Name: 고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: 배우세요 고해상도 광섬유 마이크로엔도스코프를 조립하여 실시간 세포 이미징을 수행하는 방법을. 5,000달러 미만의 비용으로 현장에서 세포 수준의 세부 정보를 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 일부 국립 보건원, 그랜트 R01 EB007594, 국방 유방암 연구 프로그램의학과 제안 BCO74699P7, 그리고 수잔 G. 코멘 재단 교부금에 의해 투자 98,188,972분의 26,152되었습니다.

1. Microendoscope 어셈블리 (그림 1A) 여기에 설명된 고해상도 microendoscope은 어셈블리 및 응용 프로그램의 가능한 여러 형태를 기본 구성으로 간주되어야합니다. 우리는 여기서 자세히 형광등 대비 에이전트로 proflavine와 함께 사용하도록 설계되었습니다 플랫폼의 구현에 대해 설명합니다. Proflavine는 각각 445 nm의와 515 nm의 흡수 피크의 및 방출 파장과 얼룩 밝은 핵입니다. 다른 대비 요원의 사용은 사용자가 적절하게 여기, 배출하고, 이색성 필터를 선택할 수 있어야합니다. 고해상도 microendoscope 몇 가지 요소는 일반적이며, 여러 공급 업체에서 구할 수 있습니다. 예를 들어, optomechanical 위치 구성 요소는 다른 사람들과 Thorlabs, 뉴 포트, Linos에서 사용할 수 있습니다. 소형 CCD 카메라는 포인트 그레이 리서치, Prosilica 및 Retiga를 포함하여 기업에서 사용할 수있는, 카메라 감도는 사용할 형광단의 밝기뿐만 아니라 원하는 프레임 속도의 고려와 함께 선택한다. 하이 파워 발광 다이오드 (LED가) 다른 사람 사이에 Luxeon, 크리어하고, Nichia에서 구할 수 있습니다. 광섬유 번들 스미토모, 후지 쿠라, 그리고 쇼트에서 사용할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 대한 구성 요소를 선택하는 사용자는, 조도, 카메라 감도, 이득 및 노출 시간을 photobleaching, 형광단 농도 사이의 형광 현미경에 관련된 고유한 관계를 고려해야한다. <ol><li> 7.5의 한 쌍의 형태로, 케이지 막대 "1.5 케이지 막대"6 연결 "긴 막대합니다. 접어 미러 장치 중 하나가 얼굴에 다음 봉을 보자. 0.5 나사"반대로 얼굴로 막대합니다. 구멍을 통해 낮은 두 통해 케이지 막대에 케이지 큐브 슬라이드. 케이지 큐브 (그림 1B)의 측면 얼굴에 2 "봉을 나사. </li><li> SM1 어댑터 C - 마운트를 사용하여 케이지 접시에 카메라를 연결합니다. 0.5 "케이지 막대에있는 새장 판을 확보, 접이식 미러 유닛의 얼굴을 잔뜩. </li><li> 3 "긴 렌즈 튜브로"튜브 "렌즈를 삽입하고 유지 반지와 렌즈를 안전하게. 투영 때 렌즈의 초점 거리는 광섬유 번들의 코어가 적어도 두 개의 픽셀 샘플되는 등 선택해야합니다 카메라에. 필터 제조 업체로 표시. 측면에 렌즈 튜브를 스크류 첫 유지 반지의 상단에있는 튜브에 방출 필터를 드롭하고, 장소에 필터를 보호하는 또 다른 반지를 추가합니다. 필터 방향 대회를 관찰 케이지 큐브 CCD 카메라에 가까운. 그림 1C,이 렌즈와 필터의 지혜로움에 대해 3 "렌즈 튜브없이 표시됩니다. </li><li> 컴퓨터에 카메라를 연결하고 화면에 이미지를 볼 수 있습니다. 먼 물체에서 케이지 어셈블리를 직접하고 이미지가 초점이 나타날 때까지 레일 따라 케이지 큐브를 슬라이드. 이 위치에있는 케이지 큐브를 닫으세요. (이것은 무한 - 정정 목적 렌즈와 결합되면 튜브 렌즈가 초점을 맞춘 이미지를 형성 있도록 한 간단한 방법입니다.) </li><li> 케이지 큐브에서 45 °에있는 홀더와 장소에 이색성 거울을 넣습니다. </li><li> 튜브 렌즈 홀더 반대 케이지 큐브의 얼​​굴에, SM1 스레드 어댑터에 RMS 및 조정 렌즈 튜브를 통해 객관적인 렌즈를 나사. Z - 번역자가 쉽게 초점을위한 조정 렌즈 튜브 대신에 사용할 수 있습니다. 