Name: הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: למד פרוטוקול לחילוץ DNA מדגימות FFPE לניתוח גנטי אפיגנטי. השיטה כוללת הסרת פרפין, ריאודרציה ועיכול רקמות לקבלת DNA איכותי למחקר מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי במעבדה לאם להערכה שלהם ומבקר של וידאו זה מאמר. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לחקר בריאות.

<p class="jove_title"&gt; 1. פרוצדורלי מציין</p&gt;<ul&gt;<li&gt; קסילן פנול הם כימיקלים רעילים צריך להיות מטופל fumehood. עיין בגיליון בטיחות נתונים החומר (MSDS) לפני השימוש.</li&gt;<liקסילן&gt; מתמוסס פלסטיים מסוימים; צינורות פוליפרופילן צריך לשמש להם לסבול התרכובות הללו.</li&gt;<li&gt; טיפים מיוחדים ניתן לרכוש המכילים פחם פקק פנימי. הדבר מונע מן קסילן המסת כל רכיבי גומי פיפטה. לחלופין, טיפים מסנן ניתן להשתמש.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. הסרת פרפין</p&gt;<ol&gt;<li&gt; ב fumehood, מוסיפים 800 μl של קסילן (VWR, CABDH6216-4) על צינור שכותרתו המכיל הדגימה שלך במקום על כיסא נדנדה עם רעד עדין במשך 5 עד 15 דקות לפרק את פרפין.</li&gt;<li&gt; גלולה המדגם על ידי ספינינג על מהירות מרבית (14,000 סל&quot;ד או 16 000 XG) ב microcentrifuge במשך 3 דקות. בזהירות למשוך את supernatant קסילן להיפטר בצינור פוליפרופילן עבור להשליך פסולת קסילן. היזהר לא להפריע גלולה.</li&gt;<li&gt; חזור על שלבים 1 ו לשטוף קסילן פרפין 2until נמס לגמרי. זה בדרך כלל דורש 2-3 שוטף, בהתאם לגודל המדגם רקמות. מדגם מומס לחלוטין יופיעו רכה, לעתים לאבד את השלמות המבנית שלה. שלמות של המדגם ניתן להעריך בעדינות עם קצה פיפטה.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. אתנול התייבשות</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הוסף 800 μl של 100% אתנול (v / v) ביולוגיה מולקולרית כיתה אתנול, מערבולת, אז ספין במשך 3 דקות 14,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge. הסר את supernatant אתנול, נזהר לא להפריע גלולה.</li&gt;<li&gt; הוסף 800 μl של אתנול 70% (100% (v / v) אתנול מדולל במים מזוקקים (ד&quot;ה<sub&gt; 2</sub&gt; O)), מערבולת, ואת הספין במשך 3 דקות 14,000 סל&quot;ד. הסר בזהירות את supernatant אתנול.</li&gt;<li&gt; הוסף 800 μl של אתנול 50% (100% (v / v) אתנול מדולל במים מזוקקים (ד&quot;ה<sub&gt; 2</sub&gt; O)), מערבולת, ואת הספין במשך 5 דקות בסל&quot;ד 14,000. מוציאים בזהירות כמו אתנול רב ככל האפשר על ידי pipetting. היזהר מאוד מטריד את הכדור בנקודה זו כמו רקמה rehydrated מלא לא גלולה, כמו גם רקמות מיובש.</li&gt;<li&gt; לאחר הסרת supernatant אתנול, אוויר יבש את הכדור במשך 5 דקות, נזהרים לא יבש מעל.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. רקמות העיכול</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הוסף 200-500 μl של הצפת תמוגה (הנוסחה להלן). Re-להשעות גלולה באמצעות קצה פיפטה או מערבולת. מאמץ נוסף בשלב זה באופן מלא מחדש להשעות הרקמה תגרום לעיכול שלם יותר של המדגם תשואה טובה יותר של DNA.</li&gt;<li&gt; דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים או לחסום חימום.</li&gt;<li&gt; עבור ליבות רקמות, ספייק 20 μl של proteinase K (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות, Invitrogen, AM2548) בוקר וערב.</li&gt;<li&gt; חזור על הצעדים לעיל לעיכול עבור 2 עד 5 ימים עד רקמת נמס לגמרי.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; תמוגה הצפת</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM טריס-HCl pH 8.0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA-pH 8.0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; 0.5% SDS</li&gt;<li&gt; 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​proteinase K (להוסיף רק לפני השימוש)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. ה-DNA לנקות</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הוסף נפח שווה של חיץ רווי פנול (פישר, BP1750I-400) ומערבבים על ידי היפוך. ספין לפחות 5 דקות 14,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge.</li&gt;<li&gt; מעבירים את השכבה המימית לצינור חדש. שים לב שלבי הביניים: האם יש הרבה חומר לבן?</li&gt;<li&gt; חזור על שלבים 1 ו -2 על השבר מימית עד שלבי הביניים ברור (בדרך כלל 3 פעמים או יותר). בצע בחזרה עקירות * כאשר שלבי הביניים מטושטשת להגדיל את התשואה הסופית.</li&gt;<li&gt; לאחר שלבי הביניים ברור, מוסיפים נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:24:1) (פישר, BP1752I-400) לשבר מימית חילוץ של המדגם שלך. מערבבים במשך 5 דקות ואחר כך להסתובב במשך 5 דקות ב 14,000 סל&quot;ד. Thisreduces שיורית פנול נוספת מחדדת את שלבי הביניים, להקל על החילוץ של השכבה המימית</li&gt;<li&gt; הסרת שכבה מימית לצינור חדש treatwith RNase על 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לשעה 1 ב 37 ° C.</li&gt;<li&gt; חזור על שלבים 1-4 כדי להסיר כל RNase שנותרו לאסוף את חלק מימית. אתה צריך רק צריך 1 או 2 חיץ צעדים פנול רווי כמו שצריך להיות הרבה פחות חלבון כדי להסיר מאשר lysate הראשונית.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * כדי לבצע חזרה עקירות להוסיף 50-100 μl של DH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 עד הצינור מדגם המכיל את שלבי הביניים ואת חלק אורגני. הפוך את הצינור כדי לערבב ספין מדגם ב 14,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge במשך 5 דקות. אסוף את השלב מימית ולהוסיף אותו החילוץ מימית רכשה בעבר. המשך חזרה עקירות עד שלבי הביניים ברור.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. ה-DNA משקעים</p&gt;<ol&gt;<li&gt; אומדן היקף שכבה מימית שנאספו שלך.</li&gt;<li&gt; הוסף 1 / 10 נפח 3 pH נתרן אצטט M 5.2 ו - 1 נפח של 100% isopropanol כיתה (v / v) ביולוגיה מולקולרית (או 2.5 כרכים של אתנול 100%).</li&gt;<li&gt; מערבבים היטב ולשים על הקרח או למקפיא -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לילה.</li&gt;<li&gt; ספין במהירות המרבית (14,000 סל&quot;ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות microcentrifuge</li&gt;<li&gt; מחק supernatant.</li&gt;<li&gt; לשטוף את גלולה עם 70% אתנול קרח קר להסיר מלחים בלתי רצויים.</li&gt;<li&gt; Re-להשעות את גלולה במאגר של הבחירה (בדרך כלל DH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. ה-DNA כימות</p&gt;<ol&gt;<li&gt; לכמת את הריכוז של ה-DNA. A260: A280 היחס צריך להיות ~ 1.8. עבור כמויות קטנות של דנ&quot;א, מדידה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop היא העדיפה.</li&gt;<li&gt; בעקבות כימות, ג&#39;ל אלקטרופורזה יש לבצע כדי לבדוק את האיכות של ה-DNA מדגם שלך לקבוע אם RNA לזהם כבר מפורקים לגמרי.</li&gt;<li&gt; איכות גבוהה DNA חילוץ כעת מתאים ליישומים במורד הזרם, או יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם רנ&quot;א עדיין קיים במדגם שלך, לחזור על ה-DNA לנקות צעדים משקעים, מחדש לכמת להעפיל את איכות דגימות שלך.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

