Name: تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: اكتشف طريقة تحسين تصوير مستقبل الاستروجين ألفا في شرايين الفأر الدماغية باستخدام المجهر المناعي الرقمي. هذه التقنية تتيح للباحثين دراسة وظائف البروتينات في الأنسجة الوعائية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد العمل لهذا المشروع من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01 - NR5339 وجامعة الخدمات الموحدة للعلوم الصحية ، R061LD.

1. العزلة وإعداد الشرايين بيال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الفئران هو تخدير وتأمين ادخال قسطرة في شريان ويروي مع الأزرق ايفانز 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 1X. سفن بيال صمة عار تماما مع صبغة زرقاء ايفانز جعلها أسهل للعزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المخ وتخزينها في -70 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. على النحو الأمثل ، يجب أن تكون مخزنة العقول لا تزيد على 2 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح الشرايين إزالة حنوني (متوسط ​​قطرها 35-50 ميكرون) من سطح الدماغ. سحب قبالة بعناية جميع الشرايين الزرقاء الملطخة من سطح الظهرية والجانبية من القشرة باستخدام ملقط الجميلة ذات الرؤوس. إزالة الأنسجة الزائدة القشرية ملتصقة قبل ان يضع في تثبيتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الشرايين التي تحصد في بارافورمالدهيد الباردة 2 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.1M لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الشرايين لتصب sectioning المتوسطة التضمين على تجميد القرص / تشاك (وضعت في -20 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الفرع شرين منبسطة على تشوك aالثانية وانتظر حتى التجميد. المكان بقوة تصل السفينة الأيمن على القرص تجميد ناظم البرد على تضمين وسائل الاعلام مع غيض من الشريان باتجاهك. لأنه عقد مع ملاقط حتى يتم تجميد بقوة عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القرص مع تجميد السفينة في الرأس ناظم البرد وقطع 8 ميكرومتر حلقات شرين حنوني مع ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المقاطع شرين على الكروم والبوتاسيوم والجيلاتين SUBBED الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح أعد في مربع الشريحة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> 2. ER - α يلطخ مناعي اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الشرائح صب 1-1،5 مل 0.1M PBS (ما يكفي لتغطية جميع الفروع) اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة ، واستنزاف وكرر الإجراء مرتين أكثر من ذلك. كل حافة الشريحة لديها علامة مسعور. وبالتالي ، يبقى السائل على سطح الشريحة. مع كل الغسيل يسكب السائلالخروج واستبدال الطازجة PBS M 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في 1 مل من كلوريد الأمونيوم 50mM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحد من مضان الذاتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الشرائح في 0.1 ٪ تريتون - X 100 زائد 1 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. للحد من المنظمات غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات مع الجسم المضاد الأولي (الأرنب النسائل المتعددة المضادة للER - α ؛ 1:500) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ تريتون - X + 1 ٪ بين عشية وضحاها NGS في 4 درجات مئوية. </li></ol> اليوم 2 <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأخضر ولاية أوريغون 488 أرنب الثانوية للسامية في NGS 1 ٪ +0.1 ٪ تريتون - X100 + برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. من هذه الخطوة ، يجب القيام بالخطوات التالية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد ظلntilated هود ، ضع قطرة من 1 4 ، 6 - 2 - diamidino phenylindole (دابي) ، بالإضافة إلى وسائل الإعلام المتزايدة على السفن ثم ضع زلة تغطي أكثر من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مسمار البولندية واضحة لختم حواف الغطاء زلة. لا تتحرك الشرائح حتى تجف تماما ، والتي تأخذ حوالي 24 ساعة. </li></ol> 3. التصوير الرقمي الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير ER - α في السفينة حنوني شريحة نستخدم الكسوف نيكون المجهر الرقمي 80i الفلورسنت مع المرشحات لمدة 3 ألوان (الأزرق والأخضر والأحمر) مجهز بكاميرا رقمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف شرائح محضرة مع شرائح سفينة حنوني الملون تحت المجهر وضبط لتصور المناطق fluorescently المسمى الفائدة. تبدأ عند التكبير ثم إلى زيادة X100 X600 التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكاميرا لالتقاط الصور في دابي (الأزرق) وFITC (الأخضر) قنوات للنواة الخلية (دابي) وER - α (أوريغون الأخضر) باستخدام نيكون التركيز العمق البرامج الموسعة لتحويل عرض متعددةق قطاعات السفينة الى 2 - D الصور. </li></ol> 4. ممثل النتائج : نحن المترجمة مستقبلات هرمون الاستروجين في الأوعية الشريانية α حنوني باستخدام مسابر الفلورسنت والتصور الأمثل الذي نعيش فيه من مستقبلات باستخدام المجهر مضان الرقمية. للكشف عن وجود مستقبلات ، أرنب الضد الأولية النسائل المتعددة والخضراء ولاية أوريغون كانت تستخدم الأجسام المضادة الثانوية 488 المسمى لصورة المستقبلات في الشرايين حنوني المعزولة من سطح الدماغ. أيضا ، وهو وصمة عار النووية (دابي) كانت تستخدم لتحديد نواة الخلية وتحديد ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف المستقبلات الموجودة في نواة منذ أن تم الإبلاغ عن ER - α أن يكون حاضرا في cyotosol الخلية والنواة. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تجارب للتحقق من صحة تأكيدي خصوصية الضد الابتدائية وملزمة للتحقق من الثانوية إلى الضد الأولية. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. مناعي لتلطيخ ER - α (الخضراء) وcounterstaining مع دابي (الأزرق) في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 1A دمج الصور يدل على وجود بعض الاستروجين intranuclear مستقبلات - A (السهم) التين و1B 1C هي صورة مركزة من ER - α الذي هو مزيج من Z - المكدس الصور. أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في مستويين مختلفين. تشير الأسهم مستقبلات الاستروجين α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. تلطيخ مناعي للمجموعات التحكم في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. ويبين الشكل 2E السفينة دون الضد الثانوية (لاحظ تألق ذاتي متميزة جنبا الى جنب مع البطانية). أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في احطائرات NT.

