Name: גל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד להפריד קטעי DNA בגדלים שונים באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. השיטה מאפשרת הדמיית פסי DNA וקביעת גודל הקטעים במדויק באמצעות סמן DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את המסה המתאימה של agarose לתוך הבקבוק Erlenmeyer. ג &#39;ל agarose מוכנים באמצעות aw / פתרון V אחוז. ריכוז agarose ב ג&#39;ל יהיה תלוי בגדלים של קטעי דנ&quot;א להיפרד, עם רוב הג&#39;לים שנעו בין 0.5% -2%. נפח המאגר לא צריך להיות גדול מ 1/3 של קיבולת של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פועל חיץ כדי agarose בקבוק המכיל. מערבולת לערבב. ג&#39;ל הנפוץ ביותר הם פועל מאגרים טה (40 מ&quot;מ טריס, אצטט, 1 mM EDTA) ו TBE (45 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תערובת agarose / חיץ. הדבר נעשה בדרך כלל על ידי חימום במיקרוגל, אבל יכול להיעשות גם על אש בונזן. ב 30 מרווחי ים, להסיר את הבקבוק ו מערבולת התוכן לערבב היטב. חזור על הפעולה עד agarose נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ethidium ברומיד (EtBr) לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לחלופין, ג&#39;ל עשוי גם להיות מוכתם לאחר אלקטרוphoresis בניהול מאגר המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​EtBr במשך 15-30 דקות, ואחריו destaining בניהול חיץ לאורך שווה של זמן. </li></ol> הערה: EtBr הוא קרצינוגן חשד חייב להיות מסולק כראוי לכל התקנות של המוסד. כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג&#39;לים המכילים EtBr. צבעים חלופיים צביעה של ה-DNA זמינים, אך EtBr נשאר אחד הפופולריים ביותר וזאת עקב רגישותה ואת העלות. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose להתקרר גם על benchtop או הדגירה של אמבט מים 65 מעלות צלזיוס. אי ביצוע הוראה זו יהיה עיוות מגש ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש הג&#39;ל לתוך מנגנון הליהוק. לחלופין, ניתן גם להדביק את הקצוות הפתוחים של מגש ג&#39;ל ליצור עובש. מניחים מסרק מתאימה לתבנית ג&#39;ל ליצור את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את agarose מותכת לתוך תבנית ג&#39;ל. אפשר agarose להגדיר בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ואת המקום ג&#39;ל בתיבה ג&#39;ל. לחילופין, ה-Gאל ניתן גם עטוף בניילון ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש (איור 1). </li></ol> 2. הקמת מנגנון ג&#39;ל והפרדה של שברי ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טעינת צבע על דגימות דנ&quot;א להיפרד (איור 2). ג&#39;ל טעינת צבע מורכב בדרך כלל בריכוז 6X (0.25% bromphenol כחול, cyanol קסילן 0.25%, 30% גליצרול). טוען הצבע עוזר כדי לעקוב אחר כמה רחוק דגימת DNA שלך נסעה, וגם מאפשר דגימה לשקוע ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית כבל חשמל למתח הרצוי (1-5V/cm בין האלקטרודות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ פועל מספיק כדי לכסות את פני השטח של ג&#39;ל. חשוב להשתמש המאגר פועל זהה לזה המשמש להכנת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את תיבת הפניות של ג&#39;ל על ספק הכוח. הפעל את אספקת החשמל ולוודא כי הן תיבת ג&#39;ל ואת אספקת החשמל פועלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה. לאטבזהירות לטעון את דגימת DNA (ים) לתוך הג&#39;ל (איור 3). סמן המתאים לגודל ה-DNA תמיד צריך להיות טעון יחד עם