Name: C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda ensaios de memória associativa de curto e longo prazo em C. elegans usando condicionamento com butanona e quimiotaxia. Este método permite avaliar retenção de memória e vias genéticas envolvidas no envelhecimento cognitivo.

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Agradecemos W. Ryu para aconselhamento sobre a nossa imagem inicial set-up, Z. Gitai para a sugestão de usar ImageJ 13 a contar worms, e J. Ashraf para ajudar com o Google SketchUp. CTM é um Scholar Pew em Ciências Biomédicas, um Scholar McKnight, e um Scholar Keck.

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-515 (1993).</li>
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<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+image+transformations+for+an+automatic+screening+of+cervical+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears.</a> J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).</li>
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<li>Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O C. elegans aprendizado olfativo associativo e ensaios de memória apresentado aqui distinguir entre os processos de aprendizagem massed, aprendendo espaçados, memória de curto prazo e memória de longo prazo. Estes ensaios contam com as habilidades dos worms &quot;para sentir os odores dos alimentos e produtos químicos em seus 1,2 ambiente e de formar associações positivas entre os dois. 6 Portanto, os ensaios são muito sensíveis à fome na população a partir de animais, e um grande cuidado deve ser tomadas para garantir que os worms são bem alimentados antes e após o treinamento. Treinamento massed única rendimentos de curto prazo memória associativa. O aumento do número de períodos de condicionamento e treinamento espaçados paradigma é fundamental para alcançar a longo prazo memória associativa em C. elegans como é em outros organismos. 6,8 Talvez este ensaio pode ser modificada para produzir memórias de longo prazo de associações entre diferentes estímulos condicionados e incondicionados. Nossa aprendizagem associativa e ensaios de memória pode ser usado para comparar as capacidades de aprendizagem e memória de tipo selvagem ao envelhecimento ou genética animais mutantes. Por exemplo, enquanto a aprendizagem associativa e de longo prazo de memória associativa declínio habilidades no envelhecimento do tipo selvagem worms, a aprendizagem é mantida durante mais tempo com a idade em animais com a sinalização de insulina reduzida, e aprendizagem e da memória é mantido mais tempo com a idade em animais sob restrição calórica. 6 Estes ensaios também são passíveis de tratamento RNAi ou manipulação farmacológica do C. elegans. Por exemplo, o tratamento de vermes com daf-2 RNAi melhora a curto ea longo prazo memória associativa e, inversamente, o bloqueio da transcrição de genes e síntese de proteínas com drogas (actinomicina D e cicloheximida, respectivamente) durante o treinamento espaçadas interrompe a longo prazo a formação da memória. 6 Memória de longo prazo é um processo que é crucial para a sobrevivência em todos os animais, e parece que grande parte da maquinaria molecular envolvida na memória de uma associação pavloviana é conservada a partir de vermes aos mamíferos. 6 A capacidade de distinguir e teste de aprendizagem associativa, de curto prazo e memória de longo prazo com estes testes olfativos faz C. elegans um excelente sistema para o estudo adicional de memória, e pode fornecer a introspecção em processos neurodegenerativos que levam à perda de aprendizagem e memória em humanos.

<table><tbody><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>Preparar concentração de 1 M em água destilada</td></tr><tr><td>Álcool Etílico 190 Provas</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>DSP-CT-18</td><td>&amp;gt;95% de Etanol podem conter impurezas que interferem nos ensaios de quimiotaxia</td></tr><tr><td>2-Butanona 99+%</td><td>Acros Organics</td><td>14967-0010</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CMOS de Varredura em Área Basler IEEE-1394/FireWire</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-683</td><td></td></tr><tr><td>Lente de Vídeo InfiniMite &amp;#8211; Alpha Industrial</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-202</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de Fibra Óptica Dolan-Jenner MI-150</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT55-718</td><td></td></tr><tr><td>Fundo Iluminado 8&amp;#8221; x 8&amp;#8221;</td><td>Schott AG</td><td>A08927</td><td></td></tr><tr><td>Suporte Padrão com Braço Articulado</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-120</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Haste 3/4&amp;#8221; para Suportes com Braço Articulado</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-124</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Montagem Fixa Padrão 1/4-20</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-122</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans aprender butanona positivo, de curto prazo e de longo prazo ensaios memória associativa

