Name: 一种改进的EPA方法1623使用切向流中空纤维超滤和热解离步骤检测水性隐和贾第虫属。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学习使用切向流中空纤维超滤和免疫磁珠分离技术检测水中隐孢子虫和贾第虫的方法。该方案结合热解离步骤和免疫荧光显微镜观察，为环境微生物学和水公共卫生研究提供了一种经济高效的水源性病原体检测手段。

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我们感谢Ann Grimm和Michael Zimmerman对本文稿的审阅，以及Doug Hamilton提供的技术支持。

1. 切向流中空纤维超滤步骤
<ol>
 <li>缓冲液和溶液的配制：
 洗脱液（1 L）： 
 向 1 L 试剂级水中加入 0.1 g 聚磷酸钠、0.1 ml Tween-80 和 0.01 ml Y-30 消泡剂。 </li>
 <li>在生物安全柜中准备滤器组件（图 1）：
 <ol>
 <li>将 Masterflex I/P 73 实验室管路穿过连接至 Masterflex I/P 精密无刷驱动器的 Masterflex I/P Easy-Load 泵头。</li>
 <li>使用螺钉夹将管路固定在泵头上游配备 NPT 分支 T 型接头的 0–60 psi 甘油填充式压力表上，并将管路连接至泵头下游的 HDPE T 型接头。</li>
 <li>通过将 Nalgene 53-B 加液/通气盖装配 Masterflex L/S 15 实验室管路和 T 型接头，并将其固定在 1 L Nalgene 耐用聚丙烯瓶上，组装截留液瓶。</li>
 <li>在 Masterflex L/S 24 管路上安装夹管阀（夹管阀 2），并将该管路从截留液瓶连接至 HDPE T 型接头。</li>
 <li>使用螺钉夹将 Masterflex L/S 24 实验室管路从压力表连接至 Asahi Kasei Rexeed 25S 高通量透析器，并从透析器连接至截留液瓶。使用定制的 DIN 适配器（设计用于适配内径为 ¼" 的管路）将管路连接至中空纤维超滤器。</li>
 <li>在 Masterflex L/S 24 实验室管路上安装夹管阀（夹管阀 1），并将管路连接至已去除尖端和棉塞的 10 ml 塑料移液管，作为样品吸取管路，然后将该管路连接至 HDPE T 型接头。</li>
 <li>在 Masterflex L/S-36 实验室管路的一端安装斜夹阀，并将管路连接至滤器出口端附近的废液口。将另一端置于废液容器中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>向 10 L 水样中加入 0.01%（w/v）聚磷酸钠，混匀 3 分钟。</li>
 <li>关闭夹管阀 2，并从截留液瓶上取下通气盖。所有其他夹具应保持开启状态。</li>
 <li>设置泵的流向，使液体从 T 型接头流向压力表（沿 图 1 从右向左）。将泵速调节至最大速度的 25%，然后启动泵。</li>
 <li>当截留液瓶充满至约 2/3 时，打开夹管阀 2，并迅速将通气盖重新装回截留液瓶。检查所有管路和接头，确保无泄漏。</li>
 <li>缓慢提高泵速至所需的过滤速率（约 1.5 L/min），并检查是否泄漏。使用量筒和计时器或流量计，检测从废液管路排出的水的滤液流速（图 1 中的蓝色 L/S 36 管路）。通常在滤器出口端会形成气泡，导致难以维持稳定的压力和过滤速率。可通过手动短暂捏压废液管路来纠正此问题。该操作通常可促使气泡移向滤液口并经由废液管路排出。根据需要重复操作，需注意豌豆大小的气泡通常难以完全避免。</li>
 <li>监控过滤过程。根据需要测量并记录压力和过滤速率。压力不得超过 20 psi。建议过滤速率不超过 2.0 L/min。必须持续监控截留液瓶中的水量，确保其不被排空。水量轻微增加或减少属正常现象。若截留液瓶中的水位降至不足 1/3，应立即取下通气盖，并关闭截留液瓶管路上的夹管阀 2。将液位恢复至约 2/3，打开夹管阀并迅速重新装上通气盖，确保密封紧密。若截留液瓶中的液位持续快速下降，则应检查瓶盖是否拧紧、通气盖是否牢固安装，以及管路是否仍浸没在水样中。若上述问题均不存在，则可能是截留液瓶盖的密封圈损坏，需更换。</li>
 <li>当样品容器排空后，立即关闭夹管阀 1，将泵速降至最大速度的 20%，取下截留液瓶的通气盖，并关闭斜夹阀。</li>
 <li>通过调节废液管路上的斜夹阀，将截留液瓶中的样品体积调整至约 200 ml。当体积达到约 200 ml 后，拧紧斜夹阀，以进行后续洗脱步骤（1.11–1.12）。</li>
 <li>向样品容器中加入 500 ml 洗脱液，并冲洗容器内壁。将连接在样品吸取管路上的 10 ml 移液管插入含有洗脱液的容器中。确保斜夹阀处于关闭状态。打开夹管阀 1，并短暂关闭夹管阀 2，以吸入洗脱液。</li>
 <li>当 500 ml 洗脱液完全吸入后，关闭夹管阀 1，打开夹管阀 2。以最大泵速的 20% 使洗脱液循环 5 分钟。</li>
 <li>通过调节废液管路上的斜夹阀，将截留液瓶中的样品体积调整至约 100 ml。拧紧斜夹阀，使样品继续循环 1 分钟。确保截留液瓶中的样品液位足够高，以浸没进入瓶内的 L/S 15 管路，避免将空气吸入管路中。</li>
 <li>反转泵的运行方向，使样品被推入截留液瓶。使泵反向运行 20 秒，使截留液瓶中总体积达到约 225 ml。关闭泵。</li>
 <li>将 Masterflex I/P 73 管路从泵头上取下，并断开压力表连接。断开从中空纤维超滤器出口的 Masterflex L/S 24 管路。将管路举高至截留液瓶上方，以迫使残留样品全部进入截留液瓶。</li>
 <li>断开所有与瓶体连接的管路，并将通气盖更换为非通气盖。</li>
 <li>使用约 225 ml 的截留液继续进行 IMS/IFA 操作。</li>
</ol>
2. 免疫磁珠分离步骤
<ol>
 <li>缓冲液和溶液的配制：
 <ol>
 <li>将 Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia 联检试剂盒中所含的缓冲液恢复至室温。</li>
 <li>1X SL-缓冲液A：将1 ml的10X SL-缓冲液A加入9 ml的试剂级水中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将截留瓶中的约225 ml液体转移至已标记的250 ml锥形离心管中。用10 ml试剂水将截留瓶冲洗两次，并将冲洗液加入锥形离心管中。在4 °C条件下，以1500 × g离心15分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
 <li>小心吸除上清液，从气-液界面处吸至沉淀体积每0.5 ml上方5 ml处（例如，若沉淀体积为1.3 ml，则吸至上清液面距沉淀上方15 ml处；若沉淀体积为0.5 ml或更少，则吸至距沉淀上方5 ml处）。</li>
 <li>通过涡旋振荡或移液混合，将沉淀充分重悬于上清液中。将每5 ml液体转移至平侧Dynal L10管中，该管内已含有各1 ml的10X SL-缓冲液A和10X SL-缓冲液B。用2.5 ml试剂水将锥形离心管冲洗两次，并将冲洗液加入L10管中，使L10管中的总体积（包括缓冲液）达到12 ml。</li>
 <li>向L10管中各加入100 μl充分混匀的抗Cryptosporidium和抗Giardia Dynabeads。将L10管置于旋转混合仪上，在室温下以18 rpm旋转1小时。</li>
 <li>将L10管的平侧紧贴MPC-6磁铁，手动轻轻来回翻转管体180°，持续2分钟。</li>
 <li>保持L10管置于MPC-6磁铁中，磁铁侧朝上，弃去上清液，保留与磁珠结合的(卵)囊合体。将L10管从磁铁上取下，向管中加入0.5 ml的1X SL-缓冲液A。使用另外两次各0.5 ml的1X SL-缓冲液A冲洗，将全部悬浮液转移至置于MPC-S磁铁中（磁铁垂直放置）的1.5 ml微量离心管中。</li>
 <li>在MPC-S磁铁中轻轻翻转微量离心管180°，持续1分钟。保持磁铁在位，使用巴斯德吸管从微量离心管底部吸除上清液。</li>
 <li>向微量离心管前侧加入1 ml的1X PBS，移除磁铁并轻轻摇动管子，直至磁珠完全重悬。将磁铁恢复至垂直位置，轻轻翻转管体180°，持续1分钟。使用巴斯德吸管小心吸除PBS冲洗液，避免扰动磁珠沉淀，尽可能去除杂质。</li>
 <li>移除磁铁，向微量离心管背面加入50 μl试剂水。以最大速度涡旋振荡50秒，随后在80 °C孵育10分钟，再进行30秒涡旋。将磁铁以倾斜位置放回MPC-S中，使磁珠结合至管壁，而(卵)囊保留在液体中。将(卵)囊悬浮液加至SingleSpot单孔载玻片的孔中。</li>
 <li>重复步骤2.10，将液体加至含有第一次解离产物的同一孔中。将载玻片置于37 °C玻片加热器上1小时，使悬浮液干燥并固定于玻片孔中。</li>
</ol>
3. 染色与观察
<ol>
 <li>缓冲液与溶液的配制： 
 工作用 DAPI 溶液：取 25 μl DAPI 储存液（2 mg/ml，甲醇配制）加入 25 ml 1× PBS 中。储存液及工作液均需避光保存于 1 °C 至 10 °C 条件下。</li>
 <li>向载玻片小室中加入 50 μl 甲醇，室温下自然干燥。</li>
 <li>向载玻片小室中加入 50 μl 工作用 DAPI 溶液，室温孵育 2 分钟。</li>
 <li>用 Kimwipe 纸从孔中吸去 DAPI 溶液，然后加入 50 μl EasyStain 染色液，35 °C 孵育 30 分钟。</li>
 <li>用 Kimwipe 纸吸去染色液，缓慢加入 300 μl 冷的 EasyStain 固定缓冲液，使其流过小室边缘。室温孵育 2 分钟。</li>
 <li>用 Kimwipe 纸吸去缓冲液，加入 10 μl EasyStain 封片介质。</li>
 <li>小心加盖盖玻片，排除产生的气泡，并用透明指甲油封固盖玻片。</li>
 <li>使用 FITC 滤光片在 200 倍总放大倍数下扫描整个载玻片，寻找呈卵圆形或球形、苹果绿色荧光、类似卵囊或包囊的结构。对所有此类结构使用 DAPI 滤光片在 1000 倍总放大倍数下进行观察，随后在同一放大倍数下使用微分干涉差（DIC）显微镜进一步检查。使用经校准的目镜测微尺记录其大小及形态学特征。</li>
 <li>记录实验结果。</li>
</ol>
注意：有关原始步骤的更多信息可参见2005年12月版的美国环保署方法162312。本文所述的切向流中空纤维超滤步骤用于替代EPA方法1623的第12.0节。热解离步骤对EPA方法1623的第13.3.3节进行了修改。本方法还描述了在免疫磁性分离（IMS）过程中增加一次PBS冲洗步骤，该步骤可插入2005年12月版方法1623的第13.3.2.16节之后。包含上述修改内容在内的EPA方法1623所用全部耗材、试剂和设备清单见设备列表。
4. 典型结果
Cryptosporidium 卵囊和通过过滤与免疫磁分离过程回收的Giardia 囊肿通过显微镜分析进行检测。在总放大倍数200倍下，对每种呈现典型染色模式、大小和形状的生物体（如图2所示）应进一步使用油浸镜在总放大倍数1000倍下观察。这将有助于测量并识别典型特征或可排除阳性鉴定的非典型特征。Cryptosporidium 为椭圆形至球形结构，直径为4至6 μm，呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著发亮（图3A）。使用DAPI紫外荧光时，卵囊会表现出以下典型特征类别之一：内部呈浅蓝色染色并带有绿色边缘但无明显细胞核（DAPI阴性）、内部呈强蓝色染色，或具有最多四个清晰的天蓝色细胞核（DAPI阳性——图3B）。非典型特征包括颜色、结构或DAPI荧光的异常（例如，染色细胞核过多，内部结构呈红色荧光）。若荧光物体符合典型的FITC和DAPI染色标准，则需通过微分干涉差（DIC）显微镜进一步检查。检查该物体是否存在非典型的外部或内部形态学特征，例如细胞壁装饰结构，或一个或两个大细胞核充满整个细胞。若未观察到非典型结构，则将该物体计入总IFA计数，并归类为空的无定形结构，或含有一个至四个子孢子的结构（图3C）。类似地，对疑似Giardia 的物体也需依据其FITC和DAPI染色特性以及DIC特征（如轴丝、中体和细胞核）进行检查。Giardia 囊肿为圆形至椭圆形、明亮苹果绿色的物体，长8–18 μm，宽5–15 μm，边缘显著发亮（图3D）。使用DAPI紫外荧光时，Giardia 囊肿可表现为DAPI阴性染色或DAPI阳性特征（图3E）。该荧光物体以与Cryptosporidium 相同的方式通过DIC检查其典型与非典型特征。若未观察到非典型特征，则将该物体计入总IFA计数，并归类为含有无定形结构的空囊，或含有一个或多种内部结构的囊（图3F）。
观察到具有非典型特征的任何生物体均不应计为（卵）囊。环境样品的显微镜分析可能具有挑战性，因为某些生物体会自发荧光，或与FITC标记的抗Cryptosporidium和/或抗Giardia抗体发生交叉反应1。建议分析人员熟悉水生微生物，并通过观察数十张载玻片积累识别Cryptosporidium和Giardia的经验。每次显微镜操作前，应先对阳性染色对照片上的至少三个（卵）囊进行特征鉴定。
可通过向质量控制样品中添加（卵）囊肿，利用以下计算公式确定每种原生动物的回收率百分比： 
（卵）囊肿回收率百分比 = （（QC 样品计数 - 未添加样品计数）/ 添加量）× 100。
<img alt="中空纤维过滤示意图；超滤系统装置；废液、截留物分离过程。" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 切向流中空纤维超滤系统的示意图。管道采用颜色编码，以辅助系统组装。
<img alt="荧光显微镜图像；细胞核染色的细胞，比例尺为50μm，用于细胞分析。" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. Cryptosporidium 和 Giardia (卵)囊合子的代表性荧光图像。Cryptosporidium 卵囊和 Giardia 囊合子使用FITC标记的抗Cryptosporidium/Giardia 抗体进行染色。箭头所示为Giardia 囊合子；箭头尖端所示为Cryptosporidium 卵囊。在焦平面共观察到四个Cryptosporidium 卵囊和六个Giardia 囊合子。样品在200倍放大倍数下观察。
<img alt="细胞结构的荧光显微镜图像；箭头指示染色区域；比例尺为 5 µM、10 µM。" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 用于表征的Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊的代表性显微图像。Cryptosporidium卵囊（A - C）。直径为4至6 μm的球形结构呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著亮染（A），内含最多四个 distinct 的天蓝色DAPI染色细胞核（B），以及每个卵囊内含有一至四个子孢子（S）（C）。Giardia包囊（D - F）。呈圆形至卵圆形、大小为长8 - 18 μm、宽5 - 15 μm的结构呈现明亮的苹果绿色FITC荧光，边缘显著亮染（D），内含最多四个天蓝色DAPI染色细胞核（E），并具有一种或多种可辨别的内部结构，如细胞核（N）、中体（M）和/或轴丝（A）（F）。白色箭头：显示Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊壁的明亮苹果绿色荧光染色；白色箭头头：DAPI阳性细胞核。样品在1000倍放大倍数下观察。

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</ol>

本研究由美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency）通过其研究与发展办公室，与地下水与饮用水办公室的技术支持中心合作资助。所有工作均在美国环保署位于俄亥俄州辛辛那提的现场完成。尽管本文所描述的信息全部或部分由美国环境保护署根据与肖环境与基础设施公司（Shaw Environmental and Infrastructure, Inc）签订的合同（合同编号 EP-C-06-031）资助，但其内容不一定反映该机构的观点，不应推断出任何官方认可。本文已经过该机构审查并批准发表。

切向流中空纤维超滤是一种从水中初步浓缩Cryptosporidium oocysts和Giardia包囊的有效替代技术。中空纤维超滤的成本低于传统滤器。由于该方法能够从多种不同类型的水基质中浓缩Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊，因此可作为美国环保署方法1623现行过滤技术的一种有效替代方案。与其他大多数过滤方法一样，中空纤维超滤在处理极高浊度样品时容易发生膜污染。滤膜污染会导致水压升高，因此建议在过滤过程中持续监测压力。除Cryptosporidium卵囊和Giardia包囊外，研究已表明中空纤维超滤还能够浓缩细菌和病毒1-3,5,8。本方法所述的中空纤维超滤可用于在单个样品中同时浓缩多种微生物。值得注意的是，在浓缩过程中获得200至250 ml之间的终体积是关键的最后步骤，以避免因额外离心步骤而导致（卵）囊丢失（步骤2.2）。然而，若允许瓶中液体体积过低，则可能对回收率产生不利影响，因为液体量不足将无法将所有卵囊或包囊完全压入截留液收集瓶中。因此，建议将终体积维持在200至250 ml之间。
热解离是方法1623中酸解离步骤的替代方案。研究表明，该替代步骤在从河流水或试剂水中分离时，可提高隐孢子虫（Cryptosporidium）卵囊的回收率，并降低方法的变异程度9。酸解离与热解离方法的并行比较显示，使用热解离将生物体从免疫磁珠上解离下来，可使隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）的平均回收率更高。此外，采用热解离处理的样品在隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）回收方面的精密度优于酸解离9。
采用HFUF作为浓缩步骤，能够浓缩多种生物体，因而提供了更大的灵活性。此外，与当前方法1623的过滤选项相比，它是一种成本较低的替代方案。

<table><tbody><tr><td>旭化成 Rexeed 25 S/R 湿式中空纤维超滤器</td><td>Dial Medical</td><td>REXEED25S/R</td><td></td></tr><tr><td>I/P 73（Masterflex R-3603）或同等产品</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06408-73</td><td></td></tr><tr><td>L/S 24（Masterflex 铂金固化），或同等产品</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-24</td><td></td></tr><tr><td>L/S 15（Masterflex 铂金固化型）或同等产品</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-15</td><td></td></tr><tr><td>L/S 36（Masterflex 铂金固化），或同等产品</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-36</td><td></td></tr><tr><td>I/P 精密无刷驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77410-10</td><td></td></tr><tr><td>I/P Easy Load 泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77601-10</td><td></td></tr><tr><td>黑色高密度聚乙烯三通接头，1/4英寸&quot;x 3/8&quot; x 3/8&quot;</td><td>US Plastics</td><td>62064</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex T型连接头 L/S 15-25</td><td>Cole-Parmer</td><td>EG-30613-12</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 耐用型聚丙烯 1 L 瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06257-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11C</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1/4 英寸加液/排气盖&quot; 管路，53B</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06258-10</td><td></td></tr><tr><td>压力计</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-680-46-10</td><td></td></tr><tr><td>直通接头，NPT(F)，1/4&quot; </td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06469-18</td><td></td></tr><tr><td>NPT 分支三通，天然聚丙烯</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-30610-75</td><td></td></tr><tr><td>止血钳，1/2英寸&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06833-00</td><td></td></tr><tr><td>定制适配的 DIN 转接头</td><td>Molded Products Corp</td><td>MPC-855NS.250</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-670B</td><td></td></tr><tr><td>铁架台夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td></td></tr><tr><td>Keck 斜面夹，14 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06835-10</td><td></td></tr><tr><td>多聚磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305553</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫代硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72050</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 抗泡沫乳剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>10 L 可折叠高密度聚乙烯容器</td><td>VWR 国际公司</td><td>IR314-0025</td><td></td></tr><tr><td>离心机瓶架</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-663-103</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形离心管</td><td>康宁</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>一次性漏斗</td><td>Cole-Parmer</td><td>U-6122-10</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td>U-06252-40</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>水平转子</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>ARIES SX4750</td><td></td></tr><tr><td>用于250 ml锥形管的离心机转子适配器</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>349849</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;大口径移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>VacuShield 滤器</td><td>Gelman</td><td>629-4402</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &lt;em&gt;隐孢子虫/贾第虫 &lt;/em&gt;组合试剂盒 </td><td>IDEXX</td><td>73002</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>Falcon BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dynal L10 平底管</td><td>IDEXX</td><td>74003</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>VWR 国际公司</td><td>23609-202</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-6 磁力架</td><td>IDEXX</td><td>12002D</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 移液管</td><td>VWR 国际公司</td><td>53283-700</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 低吸附微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;移液器 &amp;和相应的屏障吸头</td><td>Gilson, Inc.</td><td>P1000/DF1000ST</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;移液器 &amp;和相应的屏障提示</td><td>Gilson, Inc.</td><td>P100/DF100ST</td><td></td></tr><tr><td>9 英寸巴斯德吸管</td><td>VWR 国际公司</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S 磁力架</td><td>IDEXX</td><td>12020D</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>VWR 国际公司</td><td>14216-188</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 旋转混匀仪</td><td>IDEXX</td><td>94701</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Lab Armor 珠</td><td>Lab Armor</td><td>42370-750</td><td></td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-077-60</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（1× PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>单点载玻片</td><td>IDEXX</td><td>30201</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>康宁</td><td>287018</td><td></td></tr><tr><td>EasyStain 直接试剂盒</td><td>BTF</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;移液器 &amp;和相应的屏障吸头</td><td>Gilson, Inc.</td><td>P10 &amp;amp; DF10ST</td><td></td></tr><tr><td>4',6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30697</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>L6815</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>载玻片加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-474-521</td><td></td></tr><tr><td>香柏油，A型，ND = 1.515 </td><td>尼康仪器公司</td><td>MXA20234</td><td></td></tr><tr><td>尼康90i显微镜，具备微分干涉差（DIC）功能</td><td>尼康仪器公司</td><td>MBA 77000</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 100X 油镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Plan Achro 20X </td><td>尼康仪器公司</td><td>MRL00202</td><td></td></tr><tr><td>FITC滤光片</td><td>尼康仪器公司</td><td>96302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI滤光片</td><td>尼康仪器公司</td><td>96301</td><td></td></tr><tr><td>X-cite 荧光光源</td><td>尼康仪器公司</td><td>87540</td><td></td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>尼康仪器公司</td><td>76997</td><td></td></tr><tr><td>生物危害性废弃物处理袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-829D</td><td></td></tr><tr><td>生物危害锐器容器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-827-117</td><td></td></tr><tr><td>3 % 过氧化氢</td><td>VWR 国际公司</td><td>BDH3540-2</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>1952030</td><td></td></tr><tr><td>Wypall</td><td>Kimberly Clark</td><td>34790</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改良的美国环保署方法1623，采用切向流中空纤维超滤与热解离步骤检测水源性cryptosporidium和giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium 和 Giardia 是全球引起水源性腹泻疾病暴发的两种最常见原生动物。为了更准确地评估这些病原体的流行情况，美国环保署（EPA）开发了方法 1623，并用于监测美国饮用水供应中这些生物体的水平12。该方法包括三个主要步骤：第一步为样品浓缩，需至少过滤 10 L 的原始地表水；随后将滤膜上截留的生物体和杂质洗脱，并通过离心进一步浓缩样品。第二步采用免疫磁分离程序，将浓缩后的水样加入免疫磁珠中，这些磁珠可特异性结合 Cryptosporidium 卵囊和 Giardia 包囊，从而从浓缩的杂质中特异性分离出寄生虫。接着通过酸解过程将这些（卵）囊从磁珠上解离下来。方法的最后一步是免疫荧光染色与计数，即将（卵）囊滴加到载玻片上，染色后在显微镜下进行观察和计数。
方法1623列出了四种样品浓缩系统用于捕获 隐孢子虫 卵囊和 贾第虫 水中的包囊：Envirochek 滤器（Pall Corporation，Ann Arbor，MI）、Envirochek HV 滤器（Pall Corporation）、Filta-Max 滤器（IDEXX，Westbrook，MA）或连续流动离心法（Haemonetics，Braintree，MA）。然而 隐孢子虫 和 贾第虫 (oo)囊孢子的回收率因水源基质和所用滤膜的不同而存在显著差异1,14一种新型切向流中空纤维超滤（HFUF）系统最近被证明在回收方面更高效、更稳定 隐孢子虫 卵囊 和 贾第虫 来自不同水体基质的包囊；此外，它比其他胶囊滤器更经济，并可同时浓缩多种病原体1-3,5-8,10,11此外，Hill 及其同事先前的研究表明，HFUF 显著改善了 隐孢子虫 卵囊回收率与Envirochek HV滤膜直接比较4此外，已有研究报道对现有方法进行其他改进以提升方法性能。用热解离替代酸解离步骤被证明在分离效果上更佳 隐孢子虫 从某些基质的磁珠中9,13 .
本方案描述了一种改进的1623方法，该方法采用新型HFUF过滤系统并结合加热解离步骤。与当前美国环保署方法1623的过滤选项相比，此改进方法中使用HFUF成本更低，且通过允许同时浓缩多种生物体而提供了更大的灵活性。

本方案描述了使用切向流中空纤维超滤样品浓缩系统和热解离步骤，作为采用美国环保署方法1623检测水中隐孢子虫（Cryptosporidium）和贾第虫（Giardia）物种的替代方法。

一种改良的美国环保署方法1623，采用切向流中空纤维超滤与热解离步骤检测水源性Cryptosporidium和Giardia spp.

隐孢子虫和贾第虫是全球范围内引起水源性腹泻疾病暴发的两种最常见原虫。为了更好地……

本实验的总体目标是检测并可视化水中的隐孢子虫和贾第虫种类。首先通过切向流中空纤维超滤法对水样进行浓缩，实现目标。第二步是通过离心步骤后，将生物体从滤膜中洗脱，并截留杂质。免疫磁珠分离法可实现从浓缩的碎片中选择性分离寄生虫。通过加热解离使磁珠与寄生虫分离，并利用磁铁将其去除。随后将包囊和O型包囊置于载玻片上，对样品进行染色，以便通过免疫荧光显微镜观察。与现有技术相比，hofi 过滤的主要优势在于超滤装置成本显著更低，并且除了隐孢子虫和贾第虫外，还能捕获病毒和细菌等多种微生物。通常，初次接触免疫分离的人员会因不同气候条件下样品所含杂质的数量和类型而面临挑战。首先在生物安全柜内组装超滤装置。组装完成后，仪器的工作流程如下：水样通过黑色三通接头进入系统，流经泵头、压力表后进入中空纤维超滤器；过滤后的水从滤器侧端流出，进入废液容器。含有目标生物的截留液则被压入截留液收集瓶，并在系统中循环，直至水样体积减少至所需程度。开始操作时，取下通气盖，除夹住2号管夹的压紧夹外，打开所有管夹；2号压紧夹应保持关闭，以便截留液瓶进水。设置泵的运转方向，使水样流入滤器。当渗出液瓶装至三分之二满时，将泵速调节至25%并启动泵。夹紧第二根管夹，并迅速用通气盖将瓶子 tightly 密封。检查所有管路和接头，确保无泄漏。然后使用量筒和计时器或流量计，缓慢将泵速提高至约 1.5 升/分钟，并验证滤液流速（即从出流管路流出的水的流速）确实为 1.5 升/分钟。监测过滤过程，确保滞留瓶始终不被排空，尽管其体积可能略有增加或减少。如果体积降至三分之一以下，取下通气盖并关闭夹紧夹具二。再次让瓶中的液体体积增加至三分之二。然后 tightly 重新装上通气盖，并再次打开夹具二。一旦样品容器排空，立即关闭夹具一，并将泵速降低至 20%。取下截留液瓶上的通气盖，并关闭连接滤柱流出管与废液罐的斜坡夹具。拧紧或松开斜坡夹，将截留液瓶中的体积调节至约 200 毫升。然后拧紧斜坡夹，以洗脱液进行样品洗脱。首先，向样品容器中加入 500 毫升洗脱液溶液，在此过程中冲洗容器内壁。然后将连接到样品吸取管路的10毫升移液管放入洗脱液容器中。打开夹管阀一，同时短暂关闭夹管阀二，以吸入洗脱液。待全部溶液加载完毕后，关闭夹管阀一，打开夹管阀二，使溶液以20%的泵速循环5分钟。通过拧紧或松开斜坡夹来调节再生液瓶中的样品体积至约100毫升。然后完全拧紧坡道夹，并让样品循环一分钟。此时，将泵的运行方向反转，持续20秒。这将导致约225毫升的样品在采样瓶中积聚。然后关闭泵。将管道从泵头和滤器出口处取下，将管道置于采样瓶上方，以排出管道中残留的样品。随后断开与采样瓶连接的所有管道，并将通气盖更换为非通气盖。将浓缩后的样品转移至一个250毫升的圆锥形离心管中。用10毫升试剂水将渗滤液瓶冲洗两次，并将冲洗液转移至该离心管中。以至少1500 ×g 的离心力离心样品15分钟。不得使用刹车停止离心。离心结束后，小心吸除上清液，保留约五毫升液体于沉淀上方。操作时需格外小心，保持在液面顶部，避免吸出O型包囊以及位于沉淀中的包囊。涡旋振荡管子，充分重悬沉淀。然后将样品转移至含有1毫升10×SL缓冲液A和1毫升缓冲液B的平底Dyal L 10管中。