케이지 접시에 SMA 커넥터 나사 약 목적 렌즈의 작동 거리에서 막대에 이것을 탑재합니다. </li><li> 마운트 2의 끝 부분에 케이지 플레이트와 슬라이드에 LED '봉. 0.5 렌즈 추가 "이 튜브는 케이지 큐브의 측면에 실수를하면 그것이 LED의 이미지를 형성 이러한 렌즈 튜브 그 목적 렌즈의 조리개를 다시 채웁니다. 이 (콜러 조명) 구성은 광섬유 번들의 근위 얼굴이 균일하게 조명 있는지 확인합니다. 0.5 "렌즈 관으로 여기 필터를 추가하고 유지 반지 (그림 1C)와 장소에서 보안. </li><li> 광섬유 번들에 SMA 커넥터를 연결합니다. 케이지 막대에 장착된 SMA의 콘센트에 SMA connectorized 번들 보자. 광대역 광원 (형광등 조명이 충분)으로 번들의 말초 끝을 직접 CCD 카메라에 번들 근위 얼굴의 이미지를 관찰합니다. 섬유 번들 이미지가 초점이 나타날 때까지 케이지 큐브의에서 떨어지거나 밖으로 목적 렌즈의 위치를​​ 조정합니다. 개별 코어 (그림 2) 명확하게 표시해야합니다. </li></ol> 2. 미소 렌즈 조립 microendoscope의 공간적 해상도는 섬유 번들의 말초 팁로 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 부착 증가 수 있습니다. 이러한 광학되므로 빛을 - GUID에 의해 부과된 공간적 샘플링 주파수를 증가하는 대신 직접 조직에 번들 팁을 배치의 팁이 demagnification로 조직 표면에 몇 군데는 그러한 구성섬유 번들의 주입 코어. demagnification의 정도 뷰 필드에 비례 감소에 공간적 해상도에서 동시에 증가에 해당합니다. 그라데이션 지수 (미소) 렌즈 구성 요소는 섬유 - 광학과 호환되며 다른 사람들과 GrinTech, NSG, 쇼트에서 사용할 수 있으며, 직접 섬유 번들의 말초 팁에 접착 수 있습니다. <ol><li> 응용 프로그램의 원하는 배율과 작동 거리와 함께 미소 렌즈를 선택합니다. 렌즈의 직경은 당신이 작업 계획 광섬유 번들의를 초과되었는지 확인합니다. 우리는 섬유 번들과 미소 렌즈가 결합 이전에 정확하게 정렬을위한 저전력 현미경이나 입체경에 따라 별도의 3 축 수동 위치 단계에 장착하는 것이 좋습니다. </li><li> 렌즈 또는 번들 얼굴 하나에 광학 접착제 (예 : 노르 랜드 자외선 경화 접착제)의 한 방울을 넣으십시오. 매뉴얼 positioners를 사용하여 연락처에 두 구성 요소를 가져와. 제조 업체에서 권장 복용량을 위해 자외선에 인터페이스를 노출. </li><li> 미소 렌즈와 보세 인터페이스, 알루미늄 모세관 튜브 (소형 부품 주식 회사)의 짧은 길이를 보호하기 위해 공동을 묶으하는 데 사용할 수 있습니다. 에폭시와 함께 장소에 공동 및 보안을 통해 튜브 슬라이드. 열 수축 튜브는 조립을 완료하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. Microendoscope 이미징 <ol><li> 몇 군데있을 수있는 세포 또는 조직에 대비 에이전트를 적용합니다. proflavine (0.01 % PBS에 W / V)로, 문화에 세포의 체외 이미징에서 간단한 부화 (&lt;1 분) 및 rinsing 철저히하여 수행할 수 있습니다. 예 생체내 조직 표본이나 생체내 조직의 이미징은 염색 가능한 다음과 같은 국소 응용 프로그램입니다. 이러한 조건 하에서 proflavine의 이해는 몇 초 몇 분 동안 지속 내에서 가능한 이미지와 거의 즉각적인 것으로 발견되었습니다. </li><li> 몇 군데있을 수있는 샘플과 빛의 접촉 광섬유 번들 놓습니다. 문화 또는 전직 생체내 조직 표본의 경우 이미징 세포, 우리는 영상 중 안정성 XYZ 도끼에 수동 위치 단계와 보안 고정물에 섬유 번들의 말초 끝에 장착하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 제대로 조립하면 microendoscope는 일관된 광섬유 다발을 통해 릴레이 에피 형광 현미경로 작동합니다. 최적의 이미징 결과를 얻으려면,주의는 세 가지 핵심 조건이 충족되는 보장에 지불되어야합니다 <ol><li> 섬유 번들의 근위 얼굴은 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해, defocus없이 CCD 카메라에 몇 군데해야합니다. 