רקמות או ביופסיה נכרת בניתוח לניתוח אבחון היסטופתולוגיות ולעתים קרובות קבוע בפורמלין מוטבע פרפין (FFPE) עבור אחסון לטווח ארוך. עם העניין הגובר בהבנת הבסיס הגנטי של המחלה, היכולת להפיק דנ&quot;א מדגימות אלה מהווה מקור רב ערך של חומר אבחון שיכולות לשמש לניתוח גנומי מחקרים translational. היסטורית דגימות FFPE לא נחשבו למקור קיימא עבור ניתוח מולקולרי כמו חומצות גרעין עשוי להיות שונה במידה רבה על ידי חומצה חלבון גרעין חלבונים לחצות קישור 6. עם זאת, הגילוי כי מערכת העיכול פרוטאז משחרר חומצות גרעין מקוטע אשר מתאימים מנתח במורד הזרם כולל PCR, מערך CGH, רצף פרופיל המתילציה, מאפשר שימוש בדגימות אלה חשובים לניתוח גנטי 6. מיצוי דנ&quot;א פרפין, מוטבע רקמות היא הליך חזקים המסתמכת על מסיסות ההפרש לטהר את ה-DNA. DNA חולץ איכות וכמות ואת ההצלחה של הגברה DNA הבאים תלויה במספר פרמטרים לפני, במהלך ואחרי החילוץ. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל: סוג וכמות הרקמה, סוג של מקבע משמש לשימור רקמות, משך קיבעון, גיל של גוש פרפין תנאי האחסון, כמו גם את אורכו של קטע ה-DNA הרצוי להיות מוגבר 1,7. הסרת פרפין מרקמות הוא השלב הקריטי ביותר להפקת מוצלח כמו פרפין שלא נמס מוביל באיכות דגימה עניים עיכוב הגברה PCR.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> קסילן </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1.7 מ&quot;ל Microcentrifuge צינורות SafeSeal </td><td> Bioscience סורנסון </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16M Microcentrifuge </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> תמוגה הצפת </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM טריס-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​proteinase K </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון במלאי </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון במלאי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מאגר רווי pH פנול 6.6/7.9 </td><td> דיג </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> דיג </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase </td><td> רוש </td><td> 10109169001 </td><td> 100 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> 3M נתרן אצטט pH 5.2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc ב 80ml התאם ל-pH 5.2 עם חומצה אצטית קרחונית הוסף DH 2 O ל 100 מ&quot;ל דוד לחץ </td></tr><tr><td> ND 3300 ספקטרופוטומטר </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

