Name: 在活细胞中的荧光寿命成像分子转子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用荧光寿命成像显微技术（FLIM）和荧光分子转子对活细胞进行粘度成像。该方法可生成单细胞粘度分布图，揭示不同细胞区域的微环境特性，为研究细胞动力学提供非侵入性工具。

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M.K.K. 感谢英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）生命科学交叉领域项目提供的个人博士后资助。我们还感谢英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）提供的经费支持。

FLIM 样本制备的方案与共聚焦或基于强度的宽场荧光显微镜的方案并无差异。在完成数据采集后，主要任务是进行数据分析，即从原始数据中提取荧光寿命。一旦获得这些数据，进一步的数据解读将有助于验证或证伪科学假设。
1. 使用分子转子对细胞进行染色
<ol>
	<li>使用精确天平和移液器，将约 1 mg/ml 的染料溶解于适当的溶剂中（例如，BODIPY-C12 使用甲醇），配制 10 ml 储存液6,7。</li>
	<li>待染色的细胞（本实验采用模式癌细胞系 HeLa）在多孔板中培养，板底为适用于显微镜观察的盖玻片结构，并在 37 °C、5 % CO2 的培养箱中培养至细胞融合度约 80%。</li>
	<li>向多孔板（Wafergen SmartSlide 50 微型培养系统）每孔中的活细胞加入 10–20 μl 储存液，每孔加入 4 ml Opti-MEM 培养基（GIBCO），用于 6 孔板体系。此操作可使孔内染料达到微摩尔浓度。</li>
	<li>将多孔板放回 37 °C、5 % CO2 的培养箱中孵育 10–45 分钟，以完成染色。</li>
	<li>从培养箱中取出多孔板，用 4 ml 透明细胞培养基（如 Opti-MEM）洗涤细胞 3–4 次，以去除多余的染料。</li>
	<li>将多孔板转移至显微镜载物台上，并根据需要连接温度控制器和 5 % CO2 气体输入装置，准备成像。</li>
</ol>
2. 细胞中荧光分子转子的荧光寿命成像
<ol>
	<li>将样品置于显微镜载物台上，获取透射光和荧光图像以识别荧光细胞。实验装置的示意图见图1。确认荧光来自预期的位置（例如细胞膜、细胞质）。获取荧光发射光谱，并验证其为预期的染料或蛋白质的光谱，此处应为分子转子的光谱。作为阴性对照，对未染色样品进行成像，并确认其无荧光信号。尽管此步骤并非FLIM实验所必需，但通常建议执行，有助于确认样品的真实性。</li>
	<li>切换至FLIM模式——可通过将反射镜移出荧光检测光路实现（在Leica TCS SP2采集控制软件的“光路设置”面板上点击“外置检测器”按钮）。荧光检测光路中必须放置合适的荧光发射滤光片，以阻止激发光到达检测器。</li>
</ol>
<img alt="用于荧光寿命成像和衰减分析的脉冲激光TCSPC装置示意图。" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行时间域荧光寿命成像（FLIM）的实验装置。
<ol start="3">
	<li>扫描样品，并在控制 FLIM 采集的计算机上检查探测器计数率（Becker &amp; Hickl SPC 830 板采集控制软件中标记为 CFD 的黑色条）是否不超过激光重复频率（采集控制软件中标记为 SYNC 的绿色条）的大约 1%。如果超过，则降低激光激发强度，例如在激光光路中插入中性密度滤光片，以避免采集到因堆积效应而失真的荧光衰减曲线。</li>
	<li>采集一幅 FLIM 图像，通常持续 3-5 分钟，停止扫描并保存原始数据（一个由空间坐标 x 和 y 以及时间构成的三维数据“立方体”）。</li>
	<li>在荧光衰减分析软件包（例如 TRI-214 或商业软件）中打开原始数据，以显示荧光强度图像。该图像即为每个像素中荧光衰减曲线的积分值，即荧光衰减曲线下的面积。</li>
	<li>通过将光标置于典型像素上选择该像素，并检查该像素中的荧光衰减曲线。如果峰值计数低于 100，则使用像素空间 binning 方法。将相邻像素（例如 3×3 或 5×5）的计数累加至中心像素，从而在该位置获得更高的峰值计数。这将为下一步提供更高的统计准确性。或者，可延长采集时间重新测量（步骤 5）。若采集时间为 30-50 分钟，峰值计数（及总计数）可提高约 10 倍，但对于大多数生物样品而言，此时间过长，容易因样品移动、显微镜漂移、光毒性和光漂白而引入伪影。</li>
