Name: Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej za pomocą cytometrii przepływowej w myoblastach. Technika ta pozwala badać wpływ insuliny na metabolizm glukozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana grantami z funduszu Mrs. Clifford Elder White Graham Endowed Research Fund oraz NIH (AR059838) dla CB, z NIH (AR052791, AR044387-ARRA oraz NS063298) dla LTT, a także przez Baylor College of Medicine Cytometry and Cell Sorting Core dzięki finansowaniu z NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211 oraz NCI P30CA125123). Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych stanowisk NIH.

1. Barwienie komórek
<ol>
<li>Przygotuj komórki. Należy użyć komórek w fazie aktywnego wzrostu (60-80% konfluencji). Poddaj komórki głodzeniu surowiczemu przez noc, wysiej je w gęstości 0,1 miliona komórek na dołek w 0,5 mL medium bezsurowiczego na płytce 24-dołkowej i inkubuj w inkubatorze (37°C, 5% CO2) od 30 min do 2 h, aby odzyskały sprawność po trypsynizacji.</li>
<li>Przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Wymieszaj (5 μL pierwszorzędowego przeciwciała anty-GLUT4 z 1 μL drugorzędowego przeciwciała przeciwko IgG koziego pochodzenia z kurczaka sprzężonego z AlexaFluor 488) pomnożone przez liczbę dołków. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
<li>Przygotuj 2X roztwór roboczy insuliny poprzez jej rozcieńczenie w medium.</li>
<li>Sprawdź, czy komórki przywarły do podłoża.</li>
<li>Ostrożnie dodaj 6 μL mieszaniny przeciwciał oraz 0,5 mL 2X roztworu roboczego insuliny do dołków zawierających komórki. Unikaj turbulentnego mieszania medium. Inkubuj (37°C, 5% CO2) przez 30 minut w ciemności.</li>
<li>Utrwal komórki, dodając do każdego dołka 0,5 mL PBS + 1% PFA, unikając wstrząsania komórkami. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
<li>Jeśli komórki przywarły do dołków, delikatnie oderwij je za pomocą scrapera do komórek. Przenieś komórki (łącznie 1 mL) do probówek kompatybilnych z cytometrem przepływowym i odwiruj, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
<li>Przemyj osad dwukrotnie 1 mL PBS i resuspenduj w 0,4 mL PBS + 1% PFA. Na tym etapie probówki z komórkami można owinąć folią i przechowywać w lodówce (4-8°C) lub przenieść do cytometru przepływowego w celu natychmiastowej akwizycji danych.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie danych
<ol>
<li>Ustaw szerokie bramkowanie wokół żywych komórek na panelu rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FCS). Użyj próbki negatywnej (komórek niepoddanych działaniu insuliny lub komórek „obarwionych” kontrolą izotypową), aby ustawić parametr FL1. Upewnij się, że cały pik znajduje się w obrębie panelu i nie jest ucięty od dołu.</li>
<li>Zebierz dane z co najmniej 10 000 komórek z każdej próbki.</li>
</ol>
3. 	Analiza danych
<ol>
<li>Wyznacz bramkę wokół żywych komórek na panelu SSC vs FSC (Rycina 1A). Przedstaw histogramy intensywności fluorescencji AlexaFluor 488 w funkcji liczby komórek wewnątrz bramki żywych komórek (Rycina 1B). Można nałożyć na siebie różne histogramy, aby zwizualizować różnice, jednak w celu ilościowego oznaczenia należy wyznaczyć średnią oraz medianę intensywności fluorescencji dla każdej populacji komórek i wykorzystać te wartości do porównań (Rycina 1C).</li> 
<li>Znormalizuj dane do wartości uzyskanej w warunkach braku insuliny, zgodnie z Rycinami 1C i 1D.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
W mioblastach wyizolowanych od zdrowego osobnika (bez insulinooporności), insulina indukuje zależną od dawki translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej (Rycina 1, lewa). W przeciwieństwie do tego, insulina nie indukuje translokacji GLUT4 do błony komórkowej mioblastów wyizolowanych od pacjenta z insulinoopornością (Rycina 1, prawa).