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

A memória de experiências e informações aprendidas é fundamental para os organismos de fazer escolhas que ajudam a sua sobrevivência. C. elegans navega seu ambiente através de neurônio-específica detecção de odores de alimentos e química 1, 2, e pode associar estados nutritivo com odores químicos 3, temperatura de 4, e à patogenicidade de uma fonte de alimento 5. Aqui, descrevemos ensaios de C. elegans aprendizagem associativa e de curto e longo prazo memória associativa. Nós modificamos um paradigma de aprendizado aversivo olfativa 6 a vez produzir uma resposta positiva, o ensaio envolve starving ~ 400 worms, então alimentar os vermes na presença do AWC neurônio-butanona sentiu chemoattractant volátil em uma concentração que provoca um índice quimiotático baixa (similar para Toroyama et al. 7). A população padrão quimiotaxia assay1 testes atração dos vermes para o odorant imediatamente ou minutos a horas após o condicionamento. Depois de quimiotaxia condicionado, do tipo selvagem dos animais aos aumentos butanona ~ 0,6 Quimiotaxia unidades Index, seu &quot;Índice de Aprendizagem&quot;. Aprendizagem associativa é dependente da presença de ambos os alimentos e butanona durante o treinamento. Alimentos emparelhamento e butanona por um período de condicionamento único (&quot;formação massed&quot;) produz curto prazo memória associativa que dura aproximadamente 2 horas. Períodos de condicionamento múltiplos com períodos de descanso entre (&quot;formação espaçadas&quot;) rendimentos de longo prazo memória associativa (&lt;40 horas), e é dependente da proteína Elemento cAMP encadernação Resposta (CREB), 6 um fator de transcrição necessários para memória de longo prazo através espécies. 8 Nosso protocolo também inclui métodos de análise de imagem para determinação rápida e precisa dos índices de quimiotaxia. Imagens de alto contraste de animais em placas de ensaio de quimiotaxia são capturados e analisados ​​por software verme contagem em MatLab. O software corrige para o fundo irregular usando uma transformação tophat morfológica. Método 9 Otsu é então usado para determinar um limite para worms separado do fundo. 10 partículas muito pequenas são removidos automaticamente e maior verme não-regiões (as bordas da placa ou socos agar) são removidas por seleção manual. O software então calcula o tamanho do verme única, ignorando as regiões que estão acima de um tamanho máximo especificado e tendo a dimensão média das demais regiões. O número de vermes é, então, calcula-se dividindo a área total ocupada pela identificado como worms pelo tamanho estimado de um worm único. Nós descobrimos que a aprendizagem e de curto e longo prazo de memória podem ser distinguidos, e que estes processos partes semelhantes moléculas chave com organismos superiores. 6,8 Nossos ensaios pode testar rapidamente genes candidatos romance ou moléculas que afetam a aprendizagem e de curto ou longo prazo de memória em C. elegans, que são relevantes em toda espécie.

Aqui nós descrevemos métodos para testar C. elegans aprendizagem associativa e de curto e longo prazo memória associativa. Estes ensaios população empregar as habilidades worms para chemotax direção odores voláteis, e formar associações positivas sobre o emparelhamento de alimentos com a butanona chemoattractant. Aumentar o número de períodos de condicionamento induz memória de longo prazo.

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

A memória de experiências e de informações aprendidas é fundamental para que os organismos tomem decisões que auxiliem a sua sobrevivência. O C. elegans navega no seu ambiente ...