הפקת dna מחומר פרפין embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

התפתחות מחלות התקדמות מאופיינים סטיות גנטיות epigenetic תכופים כולל rearrangements כרומוזומליות, מספר רווחי העתק הפסדים מתילציה בדנ&quot;א. ההתקדמות תפוקה גבוהה, הגנום כולו טכנולוגיות אפיון, כגון microarrays, שיפרו באופן משמעותי את היכולת שלנו לזהות לזהות אלו שינויים ספציפיים. אולם ככל שהטכנולוגיה ממשיכה להשתפר, גורם מגביל נשאר איכות המדגם זמינות. מידע קליני יתר על כן, מעקב והתוצאה מחלה נאספים לעתים קרובות שנים לאחר איסוף הדגימה הראשונית. דוגמאות, בדרך כלל, פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE), נשמרים בארכיון בית החולים במשך שנים עשורים. ה-DNA ניתן לשחזר ביעילות פרפין מ-מוטבע דגימות אם בשיטה המתאימה ממוצא מוחל. ה-DNA באיכות גבוהה המופק דגימות נשמר כראוי מאוחסנים יכול לתמוך מבחני כמותי להשוואות של רקמות בריאים וחולים, דור של חתימות גנטיות epigenetic 1. כדי לחלץ דנ&quot;א פרפין, מוטבע דגימות, גרעינים רקמה או רקמות microdissected כפופים טיפול קסילן, אשר ממיס את פרפין מן הרקמה, ואת rehydrated מכן באמצעות סדרה של שוטף אתנול. חלבונים ואנזימים מזיקים כגון nucleases מתעכלים לאחר מכן על ידי proteinase ק תוספת של חיץ תמוגה, אשר מכיל חומרים denaturing כגון נתרן גופרתי dodecyl (SDS), מקלה על העיכול 2. חומצות גרעין הן מטוהרים מן lysate את הרקמה באמצעות חיץ רווי צנטריפוגה מהירות פנול גבוהה אשר מייצר פתרון biphasic. DNA ו-RNA נשארים בשלב מימית העליון, בעוד חלבונים, שומנים סוכרים הם מוחרם בין ואורגניים שלבי בהתאמה. שמירה של השלב מימיות עקירות פנול חזר יוצר מדגם נקי. בעקבות עקירות פנול, RNase מתווסף לחסל רנ&quot;א מזהם. פנול עקירות נוספות הבאים הדגירה עם RNase משמשים כדי להסיר כל אנזים הנותרים. תוספת של נתרן אצטט ו-DNA isopropanol משקעים, ו צנטריפוגה במהירות גבוהה משמש גלולה את ה-DNA ולאפשר הסרת isopropanol. עודף מלחים שמקורם משקעים יכול להפריע מבחני האנזימטית שלאחר מכן, אבל ניתן להסיר את ה-DNA על ידי שטיפה עם אתנול 70%, ואחריו צנטריפוגה מחדש גלולה את ה-DNA 3. DNA הוא מחדש המרחפים במים מזוקקים או החיץ של בחירה, לכמת ומאוחסנים ב -20 ° C. ה-DNA מטוהרים יכול לאחר מכן לשמש ביישומים במורד הזרם אשר כוללים, אך לא מוגבלים, PCR, גנומית השוואתי מערך הכלאה 4 (מערך CGH), immunoprecipitation DNA מפוגל (MeDIP) וסדר, המאפשר ניתוח אינטגרטיבי של דגימות רקמה / גידול.