<img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Analiza cytometryczna insulinooporności; wykresy kropkowe, histogramy i wykresy słupkowe MFI służą do analizy komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przykład eksperymentu z barwieniem. Mioblasty wyizolowano od dawcy bez insulinooporności (lewo) oraz od pacjenta z insulinoopornością (prawo). A, Wykres SSC (rozproszenie boczne) względem FCS (rozproszenie przednie) z bramką wokół żywych komórek. B, Komórki wybrane bramką w A, zabarwione przeciwciałem przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4 i pozostawione bez stymulacji (czerwony) lub stymulowane insuliną w stężeniu 1 nM (niebieski), 10 nM (pomarańczowy) lub 100 nM (zielony). Dla przejrzystości rysunku, w przypadku komórek z insulinoopornością przedstawiono jedynie dane bez insuliny oraz z insuliną 100 nM. C, Średnie intensywności fluorescencji (MFI) z histogramów pokazanych w B zostały znormalizowane do MFI komórek pozostawionych bez stymulacji (brak insuliny). D, Wykresy znormalizowanych danych MFI z histogramów pokazanych w B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zaprezentowaliśmy szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej.
GLUT4 jest wyrażany w błonie komórkowej komórek jedynie przejściowo i ulega endocytozie. Ponieważ związane przeciwciała pozostają przytwierdzone do GLUT4, nawet podczas endocytozy, sygnał fluorescencyjny wskazuje całkowitą ilość GLUT4, która była wyeksponowana w błonie komórkowej w wybranym czasie inkubacji w obecności insuliny.
Tę technikę można również zastosować do badania translokacji innych białek z przedziału wewnątrzkomórkowego do błony komórkowej, pod warunkiem dostępności odpowiedniego przeciwciała skierowanego przeciwko zewnętrznemu epitopowi badanego białka. Na przykład podobny test jest obecnie powszechnie stosowany do oceny szybkości degranulacji cytotoksycznych limfocytów T oraz limfocytów natural killer poprzez pomiar translokacji CD107a do ich błony komórkowej4,5. Translokacja fosfatydyloseryny z wewnętrznej strony błony komórkowej na stronę zewnętrzną podczas apoptozy lub nekrozy komórek może być również wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem znakowanej fluorochromem Annexin V6.
Poza szybkością analizy, cytometria przepływowa oferuje zaletę umożliwienia badania translokacji białek do błony komórkowej w mieszanych populacjach komórek. W rzeczywistości można połączyć barwienie markerów podgrup komórkowych z barwieniem badanego białka, a następnie przeprowadzić akwizycję danych na wielolaserowym cytometrze przepływowym7.
Ilości przeciwciał podane w akapicie 1.2 protokołu stanowią punkt wyjścia; zalecamy miareczkowanie przeciwciał z wykorzystaniem badanych komórek w celu ustalenia minimalnego stężenia przeciwciał dającego maksymalny sygnał. Dobrym zakresem początkowym dla zastosowanego tutaj pierwszorzędowego przeciwciała anty-ludzkiego GLUT4 byłoby 1-10 μL na probówkę (tj. 0,2-2 μg przeciwciał na probówkę), przy założeniu, że każda probówka zawiera nie więcej niż 1 milion komórek. W przypadku innych przeciwciał pierwszorzędowych należy stosować się do instrukcji dostawcy.