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a memória de curto e longo prazo de uma associação positiva aprendida entre alimento e o quimioatraente butano, utilizando C. elegans como modelo. Isso é alcançado primeiramente pela privação de alimento por uma hora em vermes jovens adultos, sincronizados e bem alimentados.Em seguida, os vermes são treinados na presença de alimento e butanona, por condicionamento massivo para memória associativa de curto prazo e por condicionamento espaçado para memória associativa de longo prazo. Após o condicionamento, a quimiotaxia em direção à butanona é medida e comparada à quimiotaxia de animais ingênuos. Para estudar a retenção da memória, são obtidos resultados que mostram a duração da memória associativa de curto e longo prazo da associação aprendida entre alimento e butanona, com base em alterações no índice de aprendizagem.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de envelhecimento cognitivo e doenças, como quais vias genéticas são necessárias para a função neuronal no envelhecimento normal e em estados de doenças neurodegenerativas, e como a aprendizagem e a memória podem ser aprimoradas. Em condições de comprometimento cognitivo, os vermes são preparados utilizando métodos padrão em placas de meio de crescimento alto de 100 milímetros, semeadas com um mililitro de E. coli OP50. Utilize adultos jovens numa densidade de cerca de 5.000 vermes ou menos por placa.Colete os vermes despejando suavemente o tampão M nove na placa e girando para soltar os vermes. Tente minimizar a agitação, o que pode desalojar bactérias indesejadas. Em seguida, incline a placa e retire a mistura de tampão e vermes a partir do canto.Usando uma pipeta P1000, transfira os vermes para um tubo cônico de 15 mililitros. Tendo o cuidado de não pipetar os vermes contra a parede, caso os vermes permaneçam na placa.Repita este passo uma a duas vezes. Deixe os vermes sedimentarem no fundo do tubo por ação da gravidade. A centrifugação não é recomendada para obter os melhores resultados.Uma vez sedimentados, remova o sobrenadante por aspiração e lave com pelo menos três a quatro mililitros de tampão M nove. Trabalhe rapidamente para evitar a inanição. Repita este procedimento duas vezes, perfazendo um total de três lavagens.Neste momento, um grupo de vermes pode ser separado para servir como o grupo ingênuo nos ensaios de quimiotaxia que serão demonstrados posteriormente; para pré-condicionar os vermes para o treinamento, adicione três a quatro mililitros de tampão M nove ao tubo e deixe os vermes em jejum à temperatura ambiente por uma hora. Prepare as placas de condicionamento estriando dois microlitros de butano a 10% em etanol a 95% no interior das tampas de placas NGM de 60 milímetros que foram semeadas com 500 microlitros de E. coli OP50. Remova o sobrenadante do tubo de vermes em jejum e use uma pipeta P1000 para transferir de 100 a 200 microlitros de vermes para cada placa de condicionamento. Incube as placas de condicionamento à temperatura ambiente por uma hora após o condicionamento.Lave os vermes das placas com cerca de um mililitro de tampão M nove e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Repita os métodos de lavagem suave demonstrados anteriormente até que o tampão pareça claro. Após a lavagem, um subconjunto de vermes pode ser removido e testado no ensaio de quimiotaxia para servir como o grupo de tempo zero para a aprendizagem associativa de uma vez a concentração máxima, preparando placas que representam pontos de tempo adicionais.Transfira de 100 a 200 microlitros de vermes para placas NGM de 60 milímetros com semeadura. Incube essas placas pós-condicionadas por 0,51 ou duas horas à temperatura ambiente. Após cada ponto temporal, lave suavemente os vermes das placas para um tubo cônico de 15 mililitros e mais uma ou duas vezes.Com o tampão M nove, seguindo os mesmos procedimentos suaves de lavagem, a memória associativa de curto prazo é testada utilizando o ensaio de quimiotaxia, que será demonstrado posteriormente. Prepare as placas de condicionamento e os vermes conforme demonstrado para o treinamento de curto prazo, mas permita que os vermes incubem à temperatura ambiente por apenas 30 minutos. Após a incubação, colete os vermes conforme demonstrado anteriormente.Transfira-os para placas NGM de 60 milímetros NÃO SEMEADAS. Mantenha os vermes nas placas não semeadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Após os