דגימות מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה התיבה ג&#39;ל. הקתודה (מוביל שחורים) צריך להיות קרוב יותר בארות מאשר מוביל (אדומים) האנודה. בדוק את האלקטרודות מחוברים לאותה החריצים הנכונים באספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את המחשב. הפעל את הג&#39;ל עד צבע העביר את המרחק המתאים. </li></ol> 3. התבוננות שברי ה-DNA מופרדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה השלימה, לכבות את החשמל והסר את המכסה של תיבת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל מתיבת ג&#39;ל. מסננים את עודפי חיץ מפני השטח של ג&#39;ל. מניחים את המגש ג&#39;ל על מגבות נייר כדי לספוג את כל המאגר פועל נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל ממגש ג&#39;ל ולחשוף את הג&#39;ל לאור UV. הדבר נעשה בדרך כלל באמצעות תיעוד ג&#39;ל המערכת (איור 4). להקות ה-DNA צריך להראותבתור להקות ניאון כתומות. לצלם את הג&#39;ל (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו שצריך להיפטר ג&#39;ל ו חיץ פועל לפי תקנות המוסד. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 5 מייצג את התוצאה בדרך כלל אחרי אלקטרופורזה בג&#39;ל agarose של מוצרי ה-PCR. לאחר ההפרדה, את שברי ה-DNA וכתוצאה מכך נראים כמו פסים ברורים. תקן ה-DNA או סולם יש להפריד במידה המאפשרת קביעת שימושית של גדלים של להקות לדוגמה. בדוגמה המוצגת, שברי ה-DNA של 765 נ&quot;ב, 880 נ&quot;ב ו 1022 BP מופרדים על 1.5% agarose ג&#39;ל יחד עם סולם 2-log-DNA. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> באיור 1. הקרושה agarose ג&#39;ל לאחר הסרת מסרק. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> איור 2. תלמיד הוספת צבע טוען את דגימות ה-DNA שלה. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> איור 3. התלמיד טוען דגימת DNA לתוך באר ג&#39;ל. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> איור 4. דוגמה של מערכת תיעוד ג&#39;ל. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> איור 5. התמונה אלקטרופורזה של ג&#39;ל הודעה. EtBr נוספה ג&#39;ל אלקטרופורזה לפני לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, ואחריו ההפרדה V 100 במשך שעה 1. ג&#39;ל נחשף לאור UV ו תמונה לקחה עם מערכת תיעוד ג&#39;ל.

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , 3rd, (2001).</li>
<li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+agarose+gel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis+of+large+DNA+molecules%3A+theory+and+applications%22%5BJournal%5D)">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R%E2%80%A2EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li>
<li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li>
<li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+electrophoresis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li>
<li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li>
<li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDevor%2C+EJ+%22IDT+tutorial%3A+gel+electrophoresis%22">IDT tutorial: gel electrophoresis</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf">http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf</a> (2010).</li>
<li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gels%3A+properties+and+use+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li>