<ol><li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+compounds%2C+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li>
<li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+estrogens%3A+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li>
<li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+effects+of+oestrogen%3A+multiplicity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Parmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li>
<li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels%3A+regulation+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li>
<li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha%2C+but+not+-beta%2C+in+en+face+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li>
<li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+my+antibody+staining+specific%3F+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li>
<li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+and+Circ%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li>
<li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li>
<li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li>
<li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEBJ+Abstracts%22%5BJournal%5D)">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxical.+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li>
<li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+immunoreactants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li>
</ol>

الآراء التي أعرب عنها هي تلك التي من المؤلفين ولا تعكس السياسة الرسمية أو الموقف من جامعة الخدمات الموحدة لعلوم الصحة ، وزارة الدفاع ، أو حكومة الولايات المتحدة.

سابقا ، وأظهرت لنا أنه بعد عابرة العالمية إصابات الدماغ الإقفاري هو الاكتئاب بشكل ملحوظ قدرة الشريان حنوني لتغيير الإطارات استجابة لكلا موسعات 7 و 8 و 9 في الفئران vasoconstrictors ovariectomized الشباب. المزمنة امتلاء الاستروجين يستعيد ردود حركي 7-9. كذلك ، تأخر استبدال الاستروجين يعكس الآثار المفيدة لهرمون الاستروجين على توسيع الاوعيه الدمويه قدرة الشريان حنوني 10 يقودنا إلى التساؤل عما إذا استنزاف طويلة الأمد الاستروجين يؤثر ER - α الكثافة في cerebrovasculature. خططنا لاستخدام العلامات مناعي الغربية جنبا إلى جنب مع النشاف لتقييم التغيرات في التعبير ER - α استجابة لهرمون الاستروجين استنزاف المزمنة. لأن كان لدينا بعض الصعوبة في التصور مجموعات منفصلة من المستقبلات تعديل الأسلوب الذي كنا نظهر هنا. ولذلك ، كان هدفنا الأساسي في هذه الدراسة لتطوير أول طريقة بسيطة نسبيا لتحسين البصرسعودة من المستقبلات في الشرايين حنوني. في اتفاق مع عدة تقارير 6،11،12 وجدنا أنه من الضروري إجراء تعديلات لنوع من الأنسجة كنا التحقيق ، وسماكة العينة ، وتوزيع ER - α في السفينة ، فضلا عن درجة غير محددة وملزمة . لدينا وسيلة فعالة جدا لتصور وجود ER - α في شرائح حنوني السفينة. ولكن كما سبق وأشار آخرون إلى نجاح استخدام هذه الأساليب تعتمد بشكل كبير على نوعية وتركيز الأجسام المضادة ، ومكان التحت خلوية من البروتينات التثبيت والفائدة والبروتوكولات وحظر التعامل مع النسيج 12. قبل التصور الاستعدادات السفينة قضينا لدينا الوقت للعمل على كل هذه المتغيرات. وأبرزت كيف أننا كنا في حاجة إلى تعديل بعض من نهجنا في هذه الورقة. حددنا لتصور مثالي ER - α في الشرايين حنوني وهذا قدم بعض التحديات.أولا ، بلغ متوسط ​​حجم الشريان الفئران حنوني ما بين 35-50 ميكرومتر صنع العزلة وإزالة من سطح الدماغ صعبة بعض الشيء. وجدنا أن نضح مع ايفانز صبغة زرقاء قبل التضحية يجعل من السهل تشريح الشرايين. يمكن أن تؤثر على الأزرق ايفان مضان ، لكننا نرى أن الاستفادة من استخدام هذه الصبغة تفوق سلبياته طفيفة. في بروتوكول لدينا هي تغسل سفن عدة مرات. هذا يقلل من الصبغة المتبقية في السفن ، ويقلل من الآثار المحتملة للصباغة على مضان. وقد واجهنا صعوبة أخرى أن سمك شرائح حنوني السفينة التي تصور واضح لمستقبلات صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، لم نتمكن من الحصول على صور واضحة على نحو خاص بسبب الأرجح إلى حقيقة أن تناثرت ER - α طوال عدة طبقات الخلية. حاولنا العمل مع شرائح طولية السفينة (كما فعل آخرون) ، ولكن