細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

次の実験の全体的な目標は、植物表皮における蛍光標識タンパク質の細胞間移動の程度を分析することです。これは、DNA被覆された金粒子を取得して、植物の表皮で目的の融合タンパク質を一過性に発現させることによって達成されます。第2のステップとして、DNAは植物の表皮に送達され、これにより、テストされた融合タンパク質の発現と移動が可能になります。

次に、発現した融合タンパク質を共焦点顕微鏡で観察し、蛍光タグ付き試験タンパク質の発現と局在をモニターします。共焦点顕微鏡による蛍光シグナルの分布の分析に基づいて、蛍光標識タンパク質の細胞間輸送の程度を示す結果が得られます。こんにちは、ニューヨーク州立大学ストーニーブルック校生化学・細胞生物学科のケンタッキー研究所のベン・マイヤーズです。

今日は、植物表皮の細胞間移動または蛍光標識タンパク質の範囲を分析する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、さまざまな植物背景における植物ウイルスの移動タンパク質の細胞間輸送を研究し、さまざまな種類のタンパク質の細胞間移動性を比較しています。それでは始めましょう。

このプロトコルを開始するには、Promix bxでシロイヌナズナを1つ育てます。適切なサイズの鉢で、ニコチアナ、ハマナ、ニコチアナタバコの植物がPromix BXで各植物を大きな鉢で育てるには、撮影期間が短く、相対湿度が40〜65%の環境制御チャンバーを使用します。もう一度、長い撮影期間と40〜65%の相対湿度を持つ環境制御チャンバーを提供します。

前述のように、市販の製品で時々植物を肥やします。オプシス植物を6〜8週間育てた後、実験用の葉を15ミリメートル×35ミリメートルより大きいものを選択し、長さの測定にはnベナンナとNAC植物のピオールが含まれ、7〜10週間植物を育てます。次に、エンドベナンナには 50 ミリメートル x 70 ミリメートルより大きい葉を、ナックには 100 ミリメートル x 125 ミリメートルより大きい葉を選択します。

これらの場合、長さの測定値には人口は含まれません。DNA被覆微粒子のBIC送達が始まる前に、詳細に前述したように、DNA被覆金微粒子を含む遺伝子銃カートリッジを調製することができる。次に、鋭利なカミソリの刃で同じ発達段階の葉を取り除き、すぐにAALの側面を上に向けて平らな発泡スチロールの表面に置きます。

葉のABA側は、トリックホーム密度が低く、キューティクルが薄いため、砲撃に適した基質を表しています。急速なプシスのような小さな葉は、窓のスクリーンメッシュで覆い、メッシュをプッシュピンで発泡スチロールの表面に固定することで固定することができます。葉を平らに保つことで、粒子送達の効率を高め、マイクロボンバード時の組織への損傷を最小限に抑えます。

次に、DNAコーティングされた微粒子の入ったカートリッジをガンに挿入します。ウサギのオプシスのために。0.6ミクロンの微粒子に対して140〜160PSIの圧力で撮影を行います。

葉ごとに1つのカートリッジを使用してサンプルを衝撃し、直径10〜12ミリメートルの表面積に微粒子を広げます。エンドベナンナとエンドバウムの場合。160 から 180 PSI の圧力で、0.6 ミクロンの微粒子に対して、端のベナンナと端のタバコの葉を大きくして撮影します。

同じ葉を複数回砲撃することは可能ですが、同じ発達段階の葉の領域を標的にするには、中肋骨の両側の対称的な位置で行う必要があります。一過性に発現したタグ付きタンパク質の蛍光シグナルを共焦点で可視化します。顕微鏡検査では、試験した各タンパク質の検出に最適な顕微鏡設定を見つけるように注意する必要があります。

40倍対物レンズを使用して、タバコモザイクウイルスの血漿脱塩局在、移動タンパク質、T-M-V-M-Pなど、シグナル強度が弱い細胞内蓄積が限られているタンパク質を観察します。これにより、より高い解像度と感度の向上が可能になります。しかし、共焦点ズーム機能を有する10倍対物レンズは、遊離黄色蛍光タンパク質やYFPのような強いシグナル強度で細胞質分布を示すタンパク質のより高速なイメージングに用いることができる

このようなクラスターの数と各クラスター内の細胞の数は、細胞間輸送の程度を示しています。信頼性の高いデータを取得するには、少なくとも 100 個の式を記録します。実験系ごとのクラスターは、実験を同時に行うように注意してください。

比較が行われるとき。ここでは、蛍光標識タンパク質の単純な輸送が検出されました。A TMV mp YFP発現コンストラクトを用いた端浜名葉のマイクロ衝撃後に得られる典型的な共焦点画像が示されています。

TMV MP YFPの単純な動きは、YFP信号のマルチセルクラスターの出現に基づいて観察されます。しかし、一過性に発現するすべてのTMV MP YFPが、シングルセルシグナルから明らかなように移動できるわけではありません。いくつかのマイクロ爆撃で。

統計的には、カウントされた信号クラスターの 40% 未満で、TMV MP YFP はセル間を移動できません。一方、クラスターの60%以上では、タンパク質は2〜5個の細胞間を移動します。2つの細胞の広がりが最も頻繁に起こるため、先天的な運動活性を持たない比較的小さな分子サイズのタンパク質は、血漿SMAを介して拡散して細胞から細胞へと移動することができます。

たとえば、空き YFP または 1 つの XYFP が複数のセルに広がり、カウントされたクラスターの 30% を超えます。逆に、この非特異的拡散は、TMV MP YFP融合タンパク質に匹敵するサイズであり、完全に細胞自律性であるトランスレーショナルYFPダイマーまたは2つのXYFPでは起こりません。植物表皮における遺伝子銃システムによる一過性発現を使用して、蛍光標識タンパク質の細胞間移動を解析する方法を示しました。

この手順を行う際には、健康で丈夫な植物、DNAの送達のための高品質のDNAコーティングされた金粒子を準備し、統計的に信頼できる結果を得るために十分な発現クラスターを分析することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。