	<li>选择一个全局像素阈值（高于该阈值的像素荧光衰减将被拟合），并对图像进行单指数衰减拟合。拟合结果为每个高于阈值的像素提供一个荧光寿命值，并以颜色编码。每个像素根据拟合结果着色，从而获得一幅 FLIM 图。检查不同像素的约化卡方值（reduced chi-squared）——接近 1（最高至 1.3）表示拟合良好。检查相应的残差，其应围绕零值随机分布。</li>
	<li>荧光寿命直方图显示特定荧光寿命出现的频率与荧光寿命本身的关系。调整颜色范围，使荧光寿命分布适配于颜色范围内。</li>
	<li>如果单指数拟合未能得到约 1（最高至 1.3）的卡方值，且残差存在系统性偏离零值的情况，则需要采用更复杂的模型。例如，尝试使用双指数模型拟合荧光衰减曲线，以反映探针可能所处的两种不同环境。该拟合还将给出前置指数因子或振幅，可指示染料在不同环境中相对含量。或者，可采用拉伸指数函数（stretched exponential function）来描述荧光寿命的分布情况。</li>
	<li>随后可将每个像素的荧光寿命、前置指数因子、寿命比值以及前置指数因子比值的结果以颜色编码。每个像素根据其数值着色，从而获得由荧光寿命、前置指数因子及其比值引起的对比度图像。再次检查约化卡方值（也可用颜色编码并以图像形式显示）——接近 1（最高至 1.3）表示拟合良好。检查残差，其应围绕零值随机分布。</li>
	<li>所有图像均应附带荧光寿命直方图，以便直观地观察平均荧光寿命值及荧光寿命分布情况。</li>
</ol>
3. 典型结果
图2展示了在甲醇/甘油混合溶剂中，随着黏度增加，测得的荧光分子转子的荧光衰减曲线。荧光衰减呈单指数形式，且荧光寿命随黏度变化显著。其寿命从甲醇（黏度0.6 cP）中的约300 ps增加至95%甘油（黏度950 cP）中的3.4 ns。
<img alt="荧光强度衰减图；粘度对衰减时间的影响；光谱分析。" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. BODIPY-C12 在不同粘度的甲醇/甘油混合物中的荧光衰减曲线。6
荧光分子转子的荧光寿命 τ 与黏度 η 的对数校准曲线如图 3 所示。该曲线为一条直线，符合 Förster-Hoffmann 方程的要求9
<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="弛豫时间公式 τ=z/k₀ηˣ；用于流体动力学分析的数学表达式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1">
其中 k0 是辐射速率常数，且 z 和 x 为常数，且 0&lt;x&lt;两边取对数可得
<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="显示聚合物分析中黏度关系的公式：log τ=log(z/k₀)+x log η。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2">
其中 x 为直线的斜率。
<img alt="log τ 与 log η 线性关系图；科学研究中的数据趋势分析。" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. BODIPY-C12 的荧光寿命对数与黏度对数的关系图呈一条直线，符合 Förster-Hoffmann 方程。6
将活细胞与荧光分子转子共孵育后，在荧光图像中可观察到点状染料分布。图4显示了与中位取代的BODIPY染料共孵育的HeLa细胞的FLIM图像。图像中每个像素的荧光衰减可通过单指数衰减模型进行充分拟合。
<img alt="荧光寿命成像显微镜、细胞图像、伪彩图、光激发分析。" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. （a）用 BODIPY-C12 染色的 HeLa 细胞的荧光强度图像和（b）荧光寿命成像显微（FLIM）图像。明亮且呈点状的区域表现出比其他区域更短的寿命。根据 Förster-Hoffmann 方程，这种较短的寿命对应于点状区域（可能是脂滴）的较低黏度。
通过绘制从每个像素提取的寿命值，我们获得了整幅图像的荧光寿命直方图，如图5所示。
<img alt="荧光寿命直方图，带有高斯拟合曲线，显示光谱研究中的数据分布。" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 来自用中位取代的BODIPY分子转子染色的HeLa细胞FLIM图像的荧光寿命直方图。