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ&quot;א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

התפתחות המחלה והתקדמותה מאופיינות בשיבושים גנטיים ואפיגנטיים תכופים, הכוללים ארגון מחדש של כרומוזומים, מספר העתקים...

סרטון זה ידגים כיצד לבצע מיצוי DNA מדגימות רקמה הטמעות בפרפין. הדגימה המשמשת בהדגמה זו היא גליל רקמה (tissue core), שקוטרו שלושה מילימטרים ואורכו שישה מילימטרים. בעוד שבהדגמה זו נעשה שימוש בגליל בודד, ניתן לעבד בתגובה אחת דגימות גדולות יותר שקוטרן עולה על חמישה מילימטרים ואורכן עולה על 10 מילימטרים, או שניים עד שלושה גלילים בגודל המשמש כאן.עם זאת, חשוב לציין כי עשויים להידרש התאמות לפרוטוקול כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרפין ועיכול של הרקמה. לפני שניתן לבצע כל פעולה ברקמה, יש להמיס את הפרפין השעוותי המשמר אותה. פעולה זו מתבצעת באמצעות xylene, היות ש-xylene ופנול הם חומרים רעילים. כל עבודה עם כימיקלים אלו חייבת להתבצע במנדף; הוסף 800 µL של xylene למבחנה המכילה את הדגימה שלך.לאחר מכן, הניחו את הדגימה על רוקר (rocker) למשך 10 דקות עם ניעור עדין. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך שלוש דקות כדי להשקיע את הדגימה, ולאחר מכן הסירו את ה-xylene והמיסו את הפרפין מהמבחנה. חזרו על שלבים אלו ש פעמיים או שלוש עד להמסה מלאה של הפרפין.הרקמה צריכה להיראות רטובה ורכה. חשוב להסיר את כל הפרפין כדי להגדיל את תנובת ה-DNA הסופית. לכן, דגימות רקמה גדולות יותר דורשות מספר רב יותר של שטיפות.כעת, לאחר שהפאראפין הוסר מהדגימה, יש להחזיר את הנוזלים לרקמה (rehydration) כדי לאפשר את עיכול הרקמה. פעולה זו מתבצעת באמצעות סדרת רהידרטציה באתנול. ראשית, הוסף 800 µL של 100% ethanol לדגימה, ערבב במערבל וורטקס וסבב את הדגימה ב-14,000 RPM למשך שלוש דקות.הסר את הנוזל העליון (supernatant). חזור על שלבים אלה תוך שימוש ב-800 µL של 70% ethanol, ולאחר מכן ב-50% ethanol. הסבוב האחרון צריך להימשך חמש דקות, כיוון שהרקמה תהיה פחות מוצקה ותדרוש כוח רב יותר להצמדה למשקע (pellet).כעת יש לעכל את הרקמה כדי לשחרר את ה-DNA מהתאים. פעולה זו מבוצעת באמצעות באפר ליזיס (lysis buffer), תמיסה המורכבת מחומרי דנטורציה של חלבונים, כגון SDS ו-proteinase K, האנזים האחראי על פירוק הרקמה.הוסיפו 200 עד 500 µL של תמיסת ליזיס לדגימה. בהתאם לגודל, נפח של 400 µL הוא נפח מומלץ לשימוש. כמובן, הרכיבים של תמיסת הליזיס וכן טמפרטורת האינקובציה של 56 °C נועדו למקסם את פעילות החלבון.מכיוון ש-ACE K הוא חלבון, הוא יכול לפרק רקמות למשך זמן מוגבל, ולכן יש להוסיף אנזים באופן תקופתי כדי להמשיך את התגובה. 20 µL של חלבון ACE K בריכוז של 10 mg/mL מתווספים לדגימה בבוקר ובערב עד שהרקמה מומסת לחלוטין.כאשר לא ניתן לראות עוד רקמה מוצקה, יש לחלץ את ה-DNA מתוך תמיפת השאריות התאיות. פנול רווי משמש להפרדת הדגימה לשלב מימי ושלב אורגני. השלב המימי מכיל את ה-DNA.חשוב להשתמש בפנול רווי במאפר (buffer saturated phenol), מכיוון שהחומציות של פנול רגיל אינה רק מפרקת את ה-DNA, אלא גם הופכת את סדר השכבות של הפאזות המימיות והאורגניות. יש לשים לב שפנול רווי במאפר מאוחסן בשתי פאזות, כאשר הפנול מהווה את השכבה התחתונה.הוסיפו לנמונה נפח שווה של פנול רווי בתמיסת בופר והפכו את המבחנה מספר פעמים. לאחר מכן, הניחו את הנמונה בצנטריפוגה וסובבו אותה ב-14,000 RPM למשך חמש דקות כדי להשרות הפרדה של הפאזות.