그림 2A, B, C는 각각, 가난한 중심으로 몇 군데 섬유 번들의 일부 약간 defocus, 좋은 초점을 보여줍니다. 최적의 초점은 번들 얼굴에 상대적인 목적 렌즈의 축 위치를 조정하여 발견된다. </li><li> 섬유 번들의 근위 얼굴이 균일의 전체 직경 (뷰 필드)을 통해 조명되어야합니다. 프로토콜 텍스트 (1.7)에 설명한 바와 같이, 이것은 콜러 조명을위한 조명 광학을 구성하여 이루어진다. 그림 2D는 균일한 형광 샘플이 중요한 조명 아래에 해당하는 결과를 보여주는 그림 2E로이 선호하는 구성에서 조명 때 얻은 이미지를 보여줍니다. 후자의 경우, LED의 구조는 실제 샘플의 구조에 따라 겹쳐이 원치 않는 패턴의 모양에 결과 섬유 번들 얼굴에 몇 군데 있습니다. </li><li> 섬유 번들의 근위 및 말초 얼굴 모두 깨끗하고 긁힌 자국과 칩을 무료로해야합니다. 그림 2 층 섬유 경계 5 시에는 작은 칩 형태의 손상과 함께 번들 얼굴에 연결된 파편의 존재를 보여줍니다. 데브리는 렌즈 종이와 이소프로판올, 또는 표준 광섬유 청소 도구, 기존의 광섬유 커넥터와 같은 방식으로 청소하여 얼굴 번들에서 제거할 수 있습니다. 섬유 번들 중 하나 끝 긁힌이나 빠졌거나 번들의 길이를 따라 나면 얼굴 표준 수동 또는 기계적 연마 기술에 의해 평면 광택 수있다면. 우리는 0.5-1.0 μm의 용지에 최종 폴란드어와 초기 거친 폴란드어에 대한 논문을 래핑 12-15 μm의를 권장합니다. </li></ol> 그림 3A는 샘플에 베어 섬유 번들의 proflavine 가벼운 위치와 라벨 다음, 체외에서 세포의 1,483 이미징을 보여줍니다. 그림 3B는 공간 해상도 및 번들 팁에 보세 2.5x 미소 렌즈가 제공하는 뷰 필드에있는 감소에있는 개선을 보여줍니다. 영화 1은 마우스 모델에서 내유 지방 패드의 생체내 이미징에서 보여줍니다. 여기, 0.5 mm 외경 (330 μm의 뷰 필드)와 섬유 묶음은 21 게이지 바늘을 통과하여 조직으로 고급되었습니다. 지방세포는 15에서이 인수의 명백한 심장주기에 의한 움직임과 함께, 명확하게 볼 수 있습니다초당 프레임. 그림 3C는 건강한 인간 자원 봉사자의 구강 점막의 이미징, 1.5 mm 외경 (1.4 mm 뷰 필드)과 큰 광섬유 번들을 사용하여이 시간을 보여줍니다. 표시된 모든 예제에서는 proflavine은 핵 라벨 형광등 대비 에이전트로 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 고해상도 microendoscope (HRME)를 조립. HRME 시스템 (A) 도식 다이어그램. 주요 optomechanical 지원 구조 (B) 조립. (C) 광학 요소의 추가는, 조명 LED 및 CCD 카메라. 10 "X 8"X 2.5 "인클로저에 패키지 HRME 시스템 (D) 사진. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. HRME을 설정합니다. (A) 불쌍한 초점 광섬유 번들과 영상의 예, (B) 좋은 초점 가까이 (C) 이상 중점을두고 있습니다. 년 (D), 번들의 말초 팁에서 균일한 형광 대상은 콜러 (교복) 조명 아래에 몇 군데 있습니다. (E) 균일한 형광 목표는 개체에 대한 명백한 소스 구조, 중요 조명 아래에 몇 군데. (F) 느슨한 조직과 세포는 또한 주변에 약간의 손상하는 경향이있는 섬유 번들 얼굴에 붙어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. HRME와 이미징. (A) 체외에서 1,483 세포는 proflavine 0.01 % (W / V)와 레이블 아래 노출된 광섬유 번들 (IGN-08/30)와 몇 군데. (B)와 같이 동일한 1,483 세포 배양은 (A), 2.5x 미소 렌즈가 붙어있는 섬유 번들로 몇 군데. proflavine 0.01 %의 국소 응용 프로그램 (W / V) 다음과 같은 생체내 정상적인 인간의 구강 점막 (C) 이미지. 영화 1. 이미징 조직으로 전달 21 게이지 바늘의 루멘 이내에 450 μm의 외경 섬유 번들의 삽입을 통해 마우스의 내유 지방 패드. Proflavine 0.01 % (W / V)은 이전 이미지 섬유의 삽입에 같은 주사 바늘을 ​​통해 이미징 사이트에 전달했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li>