<ol><li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm%3A+Volume%2C+viscosity.+diffusion%2C+intracellular+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology+-+a+Survey+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

荧光寿命成像（FLIM）相较于基于荧光强度的成像具有一些关键优势。由于FLIM能够将光物理事件与荧光团浓度效应区分开来，因此可以检测那些通过荧光强度成像难以或无法观察到的现象。这一特性在利用荧光分子转子对细胞内黏度进行成像时尤为有用。如图3所示，荧光寿命可通过校准曲线直接转换为黏度值，且该过程不受荧光分子转子浓度的影响。
在荧光寿命成像（FLIM）中，可能存在一些伪影，从而增加数据分析的难度。10 仪器相关的伪影包括散射光，其会在荧光衰减起始处形成一个峰，可能被误认为是短衰减时间；或在仪器响应函数（IRF）之后出现的小峰，可能是显微镜内部反射所致。这些散射光伪影可通过光谱分辨加以识别，因为它们始终与激发光波长相同。记住光在空气中每纳秒传播30厘米，有助于准确定位反射的来源。
滤光片或玻璃的荧光也可能导致伪影，尤其是在样品荧光较弱时，但通过在无样品条件下进行测量即可轻松识别：若在此情况下仍检测到衰减信号，则该信号源于仪器本身，与样品无关！另一方面，需注意样品的自发荧光也可能对荧光衰减产生贡献。
在时间相关单光子计数（TCSPC）中，时间-幅度转换器（TAC）的非线性效应可能导致拟合效果不佳，但可通过阻断激发光并让环境光（例如透射光源的光）照射到样品上并测量其时间信号来识别该问题。图像的每个像素应获得恒定的背景信号。若某些区域的背景出现偏离恒定值的情况，则这些区域始终无法获得良好的拟合结果，若无法通过调整TCSPC卡的参数予以消除，应在测量中予以避免。
TCSPC 中一个著名的伪影是光子堆积效应，它由过高的光子探测速率引起。11,12 这会导致仅对第一个光子进行计时，而忽略后续的所有光子，因为电子系统正忙于对第一个光子进行计时和处理。堆积效应会引起荧光寿命的缩短，避免该问题的最佳方法是将光子计数速率保持在激光重复频率的约 1% 左右。
展望
荧光寿命成像（FLIM）有多种实现方式，根据具体应用，每种方法都有其优势和局限性。13 理想的荧光显微镜能够在单次测量中以单光子灵敏度、最高空间分辨率和最短采集时间，获取包含强度、位置、寿命、波长和偏振等多维信息的完整荧光发射轮廓。目前尚无技术具备这一独特的综合特性，实现这样的显微镜仍是仪器开发领域的一大挑战。将新的物理技术应用于细胞生物学中的重要问题，往往是获得意外发现的途径；而我们距离充分挖掘荧光成像在细胞生物学中的潜力还有很长的路要走。事实上，对荧光寿命、光谱和偏振等参数的成像，以及在更高空间分辨率下更快地进行三维成像，必将揭示细胞生物学中新的层面。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;含荧光分子转子的样品&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;硬件：&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt; 倒置式徕卡TCS SP2共聚焦扫描显微镜 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;相干 Mira 900 钛宝石飞秒激光器，配备 Verdi V6 泵浦激光器，或滨松 PLP-10 470 皮秒脉冲二极管激光器激发光源&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;贝克尔 &amp;amp; Hickl SPC 830 板卡，运行于 3 GHz、Pentium IV、1 GB RAM 的计算机，操作系统为 Windows XP&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;冷却的烧杯 &amp;基于滨松H5773P-01光电倍增管的Hickl PMC100-01探测器探头，安装于显微镜上&amp;rsquo;s X1端口，或混合检测器&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;DCC 100 检测器控制模块&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;软件：&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt; TRI-2&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt; 或 Becker 的 SPCImage 2.8 &amp;amp; Hickl&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

