或荧光标记的红细胞进行测定。借助荧光标记的示踪剂（如Albumin-FITC和抗CD45-TxR抗体），可观察白细胞和血小板在软脑膜血管上的黏附情况，并评估灌注状态和血管渗漏。微循环可在数天内多次进行视频记录。我们首次应用封闭颅窗活体显微技术研究软脑膜微循环，以动态观察疾病进程中发生的各项变化 疟原虫伯氏疟原虫 在小鼠中进行 ANKA 感染，并表明 CM 的表达与微循环功能障碍相关，其特征为血管收缩、血流显著减少，最终导致血管衰竭。

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。

该实验模型旨在评估小鼠软脑膜微循环在急性和慢性、生理及病理生理血流动力学条件下的变化，……

本实验的总体目标是通过活体显微成像技术研究小鼠大脑的微循环，该技术可长期追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症标志物的动态变化。该技术由拉霍亚生物工程研究所开发，并已应用于多种类型的研究。例如，可用于随访伯氏疟原虫感染过程中血流动力学的变化，以及脑型疟疾发作时的相关研究。首先，在活体显微镜研究前两周植入慢性颅窗，以实现这一目标。该操作的第二步是使用低倍率下的高分辨率数字图像记录颅窗的整体形态。第三步是通过常规照明和荧光照明获取活体显微镜图像，并选择特定的研究位点，用于在线测量血管直径和红细胞速度。该实验步骤的最后一步是通过荧光标记的特异性抗体，对微血管中的白细胞和血小板黏附情况进行活体分析。最终可获得结果，通过脑部活体显微成像，在模拟生理、病理生理或疾病状态的脑模型中，实时展示体内微循环的变化，从而确立与这些状态相关的血流动力学改变。该技术的主要优势在于，我们能够在脑组织的生理环境中对其进行观察，而无需将其暴露于外部试剂或人工介质中。与磁共振成像和血管造影相比，活体显微成像具有更高的空间和时间分辨率，使我们能够从宏观到微观层面进行观察。该方法有助于解答脑微循环生理学与病理生理学中的关键问题，例如在急性和慢性疾病期间的血流动力学变化和炎症反应。在进行活体显微镜检查前两到三周，对八至十周龄的小鼠实施开颅手术，操作步骤如前所述，但不将钛棒植入动物头部。慢性颅窗是一种稳定的制备方法，可在植入后数月内持续用于观察软脑膜微循环。首先，在将小鼠放入立体定位仪之前，检测其体温，并通过小鼠尾静脉注入先前制备好的荧光标记红细胞。这将实现红细胞追踪，后续将对此进行演示。然后用异氟烷对小鼠进行轻度麻醉。诱导使用4%，维持使用1%至2%。接下来，将动物置于恒温垫上的立体定位仪中，呈俯卧位。使用耳杆小心固定头部，并通过左右杠杆调整水平。用浸有矿物油的棉签轻轻清洁颅窗上的盖玻片。然后使用连接数码相机的体视显微镜，拍摄几幅颅窗下血管的全景照片。将全景照片传输至计算机后，选择其中最佳的一张进行打印、标识并注明日期。此照片将用作测量血管直径和红细胞流速的参考图，接下来将通过活体显微镜进行演示。将小鼠转移至定制的活体显微镜载物台上。利用牙科丙烯酸树脂形成的凹槽，在颅窗上滴加一滴水。使用数值孔径为 0.5 的 20 倍水浸物镜。图像通过两台相机记录：一台数字低照度高速相机连接至计算机和显示器，另一台低照度模拟相机连接至录像带、时间戳记设备和彩色显示器。在选择待测血管之前，应先检查血管以评估制备质量，并确认所有血管中均有血液流动，然后选择待测血管。所选血管应包括不同直径的静脉和动脉，并覆盖窗体暴露区域内不同位置的血管。在本实验中，我们在观察颅窗内的不同视野时，选取12条血管进行测量。为选取血管，需在先前拍摄的PY血管系统照片上标注每个待测点的精确位置；针对每个点，使用图像剪切装置测量血管直径。选定测量点

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

活体鼠脑微循环显微镜使用一个封闭的颅窗口

可通过双光子显微镜成像经尾静脉注射荧光葡聚糖染料的啮齿类动物，从而在活体中研究大脑皮层的血流动力学。本视频展示了如何通过覆盖玻璃的颅窗制备方法，对小鼠新皮层的血流动力学进行成像。...

一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。...

一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

在本视频中，我们通过植入的颅窗对小鼠模型中预先注射的癌细胞进行活体成像。 这种高分辨率的时间推移成像技术可实现对活体小鼠中癌细胞动态行为的研究。...

基于颅窗的活体成像技术在小鼠模型中的应用：一种用于研究预注射癌细胞在小鼠脑内行为的成像方法

来源：Sweeney, A. M., 等。利用荧光宏观成像技术对完整小鼠颅骨内脑脊液运输进行活体成像。J. Vis. Exp.

利用荧光大体显微镜在小鼠脑内进行脑脊液运输的活体成像

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

本文描述了一种在淀粉样斑块积聚过程中追踪脑血管重塑的方法 体内...

纵向的 体内 脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。...

利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

学习使用活体显微镜技术观察小鼠脑部微循环动态变化的方法。通过植入慢性颅窗，研究人员可实时追踪血流动力学指标和炎症反应，为神经科学研究提供重要的在体成像手段。

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

探索更多视频