<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
<li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li>
<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP와 DY가 공개 없어요. RRK는 microendoscopic 영상 플랫폼에 관련된 특허를 보유하고 있습니다.

고해상도 microendoscopy 기술은 현재 현장에서 휴대 세부 시각화를위한 유연하고 강력하며 비용 효율적인 방법으로 기본적인 생물 의학 및 임상 연구 분야의 연구자를 제공합니다 설명했다. 우리는 이미징 시스템을 조립을위한 프로토콜을 설명하고 체외에서 세포 배양에의 사용을 시연하고, 생체내의 동물에서 인간 조직했습니다. 여기에 제시된 이미징 결과 형광등 대비 에이전트로 proflavine를 사용하는 동안, 다른 단체는 5-7 다른 염료의 여기 / 방출 스펙트럼과 일치하는 선택한 LED 조명 파장 및 필터 시스템의 버전을 증명하고있다. 해상도와 뷰 필드는 처음 코어로 코어 간격 및 광섬유 번들의 이미징 직경에 따라 결정됩니다. 우리는 약 4 μm의 코어 코어 간격, 그리고 330 μm의 (영화 1), 720 μm의 (그림 2, 그림 3A, B), 그리고 1400 μm의 (그림 3C)의 이미지 직경과 번들을 사용했습니다. 작은 번들은 좁아 게이지 바늘 통과하고 큰 섬유보다 훨씬 더 유연하실 수 있습니다. 우리와 다른 8, 어떤 경우에는, 섬유에서 배출 autofluorescence의 모양 자체가 번들 언급했습니다. UV 파장에 fluorophores을 자극하거나, 빨간 스펙트럼 범위에서 방사를 수집하려고하면, 관심은 전체 측정 신호에 기여 섬유 번들 autofluorescence의 수준으로 지급해야합니다. 고해상도 microendoscopy 작업 대부분의 최신은 노출된 광섬유 번들을 사용했다고 보도되지만, 추가적인 확대가 말초 팁에 보세 미소 렌즈의 사용에 의해 제공될 수 있습니다. 미소 렌즈는 광학 aberrations과 제한된 NA 그들의 자화율이 잘 인식에도 불구하고, 공간 해상도를 높이기 위해 간단한 경제적 방법을 제공합니다. 미소 렌즈 성능은 특정 응용 프로그램, 하이브리드 미소 / 구면 렌즈의 목표 9 미니어처 객관적인 렌즈 어셈블리에 대한 불충 분한 경우에는 10-11을 고용 수 있습니다. 고해상도 microendoscope은 넓은 분야 에피 형광 현미경으로 운영 근본적으로 여기서 설명하므로 더 광학 sectioning (그런 공촛점 또는 비선형 현미경)을 기대하는 것입니다 않습니다. 우리의 경험에서 455 나노미터 여기 가볍고 대비 요원으로 국소 proflavine를 사용하여 조명은 주로 몇 셀 레이어에 해당하는 깊이에서 수집됩니다. 이 프로토콜은 독자가 10의 소형 풋프린트 함께 benchtop에서 &quot;X 8&quot;고해상도 microendoscope 조립 수 있도록 해야지. 원하는 경우, 시스템은 상자에 동봉된 및 전기 부품 (LED와 카메라) 배터리 팩 (그림 1D)에 의해 구동 수 있습니다. 대부분의 컴팩트 카메라는 IEEE - 1394 (파이어 와이어)와 호스트 컴퓨터의 USB 포트에 의해 구동 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CCD 카메라</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>proflavine 사용을 위해 선택됨 &amp;#8211; 다른 형광체는 다른 부품이 필요할 수 있음</td></tr><tr><td>들뜸 필터</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>proflavine 사용을 위해 선택됨 &amp;#8211; 다른 형광체는 다른 부품이 필요할 수 있음</td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>proflavine 사용을 위해 선택됨 &amp;#8211; 다른 형광체는 다른 부품이 필요할 수 있음</td></tr><tr><td>다이크로익 