نظرا لحجم حنوني الصغيرة كان من الصعب التعامل مع السفن ومنع السفن من التواء في حين تصاعدحتى على الشرائح باستخدام المجهر. أخيرا ، فإننا تعديل بنجاح أسلوبنا باستخدام ناظم البرد وقطع السفينة العابرة للحكيم في لحلقات 8 ميكرومتر سميكة. الحلقات هي أسهل في التعامل معها ويمكن تركيبه على عدة شريحة واحدة. حصلت مرة واحدة ونحن السفن شعرنا أنه من الضروري اختبار فعالية فلاش first تجميد الأنسجة ثم إصلاح السفن ، كما اقترح Danseshatalb والزميلة 11. على الرغم من أن وجدنا أقل هامشيا المناعي الخلفية ، لاحظنا أيضا أن مستقبلات أقل الملون بشكل مكثف مما تصور من مستقبلات أكثر صعوبة. وبالتالي ، فإننا نفضل أن أول من تجميد كامل الدماغ وتخزينها لحين الحاجة إليها (بين عموما 1-2 أشهر). نحن ثم سحب السفن قبالة صفه وإصلاح السفن قبل التقطيع مع ناظم البرد. كما علينا أن نظهر هنا. خطوة واحدة اللازمة لتشغيل الضوابط الأولية مع كل من وحدة الأضداد الثانويةلتحديد نوعية وخلفية المناعي. الاستروجين يمكن أن الأجسام المضادة لمستقبلات α يكون من الصعب التعامل معها. في الواقع ، حاولنا 3 الأجسام المضادة الأولية مختلفة (1 حيدة النسيلة والنسائل المتعددة 2) قبل كانوا راضين نحن مع نجاح تلطيخ مستقبلات لدينا. كجزء من الرقابة لدينا ونحن أول من التحقق من نوعية الأجسام المضادة الأولية عن طريق السهو من إضافة الأجسام المضادة الأولية. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. لا يوجد أي تلطيخ ومجرد إشارة الخلفية قليلا. منذ الضد الرئيسي هو النسائل المتعددة ، هناك بعض منتشر تلوين الخلفية غير محددة. ثانيا ، قمنا بإضافة الأجسام المضادة الأولية ، ولكن ليس على الأجسام المضادة الثانوية (الشكل 2E) يمكن للمرء أن يرى هامشا لطيفة تمثل autofluoresence على طول الحدود البطانية للأوعية الدموية. وهذا يتفق مع العمل والزميلة دان 5. ومع ذلك ، فإن أيا من نقاط صغيرة من المناعي التي تمثل ER - α ، ولا المرجع ظهور حبيباتيمكن lecting وجود العديد من المستقبلات دون أن يتم الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. لاحظنا وجود نمط متميز من autofluoresence على طول هوامش البطانية للأوعية الدموية. هذه التجارب المستقلة لخصوصية جسم مهمة لأنها تؤكد خصوصية الضد لER - α والأجسام المضادة الثانوية بربط الأولية. في الختام ، كما يتبين من قبل الآخرين 4 و 5 الأوعية الدموية في الدماغ تحتوي على العديد من ER - α النوع الفرعي المستقبلات. في أيدينا ، وإعداد 8μm شرائح مقطعية عرضية من الشرايين حنوني معزولة يعزز تلطيخ وتصور من المستقبلات. استخدام الطرق التقليدية المجهري مبائر لفحص العينات. لديها القدرة لعرض مقاطع من المسلسل البصرية العينات سميكة هو المهم الاستفادة من المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، يمكن شراء مجهر مبائر جيد أن تكون مكلفة جدا. باستخدام الموسعة العمق (EDF) والبرمجيات ، وجدنا أنيمكن أن تقلل من تكاليف المعدات لدينا. باستخدام المجهر الفلورسنت مع EDF حصلنا على صور واضحة وقادرة على تصور حنوني الشرياني ER - α على عدة مستويات باستخدام Z - المداخن. وهناك فائدة كبيرة من البرامج EDF هو أنه يسمح التقاط الصور بطريقة فعالة لخلق صورة 3 - D من الصور. ربما للمختبرات التي لا يستطيعون الوصول إلى مجهر مبائر أو الأموال لشراء واحدة المجهر الرقمي الفلورسنت مع البرامج المخصصة يكون خيارا عمليا وأقل تكلفة وفقا لأهداف محقق.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> زرقة إيفانس </td><td> سيغما </td><td> E - 2129 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> سيغما </td><td> P - 5493 </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> فيشر العلمية </td><td> T353 </td></tr><tr><td> الأنسجة تيك مجمع أكتوبر </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> كلوريد الأمونيوم </td><td> سيغما </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> سيغما </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> الماعز العادي المصل </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER - α جسم الأرنب النسائل المتعددة </td><td> سانتا كروز </td><td> H - 184 </td></tr><tr><td> أوريغون الأخضر 488 أرنب المضادة مفتش الماعز </td><td> Invitrogen </td><td> O - 11038 </td></tr><tr><td> تصاعد Vectashieldالمتوسطة لل مضان مع دابي </td><td> ناقلات مختبر </td><td> H - 1200 </td></tr></tbody></table>

تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

وتتوسط العديد من الآثار الاستروجين على التفاعل الأوعية الدموية من خلال التفاعل مع مستقبلات الاستروجين 1 ، 2 ، 3. رغم أن عضوين أنواع فرعية موجودة (مستقبلات هرمون الاستروجين وα β) ، وقد تم التعرف على الاستروجين مستقبلات α في العضلات والسلس على حد سواء في الخلايا البطانية قطاعات الشرياني حنوني به تلطيخ الفلورسنت جنبا إلى جنب مع ليزر متحد البؤر المسح المجهري 4. علاوة على ذلك ، يقع ER - α في نوى والسيتوبلازم الشرايين القاعدي الفئران 5. المستقبلات وفيرة ويتألق الزاهية ، ولكن تصور واضح لمجموعات منفصلة من المستقبلات من الصعب على الأرجح بسبب الأعداد الموجودة في طبقات الخلية العديد من قطاعات السفينة حنوني. بالإضافة إلى ذلك ، العديد من التقارير باستخدام تقنيات المناعى يقترن المجهري مبائر سيئة بالتفصيل الاحتياجات الحرجة للاستنساخ التجارب 6. هدفنا لهذا المقال هو لوصف تقنية بسيطة لتحسين رانه تلطيخ وتصور ER - α باستخدام مستعرضة شرائح الشرايين حنوني الحصول على أدمغة الفئران من الإناث. يروي لنا first الفئران مع ايفانز صبغة زرقاء من التعرف بسهولة الشرايين السطحية حنوني الذي نحن عزل تشريح تحت المجهر. استخدام ناظم البرد لشريحة 8 أقسام ميكرومتر عبر الشرايين يسمح لنا للحصول على أقسام السفينة رقيقة جدا ان طائرات سفينة مختلفة تصور أكثر وضوحا. قطع عبر السفينة بدلا من استخدام قطعة صغيرة السفينة في الاستفادة من عرض أسهل من طبقات العضلات البطانية وسلس. بالإضافة إلى ذلك ، استخدام مجهر مناعي الرقمية مع تمديد البرنامج عمق تنتج صورا واضحة من 10-12 سفينة طائرات مختلفة وأقل كلفة من استخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر.

هدف هذه المقالة هو لاظهار طريقة لتحسين كشف مناعي α من مستقبلات هرمون الاستروجين (ERα) في الشرايين حنوني شرائح الفئران باستخدام المجهر الرقمي مناعي.

تتم العديد من تأثيرات الإستروجين على التفاعلية الوعائية عبر التفاعل مع مستقبلات الإستروجين 1، 2، 3. وعلى الرغم من وجود نوعين فرعيين (إستروجين...