ה-DNA וה-RNA יימצאו בשכבה המימית העליונה, בעוד שחלבונים, ליפידים ופוליסכרידים יימצאו באינטרפזה ובשכבה האורגנית התחתונה. הסר בזהירות את השכבה המימית מבלי להפריע לאינטרפזה והעבר אותה למבחנה חדשה. לעיתים קרובות, לאחר הסבב הראשון של הצנטריפוגה, האינטרפזה רפויה וחוזרת אחורה.נדרש ביצוע מיצויים באמצעות נפחים קטנים של מים. ניתן למצוא את הפרוטוקול למיצויים חוזרים (back extractions) בטקסט המלווה סרטון זה. חזור על שלבים אלה עד שהממשק יהיה נקי, דבר שמושג בדרך כלל לאחר שלוש עד חמש חזרות, על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם, איזואמיל אלכוהול לדגימת ה-DNA.שלב זה משרת את אותה מטרה כשל פנול לבדו, אך הוא מחדד את הממשק כדי למקסם את תנובת ה-DNA. חזור על הליך זה פעם או פעמיים עד שהממשק יהיה נקי וחד. כעת, לאחר שהדגימה נקייה מחלבונים, יש להסיר כל RNA מזוהם.דבר זה מושג באמצעות RNAs. מתווסף לדגימה RNAs A לפירוק בריכוז סופי של 100 micrograms per mil, והדגימה מדוגרת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כעת, לאחר שה-RNA עבר פירוק, יש להסיר את אנזים ה-RNAA.יש לחזור על הליך ניקוי ה-DNA כפי שבוצע קודם לכן. שימוש ראשוני בפנול רווי בבופר ולאחר מכן מעבר לפנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול יצמצם את מספר שלבי הניקוי הנדרשים, שכן הזיהומים היחידים שנותרו כעת הם אנזים ה-RNA A ו-RNA מעוכב. כעת, כאשר הדגימה מכילה DNA בלבד, יש להשקיף את ה-DNA מהתמיסה על ידי הוספת נפח של 1/10 סודיום אצטט ונפח אחד של איזופרופנול.לחלופין, ניתן להוסיף שני וחצי נפחים של אתנול, אך במקרה זה יידרש מבחנה גדולה יותר. הדגרו את הדגימה בטמפרטורה של 20- °C למשך 30 דקות עד שעה, או במהלך הלילה אם אתם עובדים בשעות מאוחרות. כעת, מכיוון שאתם עובדים עם DNA, ודאו שהדגימה נשארת על קרח כדי למנוע את פירוקה.סבבו את הדגימה ב-14,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לשקיע את ה-DNA המשוקק. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות כדי לא להזיז את המשקע, במטרה להסיר מלחים עודפים שעלולים להפריע לניסויים מאוחרים יותר כמו ריצוף. לדוגמה, הוסיפו 1 mL של ethanol 70% מקורר וערבבו בעדינות כדי להחזיר את הדגימה למצב של תליה (resuspend).סבבו את הדגימה פעם נוספת במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו בזהירות את supernatant והניחו לכל שארית אתנול להתייבש באוויר למשך עד חמש דקות. חשוב לא לייבש את הדגימה יתר על המידה.לבסוף, ה-DNA מטוהר ומוכן להמסה מחדש בבופר לבחירתכם. כאן אנו משתמשים במים מזוקקים שעברו אוטוקלאב. זהו.אחסנו את דגימות ה-DNA בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר השלמת האקסטרקציה, יש להעריך את האיכות והכמות של ה-DNA. פעולה זו מבוצעת באמצעות ספקטרומטריה באמצעות NanoDrop 2000; הגדירו את סוג המדידה כ-nucleic acid, בחרו ב-DNA 50 לצורך החישוב, ובצעו כיול למכשיר באמצעות 1.5 µL של מים.נקה את תושבת המדידה (pedestal) ובצע מדידת בלאנק (blank) באמצעות 1.5 µL של מדלל. במקרה זה, מים מזוקקים. נקה את תושבת המדידה, טען 1.5 µL של דגימה ולחץ על כפתור המדידה. כן. מצוין.יחס של 1.8 בין A260 ל-A280 הוא אידיאלי בשלב זה. ה-DNA שלכם מוכן לשימוש ביישומים המשכיים, הכוללים, בין היתר, מערכים (Arrays), היברידיזציה גנומית השוואתית, שיקוע חיסוני של DNA מתילציה (Methylated DNA immunoprecipitation) וריצוף.הקישורים לפרוטוקולים אלו מוצגים כאן, למקרה שלא יהיו נחוצים באופן מיידי. אחסנו את הדגימות שלכם בטמפרטורה של 20- °C לשימוש מאוחר יותר.