미러</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>proflavine 사용을 위해 선택됨 &amp;#8211; 다른 형광체는 다른 부품이 필요할 수 있음</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>튜브 렌즈</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>CCD에 필요한 배율을 얻기 위해 초점 거리를 선택함</td></tr><tr><td>콘덴서 렌즈</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>케이지 큐브 유닛</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>케이지 로드 및 플레이트</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>폴드 미러 유닛</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 튜브</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (또는 SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>어댑터 / 커플러</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>SMA 커넥터</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>LED 드라이버</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 번들</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>더 크거나 작은 번들 사용 가능 (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

고해상도 광섬유 microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

많은 생물 학적 및 임상 연구는 세포 수준의 해상도와 형태와 기능의 종단 연구와 분석을 필요로합니다. 전통적으로 여러 실험은 빛의 현미경에 의해 평가를위한 연속적인 시간 지점에서 연구에서 제거 각각의 샘플과 함께 병렬로 실행됩니다. 여러 intravital 기술은 공촛점, multiphoton와 함께 개발하고, 둘째 고조파 현미경은 모든 현장 1 영상에 사용될 자신의 능력을 입증했습니다. 이러한 시스템으로, 그러나 필요한 인프라는 스캐닝 레이저 시스템 및 복잡한 광원을 포함한, 복잡하고 비싼 것입니다. 여기 우리는 5000 미국 $ 이하 부품 - 더 - 선반이 꺼져 사용하여 하루에 만들 수 있습니다 고해상도 microendoscope의 설계 및 조립을위한 프로토콜을 제시한다. 플랫폼은 이미지 해상도 측면에서 유연성을 제공 뷰 필드 및 운영 파장, 우리는 이러한 매개 변수가 쉽게 최종 사용자의 특정 요구를 충족하기 위해 수정할 수있는 방법을 설명합니다. 우리와 다른 excised 6 살아있는 동물의 조직 2,5, 그리고 생체내 2,7 인간의 조직에서 체외 세포 배양 2-5에서에서 고해상도 microendoscope (HRME)의 사용을 살펴 보았다. 사용자 proflavine 2-4, benzoporphyrin - 유도체 monoacid 반지 (럴 - MA) 5, fluoroscein 6,7, 전체를받은 모든 중, 또는 FDA의 investigational 승인 등 여러 가지 형광 대비 요원의 사용을보고 인간의 과목에서 사용하십시오. 고해상도 microendoscopy는 형태로 여기서 설명에 기본 및 임상 과학에서 근무하는 연구자의 다양한 관심을 끌 수 있습니다. 기술은 사용자가 고해상도, 원위치에 세로 이미징을 수행함으로써, 기존의 benchtop 현미경을 보완 효과적이고 경제적인 접근 방식을 제공합니다.

그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

많은 생물학적 및 임상적 연구에서는 세포 수준의 해상도로 형태와 기능을 종단적으로 연구하고 분석하는 과정이 필요합니다.