Normalizacja danych jest niezbędna, ponieważ autofluorescencja komórek różni się w zależności od dawcy oraz od konkretnego eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała anty-ludzkie GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4</td></tr><tr><td>Kurze przeciwciała anty-kozie IgG sprzężone z AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinacyjna ludzka insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do przenoszenia komórek</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Docięte do rozmiaru dołków</td></tr><tr><td>Probówki 5 ml do FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Kompatybilne ze wszystkimi urządzeniami BD</td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar translokacji glut4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glukoza jest głównym źródłem energii dla organizmu, co wymaga stałej regulacji jej stężenia we krwi. Wydzielanie insuliny przez trzustkę indukuje pobór glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, przede wszystkim przez mózg, mięśnie szkieletowe i adipocyty. Pacjenci cierpiący na cukrzycę typu 2 i/lub otyzację często rozwijają insulinooporność i nie są w stanie kontrolować homeostazy glukozy. Nowe spostrzeżenia dotyczące mechanizmów insulinooporności mogą dostarczyć nowych strategii leczenia cukrzycy typu 2.
Rodzina transporterów glukozy GLUT składa się z trzynastu członków rozmieszczonych w różnych tkankach w całym organizmie1. Transporter glukozy typu 4 (GLUT4) jest głównym transporterem pośredniczącym w pobieraniu glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę, takie jak mięśnie szkieletowe. Po związaniu insuliny z jej receptorem pęcherzyki zawierające GLUT4 przemieszczają się z cytoplazmy do błony komórkowej, indukując pobieranie glukozy. Zmniejszona translokacja GLUT4 jest jedną z przyczyn insulinooporności w cukrzycy typu 22,3.
Translokację GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej można zwizualizować za pomocą immunocytochemii, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla GLUT4 sprzężone z fluoroforem.
W niniejszej pracy opisujemy technikę ilościowego oznaczania całkowitej translokacji GLUT4 do błony komórkowej w określonym czasie, z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Protokół ten jest szybki (trwa mniej niż 4 godziny, wliczając inkubację z insuliną) i pozwala na analizę od zaledwie 3 000 do nawet 1 miliona komórek na warunek w ramach jednego eksperymentu. Metoda opiera się na zastosowaniu przeciwciał anty-GLUT4 skierowanych przeciwko epitopowi zewnętrznemu transportera, które wiążą się z nim natychmiast po jego wystawieniu na środowisko pozakomórkowe w wyniku translokacji do błony komórkowej.

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Glukoza jest głównym źródłem energii dla organizmu, co wymaga stałej regulacji jej stężenia we krwi. Wydzielanie insuliny przez trzustkę indukuje...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej komórek ssaków w odpowiedzi na ekspozycję na insulinę. Mioblasty poddane głodzeniu surowiczym, które posiadają białko GLUT4 wyłącznie wewnątrz pęcherzyków, są najpierw wysiewane do 24-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie do komórek dodaje się przeciwciało przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4, uprzednio inkubowane z fluorochromem sprzężonym przeciwciałem wtórnym, a w dalszej kolejności insulinę.Aktywacja receptorów insulinowych na powierzchni komórek prowadzi do translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej. GLUT4 jest następnie rozpoznawany przez przeciwciała obecne w medium. W tym momencie komórki można utrwalić, a następnie zmierzyć intensywność barwienia fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej.Metodę tę można wykorzystać do badania translokacji glikogenu oraz metabolizmu glukozy, ale można ją również zastosować w innych układach, takich jak degranulacja komórek NK poprzez ekspozycję CD 1 0 7 A na błonie. W przypadku tej procedury ważne jest użycie komórek w fazie aktywnego wzrostu lub o stopniu konfluencji od 60 do 80%, które były poddane nocnemu głodzeniu seryjnemu. Po zebraniu komórek za pomocą trypsyny należy je przemyć i resuspender w