活细胞中分子转子的荧光寿命成像

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

扩散通常是化学反应或生物过程中的重要限速步骤，并在多种细胞内事件中发挥作用。黏度是影响分子和蛋白质扩散的关键参数之一，黏度的变化与细胞水平的疾病和功能障碍相关1-3。尽管测量整体黏度的方法已较为成熟，对微黏度进行成像仍具挑战性。直到最近，获取微观物体（如单个细胞）的黏度分布图仍十分困难。利用荧光技术进行黏度成像具有优势，因为与其他光学技术类似，该方法侵入性极小、无损，并可应用于活细胞和组织。
荧光分子转子的荧光寿命和量子产率取决于其微环境的黏度4,5。分子内扭转或旋转会导致激发态通过非辐射途径回到基态。在高黏度环境中，这种旋转或扭转受到抑制，从而限制了非辐射衰减通路的可及性，导致荧光量子产率和荧光寿命增加。对作为荧光分子转子的改性疏水性BODIPY染料进行荧光寿命成像（FLIM）表明，这些探针的荧光寿命是其微环境微黏度的函数6-8。荧光寿命与溶剂黏度的对数关系图呈一条直线，符合Förster-Hoffman方程9。该图还可作为校准曲线，用于将荧光寿命转换为黏度值。
将活细胞与修饰后的BODIPY荧光分子转子共同孵育后，在荧光图像中可观察到呈点状分布的染料信号。活细胞中这些点状区域的黏度值约为水和细胞胞质黏度的100倍。6,7 时间分辨荧光各向异性测量所得的旋转相关时间，与这些较高的微黏度值相符。荧光寿命成像不依赖于荧光强度，因此能够区分探针浓度与黏度效应。
综上所述，我们开发了一种基于荧光分子转子荧光寿命成像（FLIM）技术的实用且多功能的方法，用于绘制细胞内的微黏度分布。