<li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion%3A+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose%2C+carrageenan+and+galactomannans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li>
<li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוכיח את עצמו באופן יעיל ואפקטיבי של הפרדת חומצות גרעין. כוח ג&#39;ל גבוהה של agarose מאפשרת טיפול של ג&#39;ל שיעור נמוך להפריד את שברי דנ&quot;א גדולים. סנון מולקולרית נקבעת על ידי גודל של הנקבוביות שנוצר על ידי צרורות של agarose 7 במטריצה ​​ג&#39;ל. באופן כללי, ככל שעולה ריכוז agarose, קטן יותר גודל הנקבוביות. מסורתית ג&#39;ל agarose יעילים ביותר ההפרדה של שברי ה-DNA בין 100 נ&quot;ב ו -25 KB. להפריד בין שברי דנ&quot;א גדולים יותר מ -25 קילו, 1 תצטרך להשתמש בג&#39;ל הדופק בתחום אלקטרופורזה 6, הכוללת את היישום של זרם חילופין משני כיוונים שונים. בדרך זו יותר שברי דנ&quot;א בגודל מופרדות המהירות שבה הם לכוון את עצמם עם שינויים בכיוון הנוכחי. קטעי דנ&quot;א קטנות יותר מ -100 נ&quot;ב מופרדים בצורה יעילה יותר באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שונהagarose ג&#39;ל, ג&#39;ל מטריקס polyacrylamide נוצר באמצעות תגובה כימית רדיקלים חופשיים מונע. ג&#39;ל אלו הם דקים יותר של ריכוז גבוה יותר, מופעלים אנכית יש רזולוציה טובה יותר. ב-DNA המודרנית רצף אלקטרופורזה נימי משמש, לפיה צינורות נימי מלאים מטריקס ג&#39;ל. השימוש צינורות נימי מאפשר יישום של מתח גבוה, ובכך שהיא מאפשרת את ההפרדה בין שברי דנ&quot;א (וקביעת רצף ה-DNA) במהירות. Agarose יכול להיות שונה כדי ליצור התכה נמוכה agarose דרך hydroxyethylation. התכה נמוכה agarose משמש בדרך כלל כאשר הבידוד של שברי הדנ&quot;א המופרדים הרצוי. Hydroxyethylation מפחיתה את צפיפות האריזה של חבילות agarose, ובכך מפחיתה ביעילות גודל הנקבוביות שלהם 8. משמעות הדבר היא כי קטע DNA באותו גודל ייקח זמן רב יותר כדי לעבור התכה נמוכה agarose ג&#39;ל בניגוד ג&#39;ל agarose סטנדרטי. כי החבילות לקשר זה עם זהדרך לא קוולנטיים אינטראקציות 9, ניתן להמיס מחדש ג&#39;ל agarose לאחר הקימה. EtBr הוא מגיב הנפוץ ביותר להכתים-DNA agarose ג&#39;ל 10. בעת חשיפה לאור UV, האלקטרונים טבעת ארומטית של המולקולה ethidium מופעלים, מה שגורם לשחרור של האנרגיה (אור) כחזרה אלקטרונים למצב בשטח. EtBr עובד על ידי intercalating עצמו מולקולת ה-DNA באופן תלוי ריכוז. זה מאפשר הערכה של כמות ה-DNA בלהקה כל ה-DNA מסוים על בסיס עוצמתו. בגלל מטען חיובי שלו, את השימוש EtBr מפחית את שיעור ההגירה DNA ב -15%. EtBr הוא mutagen החשוד כמסרטן, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול ג&#39;ל agarose המכילים אותו. בנוסף, EtBr נחשב פסולת מסוכנת וצריך להיות מסולק כראוי. כתמים חלופיים-DNA ג&#39;ל agarose כוללים SYBR זהב, SYBR ירוק, קריסטל ויולט מתיל כחול. מבין אלה,מתיל כחול קריסטל ויולט אינם דורשים חשיפת הג&#39;ל לאור UV להדמיה של להקות ה-DNA, ובכך להפחית את הסיכוי של מוטציה אם ההחלמה של שבר דנ&quot;א בג&#39;ל הוא הרצוי. עם זאת, הרגישות שלהם נמוכה מזו של EtBr. SYBR זהב SYBR ירוק, שניהם רגישים מאוד, צבעים תלויים סגול עם רעילות נמוכה EtBr, אבל הם הרבה יותר יקר. יתר על כן, כל צבעי חלופיים או לא יכול להיות או לא עובדים טוב כאשר הוסיף ישירות ג&#39;ל, ג&#39;ל ולכן יהיה חייב להיות מוכתם הודעה לאחר אלקטרופורזה. בגלל הקלות עלות, תועלת, ורגישות, EtBr