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تقنية بسيطة لتحسين صبغ وتصور مستقبل الإستروجين ألفا باستخدام مقاطع عرضية من شرايين القشرة التي تم الحصول عليها من أدمغة إناث الجرذان. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة شرايين القشرة المصبوغة بصبغة إيفانز الزرقاء من سطح الدماغ، ثم تقطيعها إلى حلقات بسمك ثمانية ميكرون باستخدام جهاز الميكروتوم التجمدي (cryostat) بعد عملية التقطيع. بعد ذلك، يتم تثبيت المقاطع العرضية على شرائح وزراعتها مع الجسم المضاد الأولي ضد مستقبل الإستروجين ألفا.بعد ذلك، تُحضن المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي والصبغة المضادة باستخدام أوساط تثبيت تحتوي على dpi. وفي النهاية، يتم تصوير قطاعات الأوعية الدموية للقشرة الموّسمة فلورياً وتحويلها إلى صور ثنائية الأبعاد باستخدام برنامج التركيز العميق الممتد. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستقبلات الإستروجين ألفا في شريينات القشرة من خلال استخدام مجهر Nikon المناعي الفلوري المزود ببرنامج التركيز العميق الممتد.اسمي الدكتورة مارجريت ليتلتون كيرني. سيقوم اليوم الدكتور نيل فاراني، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح إجراء بسيط من أجل تحسين عملية التصوير والصبغ لمستقبل الإستروجين ألفا (estrogen receptor alpha) في القشرة.يتم استخراج الشرايين من دماغ جرذ تم ترويته بصبغة إيفانز الزرقاء (Evan's blue) وحُفظ في درجة حرارة 70- درجة مئوية. باستخدام مجهر تشريحي، يتم تحديد الشرايين القشرية على سطح الدماغ وإزالتها باستخدام ملقط دقيق الطرف، مع الحرص على إزالة أي أنسجة دماغية ملتصقة.ضع الشرايين في أنبوب اختبار صغير على الثلج. ثبّت الشرايين في فورمالدهايد مبرد بتركيز 2% في 0.1 mole من PBS لمدة 30 دقيقة. ولتحضير الشرايين للتقطيع، صب وسط التضمين على قرص تجميد مضبوط عند درجة حرارة -20 °C.ضع مقطعاً من الشريان بشكل مسطح على القالب والانتظار حتى يتجمد. وبمجرد أن يتجمد بإحكام، ضع الشريان بشكل عمودي في وسط التضمين على قرص التجميد الخاص بالمجهر المبرد (cryostat). تأكد من أن طرف الشريان موجه إلى الأمام.ثبّت الشريان باستخدام الملقط حتى يتجمد تماماً. ضع قرص التجميد الذي يحتوي على الشريان في رأس الميكروتوم المجمد (cryostat)، ثم قم بقص حلقات شريانية رقيقة بسمك ثمانية ميكرون مباشرة على شريحة. ثبّت المقاطع الشريانية على جيلاتين بوتاسيوم الكروم.قم بتسوية الشرائح باستخدام فرشاتي طلاء لفرد الحلقات الشريانية. احفظ الشرائح المُجهزة في صندوق شرائح في الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. أخرج الشرائح من الثلاجة واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة على سطح المختبر.