전통적으로 세포 수준의 해상도로 현미경 분석이 필요한 생물학 및 임상 연구는, 여러 실험을 병렬로 진행하면서 순차적인 시점마다 개별 샘플을 제거하여 광학 현미경으로 평가하는 방식으로 수행되어 왔습니다. 공초점, 다광자 및 제2고조파 현미경은 모두 in situ 이미징에 유용한 기술이지만, 스캐닝 레이저 시스템과 복잡한 광원을 포함하는 필수 인프라가 매우 복잡하고 고가입니다. 본 영상에서는 5,000 US 달러 미만의 기성 부품을 사용하여 단 하루 만에 고해상도 광섬유 마이크로 내시경 시스템을 구축하는 방법을 시연합니다.이 플랫폼은 이미지 해상도, 시야각 및 작동 파장 측면에서 유연성을 제공합니다. 먼저, 광원, 광학 필터, 렌즈, 광섬유 다발 및 CCD 카메라를 수용할 수 있도록 단순한 에피 형광 현미경 프레임을 조립합니다. 그다음, CCD 카메라 상에 광섬유 다발의 확대 이미지를 형성하는 이미징 렌즈를 설치합니다.그 다음, 시료에 형광 여기광을 제공하기 위해 조명 광학계가 포함된 LED 광원을 설치합니다. 최종적으로, 조립된 마이크로 내시경을 통해 인비트로(in vitro) 배양, 인비보(in vivo) 동물 모델 및 인체 피험자를 포함하여 형광 표지된 시료의 세포 수준 상세 정보를 실시간 이미징으로 확인합니다. 공초점 또는 다광자 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 충분히 단순하고 저렴하여, 다양한 분야의 연구자들이 빠르게 도입하고 각자의 특정 필요에 맞게 맞춤화할 수 있다는 점입니다.여기에 설명된 고해상도 마이크로 내시경은 조립 및 응용 방식에 따라 여러 변형이 가능한 기본 구성으로 간주되어야 합니다. 특정 응용 분야를 위한 부품을 선택할 때는 형광 현미경의 형광 물질 농도, 광퇴색 조명, 강도, 카메라 감도, 게인 및 노출 시간 사이의 내재적 관계를 고려하십시오. 본 플랫폼은 프로플라빈을 형광 대비제로 사용하도록 설계되었으나, 다른 형광 염료와 함께 작동하도록 구성할 수 있습니다.Pro flavin은 최대 흡수 및 방출 파장이 각각 445 nanometers와 515 nanometers인 밝은 핵 염색제입니다. 다른 대조제를 사용할 경우, 사용자는 마이크로 내시경 시스템을 구성하기 위해 여기, 방출 및 다이크로익 필터를 적절하게 선택해야 합니다. 먼저 6 inch 케이지 로드 2개를 1.5 inch 케이지 로드 2개에 연결하여 7.5 inch 길이의 로드 한 쌍을 만듭니다. 로드를 폴드 미러 유닛의 한 면에 나사로 고정한 다음, 1 inch 직경의 미러를 설치하십시오.다음으로, 폴딩 미러 유닛의 반대쪽 면에 0.5 inch 로드 4개를 나사로 고정합니다. 두 개의 하단 관통 구멍을 통해 케이지 큐브를 7.5 inch 케이지 로드에 끼웁니다. 케이지 큐브의 측면에 2 inch 로드를 나사로 고정합니다.C 마운트를 SM1 어댑터로 연결하여 카메라를 케이지 플레이트에 부착합니다. 폴딩 미러 유닛의 전면과 수평이 되도록 케이지 플레이트를 0.5 inch 케이지 로드에 고정합니다. 카메라에 광섬유 번들의 이미지를 형성할 수 있도록 직경 1 inch의 튜브 렌즈를 선택합니다.광섬유 번들의 원인이 최소 두 개의 픽셀에 의해 샘플링될 수 있도록 렌즈의 초점 거리를 선택해야 합니다. 카메라로 이미징할 때, 렌즈를 3인치 길이의 렌즈 튜브에 삽입하고 리테이닝 링으로 렌즈를 고정하십시오. 긴 렌즈 튜브에 리테이닝 링을 조일 때는 스패너 렌치를 사용하는 것이 유용합니다.방출 필터를 3인치 렌즈 튜브의 첫 번째 고정 링 위에 넣고, 또 다른 링을 추가하여 필터를 제자리에 고정합니다. 필터의 방향이 필터 제조사에서 명시한 기준을 충족하는지 확인하십시오. 렌즈 튜브를 CCD 카메라와 가장 가까운 케이지 큐브 측면에 나사로 고정합니다.이 위치 또한 여기에 표시되어 있습니다. 도식에서는 렌즈와 필터가 3인치 렌즈 튜브 없이 표시되어 있음에 유의하십시오. 정확한 확인을 위해 카메라를 컴퓨터에 연결하여 화면으로 이미지를 확인하십시오.