עדיין הצבע המועדף על חוקרים רבים. עם זאת, במצבים מסוימים, כגון כאשר סילוק פסולת מסוכנת או קשה כאשר תלמידים צעירים מבצעים ניסוי, צבע פחות רעיל עשוי להיות מועדף. צבעים טוען המשמשים ג&#39;ל אלקטרופורזה לשרת שלוש מטרות עיקריות. ראשית הם מוסיפים צפיפות מדגם, שמאפשר לו לשקוע ג&#39;ל. שנית, צובעת את לספק צבע ולפשט את תהליך הטעינה. לבסוף, צבעים נעות במחירים סטנדרטיים באמצעות ג&#39;ל, המאפשר הערכה של מרחק כי שברי דנ&quot;א היגרו. בגדלים המדויקים של קטעי דנ&quot;א מופרדות ניתן לקבוע על ידי התוויית יומן של משקל מולקולרי של להקות שונות של תקן ה-DNA על המרחק של הלהקה כל אחד. תקן ה-DNA מכיל תערובת של קטעי דנ&quot;א של שנקבעו מראש בגדלים שניתן בהשוואה מול דגימות ה-DNA ידועים. חשוב לציין כי צורות שונות של ה-DNA לעבור ג&#39;ל בקצב שונה. ה-DNA פלסמיד Supercoiled, בגלל קונפורמציה קומפקטית שלה, עובר דרך ג&#39;ל המהירה ביותר, ואחריו קטע DNA ליניארי באותו גודל, עם צורה עגולה פתוח נסיעה האיטי ביותר. לסיכום, מאז אימוץ agarose ג&#39;ל בשנות ה -1970 להפריד את ה-DNA, יש לוהוכחה אחת הטכניקות הכי שימושי צדדי במחקר מדעי ביולוגי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אני agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> בור חומצה </td><td> סיגמא </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> סיגמא </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד </td><td> סיגמא </td><td> E7637 </td><td> מסרטנים, צריך להיות מסולק כמו פסולת מסוכנת </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> דיג </td><td> BP2401-212 </td><td> מאכל </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenדואר cyanol FF </td><td> סיגמא </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> החוקר / FX ג&#39;ל מערכת תיעוד </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ינשוף Easycast B1 מיני ג&#39;ל אלקטרופורזה מערכת </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-dna

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוא הדרך היעילה ביותר להפרדת קטעי ה-DNA בגדלים שונים הנעים בין BP 100-25 KB 1. Agarose מבודד סוגים אצות Gelidium ו Gracilaria, והוא מורכב agarobiose חזר (L-ו-D-גלקטוז) יחידות משנה 2. במהלך gelation, פולימרים agarose לקשר לא קוולנטית וליצור רשת של חבילות אשר גודל הנקבוביות לקבוע מאפיינים מולקולריים של ג&#39;ל סנון. השימוש בג&#39;ל אלקטרופורזה agarose מהפכה ההפרדה של ה-DNA. לפני אימוץ agarose ג&#39;לים, ה-DNA הופרדו בעיקר באמצעות צפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה, שרק סיפק הערכה של גודל. להפריד בין ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל, ה-DNA הוא נטען לתוך מראש יצוק בארות ג&#39;ל ו יישומי הנוכחי. עמוד השדרה של ה-DNA פוספט (ו-RNA) הוא מולקולה טעונים שלילית, ולכן כאשר הניח שדה חשמלי, שברי דנ&quot;א יהיה להגר עמ &#39;טעונה ositively האנודה. כי ה-DNA יש יחס אחיד המונית / תשלום, מולקולות ה-DNA מופרדים לפי גודל בתוך ג&#39;ל agarose בדפוס כזה המרחק הוא ביחס הפוך יומן של משקל מולקולרי שלה 3. הדגם המוביל של תנועת ה-DNA באמצעות ג&#39;ל agarose הוא &quot;מוטה reptation&quot;, לפיו החדשנית נע קדימה ומושך את שאר המולקולה יחד 4. שיעור ההגירה של מולקולת הדנ&quot;א דרך ג&#39;ל נקבעת על ידי הבאות: גודל 1) של מולקולת הדנ&quot;א, 2) ריכוז agarose; 3) קונפורמציה DNA 5, 4) יישומית, 