اغسل الشرائح باستخدام 1 إلى 1.5 ملليلتر من PBS بتركيز 0.1 مولار. بعد 10 دقائق، صرّف الـ PBS وكرر العملية مرتين إضافيتين. بعد الغسلة الأخيرة بالـ PBS، حضّن الشرائح في ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم بتركيز 50 ميليمولار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ومن أجل تقليل الفلورة الذاتية، اغسل الشرائح في PBS بتركيز 0.1 مولار 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة كما تم وصفه سابقاً. بعد ذلك، قم بحجب الشرائح في محلول PBS يحتوي على 0.1% Triton X 100 بالإضافة إلى 1% مصل ماعز طبيعي لمدة 30 دقيقة لتقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية.بعد عملية الحجب، تُحضن الشرائح مع الجسم المضاد الأولي ضد ER alpha المخفف بتركيز 1:500 في محلول الحجب طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. تُخرج الشرائح من الثلاجة وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. يُغسل أي جسم مضاد أولي غير مرتبط باستخدام 1 إلى 1.5 milliliters من 0.1% PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.في كل مرة، يتم تحضين الشرائح مع Oregon Green, 4 88 secondary anti rabbit في محلول الحجب لمدة ساعتين في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، تُغسل الشرائح في 0.1 molar PB S ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة، ثم تُنقل إلى غطاء محرك التهوية. ضع قطرة من وسط التثبيت الذي يحتوي على dappy على العينات، ثم ضع غطاءً زجاجياً فوق العينة. استخدم طلاء أظافر شفافاً لإغلاق حواف الغطاء الزجاجي واتركه ليجف تماماً.ضع الشرائح المُعدة التي تحتوي على قطع الأوعية المقشرة والمصبوغة تحت المجهر، واضبط التركيز لرؤية المناطق ذات الأهمية المحددة بصبغة فلورية. وتعد عملية رؤية ER alpha المصبوغة الخطوة الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. ابحث عن مستوى قطع الوعاء الذي تظهر فيه المستقبلات بأكبر قدر من الوضوح.ابدأ باستخدام تكبير 100 مرة ثم زد التكبير إلى 600 مرة. استخدم الكاميرا لالتقاط صور في قناتي DPI وZI لنوى الخلايا وDR alpha على التوالي، ثم استخدم برنامجاً لتحويل طرق عرض متعددة لقطع الأوعية إلى صور ثنائية الأبعاد. هنا، تظهر نتائج صبغ المناعة الفلورية لـ ER alpha باللون الأخضر مع الصبغ المضاد بـ DPI.في اللون الأزرق في حلقة شريان تم عزلها من دماغ جرذ أنثى، تشير الصور المدمجة إلى وجود مستقبل الإستروجين ألفا داخل النواة. من خلال استخدام مجموعة من صور Zack، يمكن الحصول على صورة مركزة للفلورة المناعية لمستقبل الإستروجين ألفا لمحاسبة الفلورة الذاتية؛ ويجب إجراء ضوابط سلبية للفلورة الذاتية لكل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لاحظ الفلورة الذاتية المتميزة على طول الجانب البطاني للشريان الذي لم يتم تحضينه مع الجسم المضاد الثانوي.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب معرفة بكيفية عزل وتقشير الشرايين من سطح الدماغ وإعداد حلقات مقطعية بعرض ثمانية ميكرون. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصبح على دراية بكيفية استخدام مستقبلات الإستروجين ألفا الموصومة فلورياً، وكيفية تصوير هذه المستقبلات باستخدام مجهر التألق المناعي الرقمي وبرنامج Nikon extended.