케이지 어셈블리를 먼 곳의 물체로 향하게 하고, 물체의 이미지가 초점으로 나타날 때까지 레일을 따라 케이지 큐브를 슬라이드합니다. 드라이버를 사용하여 케이지 큐브 측면에 있는 4개의 나사를 조입니다. 이 나사들을 조이면 레일을 고정하여 큐브가 제자리에 유지됩니다.이렇게 하면 무한 보정 대물렌즈와 결합했을 때 튜브 렌즈가 카메라에 파이버 번들의 초점이 맞은 이미지를 형성하게 됩니다. 다음으로, 다이크로익 미러를 홀더에 삽입하고 케이지 큐브 내에 45도 각도로 배치하십시오. RMS-SM1 나사산 어댑터와 조절 가능한 렌즈 튜브를 사용하여 대물렌즈를 튜브 렌즈 홀더 반대편의 케이지 큐브 면에 고정하십시오.그 후, SMA 커넥터를 케이지 플레이트에 나사로 고정하고, 이를 대물렌즈의 작동 거리 부근의 로드에 장착합니다. 케이지 큐브의 열린 측면에 베이스 플레이트와 엔드 캡을 추가합니다. 그런 다음 LED를 케이지 플레이트에 장착하고 2인치 로드의 끝부분에 밀어 넣습니다.0.5 inch 렌즈 튜브에 렌즈를 추가하여, 이 튜브를 케이지 큐브 측면에 나사로 고정했을 때 LED의 상이 대물렌즈의 후면 개구부를 가득 채우도록 합니다. 또한, 렌즈 튜브에 여기 필터를 추가합니다. 이 단계에서 에폭시를 사용하여 LED 드라이버로 조명 강도를 조절할 수 있습니다.1030 µm 파이버용 SMA 커넥터를 720 µm 시야각 파이버 옵틱 번들에 연결하십시오. 파이버 옵틱 커넥터 연결에 대한 자세한 내용은 Thorlabs의 부품 번호 FN96, 광섬유의 커넥터 연결 및 연마 가이드를 참조하십시오.SMA 커넥터 아이즈 번들을 케이지 로드(cage Rods)에 장착된 SMA 리셉터클에 나사로 고정하십시오. 번들의 원위단(distal end)을 광대역 광원(형광등으로 충분함)을 향하게 하십시오. 그런 다음 CCD 카메라에서 번들 근위면(proximal face)의 이미지를 관찰하십시오. 마지막으로 케이지 큐브의 나사를 조이거나 풀어 객관 렌즈의 위치를 조정하십시오.파이버 번들 이미지가 초점에 맞을 때까지 개별 도파관이 명확하게 보여야 합니다. 마이크로 내시경의 공간 분해능은 파이버 번들의 원위단 팁에 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 부착하여 높일 수 있습니다. 이러한 광학계는 번들 팁을 조직에 직접 배치하는 대신, 팁이 배율을 가지고 조직 표면에 이미징되도록 구성됩니다.이를 통해 파이버 번들의 광 안내로 인해 발생하는 공간 샘플링 주파수를 높일 수 있습니다. 확대 배율의 정도는 공간 분해능의 증가와 일치하며, 동시에 시야(field of view)의 비례적인 감소를 의미합니다. 해당 응용 분야에 필요한 배율과 작동 거리(working distance)를 갖춘 GRIN 렌즈를 선택하십시오.렌즈의 직경이 사용하려는 광섬유 번들의 직경과 일치하는지 확인하십시오. 정확한 정렬을 위해 저배율 현미경 또는 실체 현미경 아래에서 광섬유 번들과 GRIN 렌즈를 각각 별도의 3축 수동 정밀 조절 스테이지에 장착하십시오.다음으로 렌즈 또는 번들 면에 광학 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다. 수동 포지셔너를 사용하여 두 구성 요소가 서로 접촉하도록 합니다. 제조사가 권장하는 적정량의 UV 광선을 인터페이스에 조사하여 접착제를 경화시킵니다.그린 렌즈와 접합 인터페이스를 보호하기 위해, 짧은 길이의 알루미늄 모세관 튜브를 사용하여 접합부를 감쌉니다. 튜브를 접합부 위로 밀어 넣고 튜브의 양 끝에 에폭시를 한 방울씩 떨어뜨려 고정하며, 열수축 튜브를 사용하여 조립을 마무리합니다. 미세 내시경 촬영을 하기 전, 세포 및 배양물을 촬영하기 위해 촬영 대상 세포나 조직에 조영제를 도포합니다.먼저, 피펫을 사용하여 배양액을 제거합니다. 그런 다음 프로플라빈(pro flavin) 용액을 웰에 조심스럽게 피펫팅하여 첨가합니다. 최대 1분 동안 짧게 인큐베이션한 후, 피펫으로 프로플라빈 용액을 제거하여 버립니다.