5) מתח נוכחות ethidium ברומיד, 6) סוג מאגר agarose ו 7) אלקטרופורזה. לאחר ההפרדה, את מולקולות ה-DNA יכול להיות דמיינו תחת אור UV לאחר מכתים עם הצבע המתאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו שברי ה-DNA מופרדים בתוך מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין כיצד קונפורמציה שלמולקולת ה-DNA תקבע הניידות שלה באמצעות מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הפתרון agarose הריכוז המתאים לצרכיהם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose על אלקטרופורזה של דגימות דנ&quot;א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ג&#39;ל אלקטרופורזה מנגנון אספקת החשמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר המתח המתאים להפריד את שברי ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו ברומיד ethidium מאפשר הדמיה של להקות ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הגדלים של שברי הדנ&quot;א המופרדים </li></ol>

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ&quot;א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז היא הדרך היעילה ביותר להפרדת מקטעי DNA בגדלים שונים, הנעים בין 100 bp ל-25 kb1. אגרוז מבודל מ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפריד מקטעי DNA בגדלים שונים. זאת מושגים תחילה על ידי הכנת ג'ל עם ריכוז מתאים של agarose וצבע פלואורסצנטי. השלב השני הוא מזיגת הג'ל לתבנית מתאימה והמתנה להתקשחותו.הדגימות נטענות לתוך הג'ל ומחילים זרם חשמלי. השלב הסופי הוא ויזואליזציה של מקטעי ה-DNA המופרדים תחת אור על-סגול. לסיכום, אלקטרופורזה של ג'ל AGROS משמשת בכל מצב שבו נדרשת הפרדה שגרתית של מקטעי DNA.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות שהיו קיימות באותה תקופה, כגון סנטריפוגציה במדרג צפיפות של סוכרוז, הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה של פסי ה-DNA, ובנוסף היא מאפשרת לנו לקבוע את הגודל המדויק של מקטע ה-DNA כאשר הוא מופרד במקביל עם DNA marker. שיטה זו חיונית במחקר במדעי החיים, כגון בשכפול גנים ובניקוי וריצוף של מולקולות DNA. אף ששיטה זו משמשת בדרך כלל להפרדת מקטעי DNA בגודל שבין מאה זוגות בסיסים ל-25 kb, ניתן להתאימה גם להפרדת מקטעי DNA בגודל של עד 10 Mb.ג'לי אגרוז מכינים באמצעות תמיסת אחוז משקל לנפח. ריכוז ג'ל האגרוז יהיה תלוי בגדלי מקטעי ה-DNA שיש להפריד. כדי להתחיל בהליך הכנת הג'ל, שקלו את המסה המתאימה של אגרוז לתוך בקראון ארלנמייר, והוסיפו לבקראון את הנפח המתאים של תמיסת ריצה (running buffer).נפח התמיסה לא יעלה על שליש מקיבולת הבקרא. יש לסובב את הבקרא כדי לערבב, ולהמיס את תערובת בופר ה-agarose על ידי חימום במיקרוגל בעוצמה מרבית. במרווחי זמן של 30 שניות, יש להוציא את הבקרא ולסובב את תכולתה כדי לערבב. יש לחזור על הפעולה עד שה-agarose יתרסס לחלוטין.בשלב הבא, הוסיפו Atherium bromide עד לריכוז של 0.5 µg/mL. חשוב לציין כי atherium bromide הוא חומר מסרטן, ולכן יש להשתמש תמיד בכפפות בעת טיפול בג'לים המכילים atherium bromide. הרגישו לאגרוס באמצעות דגירה במקלחת מים בטמפרטורה של 65 °C. אי ביצוע שלב זה יגרום לעיוות של תבנית הג'ל בזמן קירור האגרוס.הכינו את תבנית הג'ל על ידי הצבת מגש הג'ל בתוך מכשיר היציקה. לחלופין, ניתן להדביק בסרט דביק את הקצוות הפתוחים של מגש ג'ל כדי ליצור תבנית. הכניסו מסרק מתאים לתבנית הג'ל כדי ליצור את הבארות.שפכו את התבנית ואת הטבעות לתוך תבנית הג'ל. אפשרו לטבעות להתset בטמפרטורת החדר. לאחר שהטבעות התקשחו, הסירו את המסרק.