dna-extraction-from-paraffin-embedded-material-for-genetic-epigenetic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ"א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

בסרטון זה, אנו מדגימים את העיבוד של FFPE או חלקים משובצים פרפין קבוע פורמלין המתקבלים מרקמת הגידול במערכת העיכול. שלבי deparaffinization ו rehydration מאפשרים עיבוד של דגימת הרקמה עבור יישומים אנליטיים הבאים.

Deparaffinization ו rehydration של קטעי רקמות: הליך דו-שלבי להסרת שעוות פרפין משקופיות רקמת FFPE ואחריו התייבשות רקמות

הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. פרוטוקול מוצג לאסוף לטהר ליבות קרח העד של קרקעות וקרח. עדר מושבות אקסוגניים ו- DNA מראה כי מיקרואורגניזמים זוהה מייצג את החומר, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד.

הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

פרוטוקול חילוץ שונה זה משפר תשואות רנ"א ודנ"א מאזורים ממוקדים באופן מדויק יותר של עניין גושי רקמת histopathologic.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

שומות hydatidiform הם הריונות אנושיים חריגים עם aetiologies הטרוגנית שניתן סיווג על פי תכונות מורפולוגיות שלהם תרומת הורים הגנום הטוחנת. כאן, פרוטוקולים של הננו-DNA מיקרולוווין של דנ א וזרימה cy, הרקמה הקבועה של formalin-מוטבע הרקמות הטוחנת מתוארים בפרוטרוט, יחד עם התוצאות ' פרשנות ואינטגרציה.

דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת

פרוטוקול זה מציג שיטה להגדלת תכולת הגידול באחוזים של דגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין.

שיפור תכולת הגידול באמצעות מקרו-דיסקציה של הגידול

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

פרוטוקול זה מאפשר חילוץ היסטונים יעיל מדגימות קליניות שונות לניתוח לאחר שינוי תרגומי על ידי LC-MS/MS. על ידי הקלה על זיהוי חזק של שינויים מרכזיים בהיסטונים, היא משמשת ככלי חשוב לפרופילינג אפיגנטי מקיף בקבוצות קליניות גדולות.

חילוץ היסטונים מדגימות קליניות לפרופיל אפיגנטי באמצעות ספקטרומטריית מסה

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

למד פרוטוקול לחילוץ DNA מדגימות FFPE לניתוח גנטי אפיגנטי. השיטה כוללת הסרת פרפין, ריאודרציה ועיכול רקמות לקבלת DNA איכותי למחקר מולקולרי.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

גלה סרטונים נוספים