zwykłej pożywce wzrostowej w stężeniu 200 000 komórek na mililitr; następnie wysiać komórki na płytkę 24-dołkową w ilości 0,1 miliona w 500 µL na dołek. Następnie inkubować komórki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić im regenerację po działaniu trypsyny.W międzyczasie zmieszaj przeciwciało przeciwko glute four i sprzężone z Alexa Fluor 4 8 8 wtórne przeciwciało anty-chicken IgG w stosunku pięć do jednego; oblicz końcową objętość, przyjmując, że do każdego dołka zostanie zużyte 10 µL mieszaniny przeciwciał. Inkubuj mieszaninę przeciwciał przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Podczas inkubacji mieszaniny przeciwciał przygotuj dwukrotny roztwór roboczy insuliny, rozcieńczając ją do pożądanego stężenia w pożywce wzrostowej.Po inkubacji komórek przez jedną godzinę należy wyjąć je z inkubatora. Do każdej studni z komórkami ostrożnie dodać 10 µL roztworu przeciwciał. Należy pamiętać, aby pozostawić co najmniej jedną studnię niebarwioną.Ta próbka negatywna zostanie wykorzystana później do konfiguracji cytometru przepływowego. Następnie do każdej studni dodaj 500 µL dwukrotnego roztworu zapasu insuliny, aby wywołać translokację GLUT4 na powierzchnię komórki, i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Po wyjęciu komórek z inkubatora utrwal je, dodając 1 mL PBS z 1% PFA do każdej studni, i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Używając scrapera do komórek, delikatnie odklej utrwalone komórki od dna studni i przenieś je z każdej studni do osobnej probówki FACS.Odwiruj probówki, aby utworzyć pellet komórkowy, następnie wymieszaj w wirówce typu vortex i resuspenduj komórki w 1 mL PBS w celu ich przemycia, po czym ponownie odwiruj. Powtórz etap przemywania dwukrotnie, odlewając nadsącz po każdym cyklu.Na koniec resuspenduj przemyte komórki w 400 µL PBS z 1% PFA. Można teraz przystąpić do analizy ekspresji powierzchniowej glute four w cytometrze przepływowym. Po dostarczeniu próbek do cytometru przepływowego rozpocznij akwizycję danych od kontroli niebarwionej.Zdefiniuj szeroką bramkę dla żywych komórek, wykorzystując parametry rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Następnie dostosuj ustawienie napięcia dla kanału FL 1, tak aby szczyt negatywny był widoczny w obrębie marginesów histogramu. Po ustaleniu tych parametrów przeprowadź pomiary każdej próbki eksperymentalnej, rejestrując co najmniej 10 000 zdarzeń dla żywych komórek w każdej probówce.Ten histogram przedstawia zwiększoną ekspresję barwienia powierzchniowego GLUT4 w mioblastach poddanych działaniu 0, 1, 10 lub 100 nM insuliny. W przeciwieństwie do nich, mioblasty pochodzące od osób z insulinoopornością nie wykazują zwiększenia ekspresji GLUT4 w odpowiedzi na 100 nM insuliny. Jeśli średnią intensywność fluorescencji stymulowanych komórek znormalizuje się do wartości komórek niestymulowanych, możliwe jest bezpośrednie porównanie wartości MFI zdrowych i insulinoopornych mioblastów.Stosując tę procedurę, komórki można barwić na dodatkowe markery powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe, aby zidentyfikować różne podgrupy komórek w populacjach mieszanych.

quantitative-measurement-glut4-translocation-to-plasma-membrane-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowe pomiaru translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej przez cytometrię przepływową

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł pokaże, jak monitorować dynamikę glutaminy w żywych komórkach za pomocą FRET. Genetycznie kodowane czujniki umożliwiają monitorowanie cząsteczek biologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej. Omówiony zostanie projekt eksperymentu, szczegóły techniczne warunków eksperymentalnych oraz rozważania dotyczące analiz poeksperymentalnych dla genetycznie kodowanych czujników glutaminy.

Obrazowanie strumienia glutaminy za pomocą genetycznie kodowanych czujników

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę ilościowego pomiaru translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej za pomocą cytometrii przepływowej w myoblastach. Technika ta pozwala badać wpływ insuliny na metabolizm glukozy.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów