Name: Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende electroforesis en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN en biología molecular. Este método permite visualizar bandas y determinar tamaños de fragmentos con precisión.

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1. Preparación del gel <ol><li> Pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz Erlenmeyer. Los geles de agarosa se preparan usando p / v solución porcentaje. La concentración de agarosa en un gel dependerá de los tamaños de los fragmentos de ADN que se separaron, con la mayoría de los geles que oscilan entre 0,5% -2%. El volumen del tampón no debe ser mayor que 1/3 de la capacidad del matraz. </li><li> Añadir tampón de agarosa al matraz que contiene. Agite para mezclar. El gel más común que los amortiguadores son TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) y de TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Fundir la mezcla de agarosa / tampón. Esto se realiza comúnmente mediante el calentamiento en un horno de microondas, pero también se puede hacer sobre una llama de Bunsen. En intervalos de 30 s, retirar el matraz y agitar el contenido para mezclar bien. Repita hasta que la agarosa se haya disuelto completamente. </li><li> Añadir bromuro de etidio (EtBr) a una concentración de 0,5 g / ml. Alternativamente, el gel puede también ser teñidas después de electroforesis en el funcionamiento de un tampón que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio durante 15-30 minutos, seguido de decoloración en la gestión de búfer por un período igual de tiempo. </li></ol> Nota: EtBr es un carcinógeno y debe desecharse de forma adecuada según las regulaciones de la institución. Los guantes deben ser usados ​​siempre al manipular geles que contienen bromuro de etidio. Tintes alternativos para la tinción de ADN se encuentran disponibles, sin embargo EtBr sigue siendo el más popular debido a su sensibilidad y costo. <ol start="5"><li> Dejar que la agarosa se enfríe bien en la mesa de trabajo o por incubación en un baño de 65 ° C el agua. De no hacerlo, se tuerza la cubeta. </li><li> Coloque la bandeja de gel en el aparato de fundición. Alternativamente, también se puede pegar los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Colocar un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos. </li><li> Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Permitir la agarosa para establecer a temperatura ambiente. Retirar el peine y colocar el gel en el cuadro de gel. Alternativamente, la gEl también puede ser envuelto en una envoltura de plástico y se almacenó a 4 ° C hasta su uso (fig. 1). </li></ol> 2. Puesta en marcha de aparato de gel y la separación de fragmentos de ADN <ol><li> Añadir colorante de carga para las muestras de ADN para ser separados (fig. 2). Gel de carga de colorante se hace típicamente en una concentración 6X (0,25% azul de bromofenol, 0,25% cianol xileno, 30% de glicerol). Cargando medio de contraste ayuda a realizar un seguimiento de hasta qué punto su muestra de ADN ha viajado, y también permite que la muestra se hunden en el gel. </li><li> Programa de la fuente de alimentación a la tensión deseada (1-5V/cm entre los electrodos). </li><li> Añadir tampón suficiente corriente para cubrir la superficie del gel. Es importante utilizar el mismo tampón se ejecuta como el utilizado para preparar el gel. </li><li> Coloque los cables de la caja de gel a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y verificar que tanto la caja de gel y la fuente de alimentación están trabajando. </li><li> Retire la tapa. Despacioy cuidadosamente cargar la muestra de ADN (s) en el gel (fig. 3). Un marcador de ADN de tamaño apropiado se deberán colocar siempre junto con las muestras experimentales. </li><li> Sustituir la tapa para la caja de gel. El cátodo (cables de color negro) debe estar más cerca de los pozos que el ánodo (cables rojos). Compruebe que los electrodos se conectan en las ranuras correctas en la fuente de alimentación. </li><li> Encienda la alimentación. Ejecutar el gel hasta que el colorante ha migrado a una distancia apropiada. </li></ol> 3. Observando separados por fragmentos de ADN <ol><li> Cuando se ha completado la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la caja de gel. </li><li> Quitar el gel de la cubeta. Escurrir el exceso de tampón de la superficie del gel. Coloque la bandeja de gel en las toallas de papel para absorber el búfer adicional en ejecución. </li><li> Quitar el gel de la bandeja de gel y exponer el gel a la luz UV. Esto se realiza comúnmente mediante un sistema de documentación de gel (fig. 4). Las bandas de ADN debe mostrararriba como bandas fluorescentes de color naranja. Toma una fotografía del gel (fig. 5). </li><li> Deseche el gel y el tampón de acuerdo a las normas de la institución. </li></ol> 4. Los resultados representativos La figura 5 representa un resultado típico después de electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. Después de la separación, los fragmentos de ADN resultantes son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o escalera debe ser separado a un grado que permita la determinación útil de los tamaños de las bandas de la muestra. En el ejemplo mostrado, fragmentos de ADN de 765 pb, 880 pb y 1022 pb se separó en un gel de agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN de 2-log. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa después de la eliminación del peine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Un estudiante de la adición de colorante de carga a las muestras de su ADN. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Un estudiante cargar la muestra de ADN en un pozo en el gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Un ejemplo de un sistema de documentación en gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. Una imagen de una electroforesis en gel de mensaje. EtBr se añadió a la electroforesis en gel antes a una concentración final de 0,5 g / ml, seguido de la separación a 100 V durante 1 hora. El gel se expone a la luz UV y la imagen tomada con un sistema de documentación de geles.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una manera eficiente y eficaz de separar los ácidos nucleicos. Alta resistencia del gel de agarosa, permite la manipulación de los geles porcentuales bajos para la separación de grandes fragmentos de ADN. Tamizado molecular se determina por el tamaño de poros generados por los haces de agarosa 7 en la matriz de gel. En general, cuanto mayor sea la concentración de agarosa, menor es el tamaño de los poros. Tradicionales geles de agarosa son más eficaces en la separación de los fragmentos de ADN entre 100 pb y 25 kb. Para separar fragmentos de ADN de más de 25 kb, uno tendrá que utilizar campo pulso electroforesis en gel de 6, que implica la aplicación de corriente alterna a partir de dos direcciones diferentes. De este modo grandes fragmentos de ADN de tamaño están separados por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los cambios en la dirección de la corriente. Los fragmentos de ADN más pequeñas que 100 pb se separó más eficazmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. A diferencia degeles de agarosa, la matriz de gel de poliacrilamida se forma a través de una reacción de radicales libres químico accionado. Estos geles son más delgados de mayor concentración, se corren en forma vertical y tienen una mejor resolución. En el ADN moderno secuenciación electroforesis capilar se utiliza, por lo que los tubos capilares se llenan con una matriz de gel. El uso de tubos capilares permite la aplicación de altas tensiones, lo que permite la separación de fragmentos de ADN (y la determinación de la secuencia de ADN) de forma rápida. La agarosa se puede modificar para crear bajo punto de fusión a través de agarosa hidroxietilación. Agarosa de bajo punto de fusión se utiliza generalmente cuando el aislamiento de fragmentos de ADN separados se desea. Hidroxietilación reduce la densidad de empaquetamiento de los haces de agarosa, la reducción efectiva de su tamaño de poro 8. Esto significa que un fragmento de ADN del mismo tamaño se necesitará más tiempo para mover a través de un bajo punto de fusión en gel de agarosa en oposición a un estándar de gel de agarosa. Debido a que los haces de asociarse con un otroa través de interacciones no covalentes 9, es posible volver a fundir un gel de agarosa después de que se ha fijado. EtBr es el reactivo más común usado para teñir ADN en geles de agarosa 10. Cuando se expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromático de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación de energía (luz) como el retorno electrones a estado fundamental. EtBr funciona por sí mismo intercalando en la molécula de ADN de una manera dependiente de la concentración. Esto permite una estimación de la cantidad de ADN en cualquier banda de ADN particular, sobre la base de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de EtBr reduce la tasa de migración del ADN en un 15%. EtBr es un mutágeno y carcinógeno sospechoso, por lo tanto se debe proceder con cuidado al manipular geles de agarosa que lo contienen. Además, EtBr se considera un residuo peligroso y debe ser desechado de manera adecuada. Manchas alternativos para ADN en geles de agarosa son SYBR Gold, SYBR Green, cristal violeta y azul de metilo. De éstos,El azul de metilo y violeta cristal no requieren la exposición del gel a la luz UV para la visualización de las bandas de ADN, reduciendo así la probabilidad de mutación si la recuperación del fragmento de ADN desde el gel se desea. Sin embargo, sus sensibilidades son menores que el de EtBr. SYBR oro y verde SYBR son altamente sensibles, tintes UV dependientes con menor toxicidad que EtBr, pero son considerablemente más caros. Además, todos los tintes alternativos, o bien no puede ser o no funcionan bien cuando se añade directamente al gel, por lo tanto, el gel tendrá que ser teñido posterior después de la electroforesis. Debido a coste, facilidad de uso, y la sensibilidad, EtBr sigue siendo el tinte de elección para muchos investigadores. Sin embargo, en ciertas situaciones, como cuando la eliminación de residuos peligrosos es difícil o cuando los jóvenes estudiantes están realizando un experimento, un medio de contraste menos tóxicas pueden ser preferibles. Tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propósitos principales. Primero se añade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes se mueven a velocidades estándar a través del gel, lo que permite la estimación de la distancia que los fragmentos de ADN han migrado. Los tamaños exactos de los fragmentos de ADN separados puede determinarse trazando el registro del peso molecular de las distintas bandas de un estándar de ADN contra la distancia recorrida por cada banda. El estándar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN desconocidos. Es importante señalar que las diferentes formas de ADN se mueven a través del gel a diferentes velocidades. ADN plásmido superenrollado, debido a su conformación compacta, se mueve a través de la más rápida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal del mismo tamaño, con la forma circular abierta viajar el más lento. En conclusión, desde la adopción de geles de agarosa en la década de 1970 para la separación de ADN, que tienedemostrado ser una de las técnicas más útiles y versátiles en la investigación ciencias biológicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Agarosa que </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido bórico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerígeno-tiene que ser eliminados como residuos peligrosos </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> G-33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xilemae cianol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigador / FX gel sistema de documentación </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Búho Easycast B1 mini gel de electroforesis del sistema </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 de suministro de energía </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de adn

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

La agarosa electroforesis en gel es la forma más eficaz de separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños que van desde 100 pb a 25 kb 1. La agarosa es aislado a partir de las algas géneros Gelidium y Gracilaria, y consta de agarobiose repetida (L y D-galactosa) subunidades 2. Durante la gelificación, los polímeros de agarosa asociación no covalente y formar una red de paquetes cuyo tamaño de poro determinar un gel de propiedades moleculares de tamizado. El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionado la separación del ADN. Antes de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separó utilizando principalmente de densidad de sacarosa centrifugación en gradiente, que sólo proporcionan una aproximación de tamaño. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de fosfato del ADN (y ARN) molécula está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán a la positively cargo del ánodo. Debido a que el ADN tiene un uniforme relación masa / carga, las moléculas de ADN se separan por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular 3. El modelo principal para el movimiento de ADN a través de un gel de agarosa es &quot;parcial reptación&quot;, con lo que el borde delantero se mueve hacia adelante y tira el resto de la molécula a lo largo de 4. La velocidad de migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por el siguiente: 1) el tamaño de la molécula de ADN, 2) la concentración de agarosa; 3) conformación de ADN 5, 4) la tensión aplicada, 5) presencia de bromuro de etidio, 6) de tipo de tampón de electroforesis en agarosa y 7). Después de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV después de la tinción con un colorante adecuado. Siguiendo este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de: <ol><li> Comprende el mecanismo por el cual los fragmentos de ADN se separan dentro de una matriz de gel </li><li> Comprender cómo la conformación de laMolécula de ADN determinará su movilidad a través de una matriz de gel </li><li> Identificar una solución de agarosa de la concentración adecuada a sus necesidades </li><li> Preparar un gel de agarosa para electroforesis de las muestras de ADN </li><li> La instalación del equipo de electroforesis en gel y la fuente de alimentación </li><li> Seleccionar un voltaje apropiado para la separación de fragmentos de ADN </li><li> Comprende el mecanismo por el cual el bromuro de etidio permite la visualización de las bandas de ADN </li><li> Determinar los tamaños de los fragmentos de ADN separados </li></ol>

Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa se describe.

Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

La electroforesis en gel de agarosa es el método más eficaz para separar fragmentos de ADN de diversos tamaños, que oscilan entre 100 pb y 25 kb1. La agarosa se aisla de...

El objetivo general de este procedimiento es separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Esto se logra primero preparando un gel con la concentración adecuada de aros y un colorante fluorescente. El segundo paso consiste en verter el gel en un molde apropiado y dejar que se solidifique a continuación.Las muestras se cargan en el gel y se aplica una corriente eléctrica. El paso final consiste en visualizar los fragmentos de ADN separados bajo luz ultravioleta. En resumen, la electroforesis en gel AGROS se utiliza en todas las situaciones en las que se requiere la separación rutinaria de fragmentos de ADN.La principal ventaja de esta técnica frente al método existente en ese momento, como la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, es que permite la visualización de bandas de ADN, y también nos permite determinar el signo exacto y el tamaño exacto del fragmento de ADN cuando se separa simultáneamente con un marcador de ADN. Este método es esencial en la investigación de ciencias de la vida, como en la clonación de genes y la purificación y secuenciación de moléculas de ADN. Aunque este método se utiliza generalmente para separar fragmentos de ADN entre cien pares de bases y 25 kilobases, también puede modificarse para separar fragmentos de ADN de hasta 10 megabases de tamaño.Los geles de agarosa se preparan utilizando una solución porcentual peso sobre volumen. La concentración de agarosa y un gel dependerá de los tamaños de los fragmentos de ADN que se vayan a separar. Para comenzar el procedimiento de elaboración de un gel, pese la masa adecuada de agarosa en un matraz erlenmeyer y agregue el volumen apropiado de tampón de corrida al matraz.El volumen del tampón no debe ser mayor a un tercio de la capacidad del matraz. Agite para mezclar y derrita la mezcla de tampón aros calentando en un microondas a potencia máxima. En intervalos de 32 segundos, retire el matraz y agite el contenido para mezclar. Repita bien hasta que los agros se hayan disuelto completamente.A continuación, agregue bromuro de atherium hasta una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Es importante tener en cuenta que el bromuro de atherium es un carcinógeno, por lo que siempre se deben usar guantes al manipular geles que contengan bromuro de atherium. Deje enfriar el agros mediante incubación en un baño de agua a 65 grados Celsius. La falta de hacerlo deformará la bandeja del gel mientras el aros se enfría.Prepare el molde para geles colocando la bandeja de gel en el aparato de vertido. Alternativamente, se puede sellar con cinta los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Coloque un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos.Vierta el molde y los aros en el molde de gel. Deje que los aros se solidifiquen a temperatura ambiente. Una vez que los aros estén solidificados, retire el peine.Si el gel no se va a utilizar inmediatamente, envuélvalo en una envoltura de plástico y guárdelo a cuatro grados Celsius hasta su uso. Si el gel se va a utilizar inmediatamente, coloque el gel en la cubeta para geles. Para comenzar este procedimiento, agregue colorante de carga al gel a las muestras de ADN que se van a separar.La tinción de carga generalmente se prepara al seis x de concentración programada, encienda la fuente de alimentación al voltaje deseado y agregue suficiente tampón de corrida en la cubeta de gel para cubrir la superficie del gel. Es importante utilizar el mismo tampón de corrida que el empleado para preparar el gel, conecte los cables de la cubeta de gel a la fuente de alimentación y encienda la fuente de alimentación. Verifique que tanto la cubeta de gel como la fuente de alimentación estén funcionando correctamente.La aparición de burbujas en los electrodos indica que la corriente está pasando a través de ellos. Dado que nuestras manos tienden a temblar ligeramente de forma natural, puede resultar difícil introducir una punta de pipeta pequeña en un pocillo pequeño. Una forma de evitar que nuestra mano tiemble es apoyarla sobre el otro brazo o sobre la caja de gel.Retire la tapa de la caja de gel lentamente y con cuidado. Cargue las muestras de ADN en el gel. El colorante de carga en la muestra permite que esta se hunda en el gel y ayudará a rastrear qué distancia ha recorrido la muestra. Siempre se debe cargar un marcador de tamaño de ADN junto con las muestras experimentales.Sustituya la tapa. Verifique cuidadosamente que los electrodos estén conectados en los orificios correctos de la fuente de alimentación. Encienda la corriente y corra el gel hasta que el colorante haya migrado una distancia adecuada.Una vez finalizada la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la cubeta de gel. Retire el gel de la cubeta y elimine el exceso de tampón de la superficie del gel. Coloque la bandeja del gel sobre toallas de papel para absorber cualquier tampón de corrida residual.Para visualizar los fragmentos de ADN, retire el gel de la bandeja y exponga el gel a luz ultravioleta. Esto se realiza comúnmente utilizando un sistema de documentación de geles. Las bandas de ADN deben aparecer como bandas fluorescentes de color naranja.Tome una imagen del gel al final del experimento y deseche adecuadamente el gel y el tampón de corrida según las regulaciones de la institución. Esta figura representa un resultado típico tras la electroforesis en gel aros de productos de PCR. Tras la separación, los fragmentos de ADN resultantes aparecen como bandas bien definidas.El patrón de ADN o escalera debe separarse en un grado que permita determinar de forma útil el tamaño de las bandas de la muestra. En este ejemplo, se separan fragmentos de ADN de 765 pares de bases, 880 pares de bases y 1022 pares de bases en un gel de AROS al 1,5 % utilizando una escalera de ADN de dos logaritmos. Al realizar el procedimiento, es importante recordar verificar nuevamente la colocación de los electrodos antes de aplicar la corriente.Esto garantiza que las moléculas de ADN viajen en la dirección correcta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una celda de electroforesis, separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños y obtener imágenes representativas de sus resultados. No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, gafas protectoras y bata de laboratorio, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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