用2.5毫升试剂水冲洗离心管两次，并将洗涤液加入Dyal L 10管中。加水至终体积为12毫升，再向管中各加入100 µL磁珠偶联的抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体。然后在室温下，将试管置于旋转混合器上以18 RPM旋转一小时。旋转结束后，将试管的扁平侧紧贴MP six磁铁，并轻轻摇动试管两分钟，期间不将试管从磁铁上取下。保持扁平侧朝上，小心倾倒弃去上清液。注意不要扰动保留在管子扁平侧靠近磁铁的磁珠。将样品管从磁铁上取下，用500微升缓冲液A冲洗管子的扁平侧三次，避免接触管子圆弧侧的碎片。每次冲洗液转移至置于MPCS磁铁内的1.5毫升微量离心管中。将磁铁置于垂直位置。关闭管盖，轻轻摇动1分钟。然后保持磁铁位置不变，用移液管从管底小心吸去上清液，再向管中轻轻加入1毫升PBS。注意不要扰动磁珠沉淀。将磁铁条贴附在靠近磁珠沉淀的管壁上。取下磁铁条，并轻轻摇动离心管，直至磁珠完全重悬。 将磁条重新插入垂直位置。轻轻摇动离心管约1分钟，然后吸除上清液，尽可能去除杂质，同时避免扰动磁珠。此洗涤步骤完成后，移去磁铁，直接向磁珠沉淀中加入50微升试剂水。将离心管在最大速度下涡旋振荡50秒，以重悬磁珠。然后将样品在80摄氏度下孵育10分钟，使贾第虫包囊和隐孢子虫o型包囊从磁珠上解离。孵育结束后，将样品涡旋振荡30秒。随后将磁力架以倾斜位置放入MPCS中，使磁珠与悬浮液中的包囊和o型包囊分离。将含有包囊和O型包囊的上清液转移至载玻片的凹孔中。再次重复加水、涡旋和热解离步骤，并将上清液加入同一张载玻片的凹孔内。随后将载玻片置于37摄氏度的载玻片加热台上，使悬液干燥。首先，在载玻片上加入 50 µL 甲醇以固定样本，并在室温下自然干燥。接着，加入 50 µL DPI 溶液，将载玻片在室温下孵育两分钟。为染色细胞核，使用 Kim 擦拭纸从反应孔中吸去染液，注意不要触碰孔壁。然后加入 50 µL 的易染染料，对贾第虫包囊和隐孢子虫卵囊的细胞壁进行染色。将样本在 35°C 下孵育 30 分钟。用 Kim 擦拭纸按之前方法去除染液。然后，将移液枪枪头小心地置于孔外侧，缓慢加入300 µL冷的Easy Stain固定缓冲液，使液体自然流入孔内。将载玻片在室温下孵育2分钟。随后用Kimwipe纸巾吸去缓冲液，加入10 µL封片介质，轻轻将盖玻片覆盖在样本上，排除任何气泡，并用透明指甲油封固盖玻片。使用荧光显微镜，在200 ×至1000 ×放大倍数下观察样本，采用FSE和DPI滤光片在200 ×放大倍数下观察，可见囊肿和O型囊肿呈现为明亮的苹果绿色荧光椭圆结构，边缘明显亮化。隐孢子虫卵囊呈圆形，大小范围为4至6微米。贾第虫卵囊较大，宽度为5至15微米，长度为8至18微米，在1000倍放大下可呈圆形或椭圆形。使用DPI滤镜可更清晰地观察卵囊和CYS的内部结构。通常，在隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊内可见多达四个子孢子，其细胞核经DPI染色后呈天蓝色。微分干涉差显微镜（DIC）也有助于寄生虫的准确鉴定，因为可观察到其他形态学特征。隐孢子虫的子孢子可通过DIC观察到；贾第虫包囊常显示一个或多个可辨别的内部结构，例如可见的细胞核、新月形的细胞器（称为中体）以及称为轴丝的内部鞭毛结构。需要注意的是，全纤维超滤法能够捕获多种微生物。此外，还可对浓缩后的样品进行QPCR和基因分型等其他检测分析，这使得该方法具有更高的灵活性和更广泛的应用适应性。感谢观看，如有任何问题，请随时与我们联系。

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免疫学与感染

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