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة نموذج بسيط لتحفيز الأوعية الدموية في مساريق الفئران. نموذج تنتج زيادات هائلة في مجال الشعرية، التي تنتشر الأوعية الدموية والأوعية الدموية أكثر كثافة دورة زمنية قصيرة نسبيا في الأنسجة التي تسمح EN تصور وجه من شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كله وصولا الى مستوى خلية واحدة.

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

وظيفة الخلايا الوعائيةتعتمد على نشاط الرسل داخل الخلايا.  الموصوفة هنا هي طريقة تصوير الفوتون خارج الجسم الحي تسمح بقياس مستويات الكالسيوم وأكسيد النيتريك داخل الخلايا استجابة للمنبهات الفسيولوجية والدوائية في خلايا البطانية والعضلات الملساء الفردية في الشريان الأورطي المعزول.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

نقدم هنا بروتوكولا لوصف توطين مستقبلات الأنجيوتنسين II من النوع 1 في دماغ الفئران عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي الكمي ، وقياس الكثافة ، في المختبر باستخدام نظير اليود 125 المسمى من الأنجيوتنسين II.

بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

تقدم هذه الدراسة أسلوب angiographic ثنائي الأبعاد بسيط لدراسة هياكل الأوعية الدموية غرامة استخدام سيليكون مطاط حقن المركب ولينة نسيج النظام بالأشعة السينية.

الأوعية ثنائي الأبعاد بالأشعة السينية لدراسة هيكل الأوعية الدموية الدقيقة باستخدام مركب حقن مطاط سيليكون

علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع--يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.

البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا مباشرة لعزل الشرايين من شبكية الفئران التي يمكن استخدامها في الكهربية، الكالسيوم التصوير والضغط ميوجرافي الدراسات.

عزل الشرايين الشبكية للدراسات فيزيولوجيا الخلية السابقين فيفو

هنا، نقدم بروتوكول او تلطيخ مناعة لمراقبة الخلايا البطانية للأبهر الفأر مباشرة. هذه التقنية مفيدة عند دراسة النمط الظاهري الخلوي والجزيئي للخلايا البطانية في أنماط تدفق مختلفة وفي تطوير تصلب الشرايين.

استخدام تلطيخ الفلورة المناعية للوجه لمراقبة الخلايا البطانية الوعائية مباشرة

هنا، نصف بروتوكول لتصور وتحليل الشرايين القوس البلعوم3، 4، و 6 من أجنة الفئران باستخدام كامل جبل الفلورالس، تطهير الأنسجة، المجهر الكونكور، وإعادة الإعمار 3D.

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

حفظ المجهر البصريات نظيفة المهم للتصوير عالية الجودة. الغبار وبصمات الأصابع ، وفائض النفط الغمر ، أو التركيب أو المتوسطة في الحد من أسباب المجهر وعلى النقيض من القرار. دبي انترناشيونال كابيتال حساس خصوصا للتلوث والخدوش على السطوح العدسة. هذا البروتوكول تفاصيل هذا الإجراء لإبقاء المجهر نظيفة.

العناية والتنظيف السليم للمجهر

اكتشف طريقة تحسين تصوير مستقبل الاستروجين ألفا في شرايين الفأر الدماغية باستخدام المجهر المناعي الرقمي. هذه التقنية تتيح للباحثين دراسة وظائف البروتينات في الأنسجة الوعائية بدقة عالية.

تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي

استكشف المزيد من الفيديوهات