vermes estarem em jejum, lave-os com tampão M nove e coloque-os novamente no tubo cônico de 15 mililitros. Repita esses passos até que um total de sete blocos de condicionamento e seis blocos de jejum tenham sido concluídos.Quando a condicionamento estiver completo, lave os vermes das placas de condicionamento de volta para um tubo cônico. Como mostrado anteriormente, um grupo de vermes pode ser usado para testar aprendizado associativo espaçado sete vezes imediatamente após o condicionamento. Transfira a população remanescente de vermes para placas HGM de 100 milímetros contendo um mililitro de OP50.Novamente, aplique de 100 a 200 microlitros de vermes por placa para garantir que haja bactérias suficientes para sustentar a população. Incube as placas pós-condicionamento a 20 graus Celsius por 16, 24 ou 40 horas, representando os pontos temporais de memória associativa de longo prazo, para testar a memória associativa de longo prazo da associação conhecida com o alimento butan. Lave suavemente os vermes das placas para um tubo cônico de 15 mililitros e, novamente, uma a duas vezes com tampão M nove após cada ponto temporal e teste os vermes no ensaio de quimiotaxia.Para preparar as placas para o ensaio de quimiotaxia, marque a parte inferior de placas NGM de 100 milímetros não seladas com pontos próximos à borda em três locais, conforme mostrado aqui. Aplique um microlitro de azida de sódio um molar nos pontos de odorizante e controle. Faça isso não mais do que 15 minutos antes de iniciar o ensaio, para minimizar a difusão dos agentes paralisantes.Em seguida, aplique um microlitro de etanol 95% e um microlitro de butanona 10% em cada um dos respectivos locais marcados na placa de ensaio. Sobre o azoteto de sódio previamente aplicado. Remova o máximo possível do tampão M nove do tubo com os vermes sedimentados.Use uma pipeta P20 com ponteira pré-cortada para aplicar 15 microlitros de vermes em três intervalos de cinco microlitros cada, na origem da placa de ensaio. Em seguida, enrole a ponta de um lenço Kim em um ponto fino e use-o para absorver o excesso de tampão M nove. Tendo cuidado para não perfurar o ágar.Remover o excesso de tampão libera os vermes na placa de ensaio. Se utilizar imagem para contar os vermes, uma imagem da origem imediatamente após essa liberação fornecerá o número total de animais em uma placa de ensaio. Incubar a placa de ensaio de quimiotaxia por uma hora à temperatura ambiente após a incubação e contar o número de vermes nos pontos de origem, etanol e butanona, bem como o número total de vermes na placa de ensaio.Em geral, os vermes paralisados pelo azoteto de sódio estarão dentro de um raio de um centímetro dos pontos e parecerão completamente retos. Com muitos animais empilhados uns sobre os outros, os vermes podem ser contados manualmente ou quantificados utilizando software de imagem e análise. Preferimos este último método pela facilidade e confiabilidade dos resultados.Após quantificar os vermes nos pontos de origem dos locais com etanol e butanona, calcule o índice KeyAx conforme mostrado aqui. O índice de quimiotaxia típico para vermes selvagens em resposta à butanona 10% é de aproximadamente 0,2. O treinamento massivo ou espaçado geralmente aumenta o índice de QUIMIOTAXIA para 0,7 a 0,8 no tempo zero, resultando em um índice de aprendizado de cerca de 0,6.A quimiotaxia ingênua é altamente sensível aos cuidados adequados com os vermes. Esta figura demonstra a diferença acentuada no índice de quimiotaxia entre vermes ingênuos bem alimentados e desnutridos e destaca a importância de uma técnica adequada. A retenção de memória é refletida pelo tempo necessário para o índice de quimiotaxia retornar aos níveis ingênuos quando o índice de aprendizado é igual a zero em animais selvagens.A memória associativa de curto prazo começa a declinar uma hora após o treinamento em massa, que dura cerca de duas horas, e é independente do fator de transcrição kreb, por comparação. A memória associativa de longo prazo normalmente não começa a declinar significativamente até 16 horas após o treinamento espacial, que pode durar até 40 horas, e é dependente de Creb. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os ensaios de quimiotaxia podem ser influenciados pela privação de alimento ou por odores excessivos no ambiente, e também que a memória e os vermes podem ser perturbados por agitação física excessiva.

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