荧光寿命成像（FLIM）已成为一种关键技术，用于成像活细胞中特定蛋白质和染料的环境及其相互作用。利用荧光分子转子的FLIM可实现对活细胞内黏度的成像图谱绘制。

扩散通常是化学反应或生物过程中的重要速率决定步骤，并在细胞内多种过程中发挥重要作用……

以下实验的总体目标是对活细胞中的荧光分子转子进行荧光寿命成像显微术（FLIMM）分析。该目标通过首先用经修饰的疏水性Bo dippy染料对细胞染色来实现，这些染料作为分子转子发挥作用，其荧光寿命取决于所处微环境的黏度。第二步，使用共聚焦激光扫描显微镜进行时间域痰液成像。随后，将数据拟合至指数衰减曲线，以获得每个像素的荧光寿命。通过绘制荧光寿命成像图中各像素提取出的寿命值，可生成荧光寿命图谱及伴随的荧光寿命直方图。可以通过全图像获取荧光寿命的直方图，从而实现对活细胞中不同细胞区域的微粘度进行 Mapping。单个细胞的粘度图谱直到最近都难以获得。利用荧光技术进行粘度 Mapping 具有优势，因为该方法具有最小侵入性、非破坏性，因此可应用于活细胞和组织。为我演示该实验操作的是我的博士生和实验室的博士后研究助理 Dr.James Levit。荧光是一种多参数信号，可通过位置、强度、波长、寿命和偏振特性进行表征。我们尤其关注位置和寿命。在开始本实验操作之前。将LAR细胞接种于多孔板或培养皿中，置于显微镜载物台上，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞汇合度达到约80%。随后，使用精密天平准确称取足量的BO dipy C12染料，用于配制10毫升D储备液，浓度约为1毫克/毫升，用移液管将染料溶解于甲醇中。接着，向每孔含有4毫升细胞培养基的活细胞中加入10至20微升D储备液。这将在孔中产生微摩尔浓度的染料。将细胞放回培养箱中孵育，以完成染色。用四毫升光学透明的细胞培养基将细胞洗涤三到四次。使用培养基去除多余的染料。根据需要，将多孔板转移至连接温度控制器和5%二氧化碳气体入口的显微镜载物台上，准备对细胞进行成像。在开始对细胞内的荧光分子转子进行荧光寿命成像（flim）采集之前，先获取透射光和荧光图像，以识别出荧光标记的细胞。验证荧光是否来自细胞内预期的位置。荧光应呈现为点状分布，同时伴有在整个细胞中更弥散的染色。通过在不同波长区域扫描图像，获取荧光发射光谱。确认该光谱符合预期的饮食或蛋白质特征。此处展示的分子转子的发射光谱应在约490纳米处开始急剧上升，于约515纳米处达到峰值，并在约600纳米处逐渐减弱；作为阴性对照图像，使用非ST染色样品，验证其不产生荧光。接下来，通过将一面镜子移出荧光检测光路，切换至FLIM模式。在荧光检测光路中加入适当的荧光发射滤光片，以阻挡激发光到达探测器。进入 flimm 模式后，准备对样品进行扫描。确保探测计数率不超过激光重复频率的约 1%。如果存在此情况，请降低激光激发强度，例如通过在激光光路中放置中性密度滤光片来实现。为避免采集到因堆积效应而失真的荧光衰减曲线，通常采集三到五分钟的稀疏图像后，停止扫描并保存原始数据。原始数据是一个三维数据立方体，包含空间坐标 X 和 Y，以及时间维度。将原始数据导入荧光衰减分析软件包中进行处理。图中显示的是 Becker 和 Hickle 提供的一幅 SPC 图像。该图像为荧光强度图像，即荧光衰减曲线的积分结果。在每个像素中，通过将光标置于其上选择一个典型像素。检查该像素的荧光衰减情况。如果峰值计数低于100，则通过将相邻像素的计数累加到中心像素，进行像素的空间合并，以获得更高的峰值计数。这将为下一步提供更高的统计准确性。接下来，选择一个全局像素阈值，并对图像应用单指数衰减拟合。结果得到阈值以上每个像素的荧光寿命。软件使用彩虹色谱为每个像素分配一种颜色。然后根据拟合结果对每个像素进行着色，从而从荧光图像获得荧光寿命图；通过绘制特定荧光寿命出现频率相对于荧光寿命本身的分布图，得到荧光寿命直方图。该图应呈钟形曲线，其平均值应与其他关于细胞中Bo JPC 12的研究结果一致，并调整颜色范围，使荧光寿命分布落在指定的寿命范围对应的颜色区间内。在各个像素处，检查不同像素的卡方约化值（reduced chi squared values）。数值约为1至1.3表明拟合良好，需检查相应的残差，其应围绕零值随机分布。若单指数拟合未得到良好的卡方值，且残差存在系统性偏离零值的情况，则需要采用更复杂的模型。使用合适的软件包将数据拟合为双指数衰减，以反映两种不同探针环境的存在。拟合结果还将给出前置指数因子（即振幅），这些参数可指示某一环境中饮食相对含量的差异。随后，可将荧光寿命和前置指数因子的结果以颜色编码，如同之前每个像素根据其数值着色并相互对比。为获得每个像素的寿命比值和前置指数因子比值，需检查约化卡方值，以确认拟合效果良好。检查残差，这些残差应再次随机分布在零值周围。所有图像均应附带荧光寿命直方图，以便于直观显示平均荧光寿命值及荧光寿命分布情况。图中展示了分子转子在黏度逐渐增加的甲醇-甘油混合物中测得的荧光衰减曲线。荧光衰减呈单指数形式，且荧光寿命随黏度变化显著。其值从甲醇中的约300皮秒增加到95%甘油中的3.4纳秒。以荧光寿命的对数对黏度的对数作对数校准曲线图，BO DPC 12 符合强制性霍夫曼方程，呈现一条直线。与分子转子共同孵育的细胞的荧光强度清晰显示了分子转子在细胞内的摄取，呈点状 D 分布，可能位于脂滴中。图中展示了与 Bo DPC 12 共同孵育的 LAR 细胞的痰液图像。明亮的点状区域表现出比细胞质区域更短的荧光寿命，根据 Förster-Hoffman 方程，这对应于较低的黏度。图像中每个像素的荧光衰减可通过单指数衰减模型进行充分拟合。通过绘制从每个像素提取出的荧光寿命，可获得整幅图像的荧光寿命直方图。观看本视频后，您应能充分理解如何利用荧光分子转子对活细胞内的黏度进行成像分析。

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