웰에 신선한 PBS 용액을 넣고 제거하여 세포를 세척한 후, 안정성을 위해 x, Y, Z축의 수동 위치 조정 스테이지가 장착된 고정 장치에 광섬유 번들의 원위단을 장착합니다. 세포 또는 조직에 염료를 도포한 후 이미징을 수행하는 동안, 광섬유 번들을 샘플에 가볍게 접촉시킵니다. 카메라 제조사에서 제공하는 소프트웨어 또는 직접 개발한 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에서 광섬유 번들의 이미지를 확인합니다.적절한 밝기의 이미지를 얻을 수 있도록 카메라의 노출 시간과 게인 설정을 조정하십시오. 올바르게 조립되었다면, 마이크로 내시경은 일관성 있는 광섬유 다발을 통해 중계되는 에피 형광 현미경으로 작동하게 됩니다. 최적의 이미징 결과를 얻기 위해서는 세 가지 핵심 조건이 충족되었는지 확인하는 데 주의를 기울여야 합니다.먼저, 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해 광섬유 다발의 근위면을 디포커스 없이 CCD 카메라로 촬영해야 합니다. 여기서는 광섬유 다발의 일부를 초점이 맞지 않는 상태, 약간 맞은 상태, 그리고 잘 맞은 상태로 각각 촬영한 모습입니다. 최적의 초점은 다발 면에 대해 대물렌즈의 실제 위치를 조정하여 찾을 수 있습니다.둘째, 광섬유 번들의 근위면 전체 직경에 걸쳐 균일하게 조명되어야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이는 조명 광학계를 콜리메이션 조명(collimated illumination)으로 구성함으로써 달성할 수 있습니다. 여기에 표시된 이미지는 균일한 형광 샘플을 이러한 권장 구성으로 조명했을 때 획득한 것입니다.임계 조명 하에서의 해당 결과가 여기에 나타나 있습니다. LED의 구조가 광섬유 다발 단면에 투영되어, 실제 시료 구조 위에 이러한 원치 않는 패턴이 겹쳐져 나타나게 됩니다. 셋째, 광섬유 다발의 근위단과 원위단 모두 깨끗해야 하며 긁힘이나 깨짐이 없도록 하는 것이 중요합니다.이 예시에서는 이미지 잔해물이 번들 면에 붙어 있으며, 파이버 주변부 5시 방향에 작은 칩 형태의 손상이 보입니다. 잔해물은 렌즈 페이퍼와 이소프로판올 또는 표준 파이버 광학 세척 도구를 사용하여 일반적인 파이버 광학 커넥터와 동일한 방식으로 세척하여 번들 면에서 제거할 수 있습니다. 1483개의 세포를 pro flavin으로 표지하였으며, 베어 파이버 번들을 샘플 위에 가볍게 놓았습니다.2.5 x grin 렌즈를 번들 팁에 접합했을 때의 인비트로(in vitro) 이미징을 여기에서 보여주며, 이를 통해 공간 해상도의 향상과 시야각의 감소가 이루어졌습니다. 0.5 millimeter 외경의 파이버 번들을 21게이지 바늘을 통해 통과시켜 마우스 유선 지방패드 조직 내로 삽입하여 진행한 인비보(in vivo) 이미징이 이 영상에 나타나 있으며, 심장 주기로 인한 움직임과 함께 지방세포가 명확하게 관찰됩니다. 이 예시에서는 1.5 millimeter 외경의 더 큰 파이버 번들을 사용하여 건강한 성인 지원자의 구강 점막 이미징을 수행하였습니다.모든 예시에서, pro flavin이 핵 표지 형광 대비제로 사용되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 세포 및 조직의 in C 두 형광 이미징을 위한 광섬유 마이크로 내시경을 설계하고 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

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네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

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고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

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