אם הג'ל לא יעשה בו שימוש באופן מיידי, עטפו אותו בניילון נצמד ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius עד למועד השימוש. אם הג'ל יעשה בו שימוש באופן מיידי, הניחו אותו בתוך קופסת הג'ל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הוסיפו צבע טעינה לג'ל לדגימות ה-DNA המיועדות להפרדה.צבע טעינה מכינים בדרך כלל בריכוז של פי שישה (6x). כעת, לאחר הגדרת ספק הכוח למתח הרצוי, הוסף מספיק תחליל ריצה (running buffer) למכשיר ההרצה כך שיכסה את פני הג'ל. חשוב להשתמש באותו תחליל ריצה ששימש להכנת הג'ל. חבר את המוליכים של מכשיר ההרצה לספק הכוח והפעל את ספק הכוח. ודא ששני הרכיבים, מכשיר ההרצה וספק הכוח, פועלים כראוי.הופעת בועות באלקטרודות מעידה על כך שזרם עובר דרכן. מכיוון שבידיים יש נטייה לרעוד מעט באופן טבעי, ייתכן שיהיה קשה להחדיר טיפ פחית קטן לתוך באר קטנה. דרך אחת למנוע את רעידת היד היא להניח אותה על הזרוע השנייה או על קופסת הג'ל.הסירה את מכסה קופסת הג'ל באיטיות ובזהירות. טען את דגימות ה-DNA אל הג'ל. צבע הטעינה בדגימה מאפשר לה לשקוע אל תוך הג'ל ויסייע במעקב אחר המרחק שעברה הדגימה. יש לטעון תמיד סרגל גודל DNA לצד הדגימות הניסיוניות.החזירו את המכסה. ודאו שוב שהאלקטרודות מחוברות לחריצים הנכונים בספק הכוח. הדליקו את המכשיר והריצו את הג'ל עד שהצבע נדדה למרחק מתאים.עם סיום האלקטרופורזה, כבו את ספק הכוח והסירו את מכסה תיבת הג'ל. הוציאו את הג'ל מתיבת הג'ל ונקזו את עודפי התמימות (buffer) שעל פני השטח של הג'ל. הניחו את תבנית הג'ל על נייר סופג כדי לספוג את שאריות תמימות ההרצה.כדי להנחית את מקטעי ה-DNA, הוציאו את הג'ל מתוך תבנית הג'ל וחשפו אותו לאור ultraviolet. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל באמצעות מערכת תיעוד ג'לים (gel documentation system). פסי ה-DNA אמורים להופיע כפסים פלואורסצנטיים בצבע כתום.צלם את הג'ל בסיום הניסוי, והשליך את הג'ל ואת תמיסת ההרצה (running buffer) בהתאם לתקנות המוסד. דמות זו מייצגת תוצאה טיפוסית לאחר אלקטרופורזה של תוצרי PCR בג'ל אגרוז. לאחר ההפרדה, מקטעי ה-DNA שהתקבלו מופיעים כפסים מוגדרים בבירור.יש להפריד את סטנדרט ה-DNA או את ה-ladder במידה שתאפשר קביעה יעילה של גדלי הפסים של הדגימה. בדוגמה זו, פסי DNA של 765 base pairs, 880 base pairs ו-1022 base pairs מופרדים על ג'ל 1.5%AROS עם two log DNA ladder. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור לבדוק שוב את מיקום האלקטרודות לפני הפעלת הזרם.זאת כדי להבטיח שמולקולות ה-DNA ינועו בכיוון הנכון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מכינים ג'ל אגרוז, מפרידים DNA ומקטעים בגדלים שונים, ומשיגים תמונות מייצגות של התוצאות. זכרו כי עבודה עם ברומיד אתידיום עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות, משקפי מגן ולבישת חלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה electrophoretic הפרדה של חלבונים באמצעות מרובה acrylimide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ"א או רנ"א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ​​ג'ל לפי משקל מולקולרי שלהם.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

למד להפריד קטעי DNA בגדלים שונים באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. השיטה מאפשרת הדמיית פסי DNA וקביעת גודל הקטעים במדויק באמצעות סמן DNA.

ג'ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

גלה סרטונים נוספים