Name: גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למד את שיטת הפסג'ינג לתאי גזע עובריים אנושיים HuES באמצעות טריפסין. הפרוטוקול מדגים כיצ� לשמור על תרביות בריאות, לא מובדלות ועם קריוטיפ תקין למחקר ויישומים תרפויים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כללי אנו ממליצים הפשרה לא יותר מדגם אחד בזמן נתון, כדי להבטיח טיפול קל. המטפל צריך לדאוג שלא להשאיר תרבויות בטמפרטורת החדר CO2 נמוכה במשך תקופות זמן ארוכות. כל צנטריפוגה של תאים חיים נעשית XG 500-600 5 דקות בטמפרטורת החדר. MEFs (תאים עובריים בעכבר מזין) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם MEF מדיה 37 ° C. הסר בקבוקון MEF מ -80 ° C ומיד להטביע את החצי התחתון של הצינורית אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. זה אמור לקחת בערך 30-45 שניות לפני התאים הם 80% מופשר (חלק קפוא קטן משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר להביא את הצינור אל מכסה המנוע לזרום למינרית, ספריי עם אלכוהול 70%, ולהעביר תאים טרום חימם התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון ג&#39;לטין מן צלחות מוכן קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 Aliquot מ&quot;ל של תמיסת MEF לירידה בצורה חכמה לתוך כל אחד מששת הבארות. הקפידו להפיץ את MEFs באופן שווה על הבאר. תאריך את הצלחת MEF, ומניחים 37 ° C חממה לילה כדי לאפשר MEFs לצרף צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות MEFs יצורף הצלחת. מומלץ להשתמש בצלחות MEF 24-48 שעות לאחר ציפוי. אין להשתמש צלחת MEF כי הוא מעל 4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום גוונים חמים מדיה 0.05% טריפסין / EDTA עד 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסה המנוע, prelabel שפופרת אחת סטרילי 50 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את הגוונים התקשורת מתרבות להיות מפוצל. לשטוף בעדינות את הבארות עם 2ml של פתרון 1X שנאגרו פוספט (PBS) בכל טוב. לשאוב PBS. הוספת 0.75 ml 0.05% טריפסין / EDTA אל הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המכסה, ולבחון את התאים בהגדלה 4x. MEFs סביב מושבות גוונים צריך להתחיל לחזור בו. כאשר MEFs מעוגלות מספיק גבולות המושבות הגוונים הם מחוספסים, להחזיר את הצלחת עד למכסה המנוע. תהליך זה אמור לקחת בערך 5 דקות, בהחלט לא יותר מ 10 דקות או התאים שלך לא לגדול מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בעדינות מעלה ומטה, כביסה לתחתית הבאר, עד monolayer MEF יש מנותקת לחלוטין (monolayer דביק ועלול להישאר בחתיכה אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי המכיל 50 מ&quot;ל נוסף התקשורת גוונים. ספין הצינור של תאים 500xg במשך 5 דקות, לשאוב את התקשורת, להיזהר לא להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צלחת לצלחת חדשה של MEFs, להוסיף נפח נחוש הולם של תאים התקשורת גוונים נוספים, פיפטה הפתרון 5-7 פעמים עם פיפטה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה MEF מהצלחת טרייה של MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הגוונים טיפה פתרון חכם היטב לכל, מוודא להפיץ את טיפות באופן שווה על הבאר. בלי ללחוץ את הצלחת בזהירות להחזיר את התאים 37 ° C במשך הלילה באינקובטור לתת גוונים זרע מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוונים תאים יוצא לפצל צריכים להתנהג באופן דומה לאלה יוצא של הפשרה. </li></ol>

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

בסרטון הזה הראינו איך אנחנו שגרתי גוונים מעבר אדם בתאי גזע עובריים קווי במעבדה שלנו. פיצול יעיל רגיל passaging חיונית לשמירה על תאים עובריים של אדם בריא קו גזע. מעבר טריפסין בתיווך היא יתרון משמעותי של קווים בגוונים התא, עם זאת, חשוב שלא לאורך trypsinize תרבויות או יש אחוז גדול של תאים בודדים במהלך platting מחדש.

גוונים מדיה 651.5 מ&quot;ל KO-DMEM 500 מ&quot;ל PenStrep 6.5 מ&quot;ל GlutaMAXTM 6.5 מ&quot;ל NEAA 6.5 מ&quot;ל 2-mercaptoethanol 0.5ul KO החלפת סרום 65 מ&quot;ל 65 מ&quot;ל Plasmanate bFGF2 (10 ng / mL הסופי) 0.65 מ&quot;ל

גוונים passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין. בתאי גזע עובריים אנושיים הם חפצים של תרבית תאים, והם נוטים לרכוש ליקויים karyotypic עם הכפלות אוכלוסין גבוהה. Passaging נכונה חיונית לשמירה על בריא, מובחן, גוונים נורמלי karyotypically האדם גזע עובריים תרבות. ראשית, תרבות הרחבת נשטף ב PBS להסיר התקשורת שיורית ופסולת תאים, אז התאים מעולף עם נפח מינימלי של% 0.05 חם טריפסין-EDTA. טריפסין נשאר על התאים לתקופה של עד חמש דקות, ואז התאים וחילצה בעדינות עם טפטפת סרולוגיות 2ml. השעיית התא נאספים ומעורבבים עם כמויות גדולות של אמצעי התקשורת גוונים, אז התאים נאספים על ידי צנטריפוגה עדין. התערובת מומת טריפסין המדיה מוסר, ותאי resuspended מראש חימם התקשורת גוונים. יחס ראוי לפצל מחושב (בדרך כלל 1:10-01:20), ותאי מחדש מצופה לצלחת הישן 1-2 יום המכיל monolayer של מוקרן עובריים בעכבר תאים פיברובלסטים מזין. הגוונים החדשים seeded צלחת תרבות נותר ללא הפרעה במשך 48 שעות, אז התקשורת משתנה כל יום לאחר מכן. חשוב לא trpsinize עד ההשעיה תא בודד, כמו זה מגביר את הסיכון של החדרת ליקויים karyotypic.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו מבצעת באופן שגרתי מעברים (passages) של שורות תאי גזע עובריים אנושיים מסוג HuES באמצעות טריפסין. תאי גזע עובריים אנושיים הם תוצרים...

זהו, איפה הרצת את הטכניקות? הו, איפה לימדתי אותך? בלצ'ר.כן.בפעם הראשונה שלימדתי אותך בל, ביליתי את הקיץ ב-T.Yeah שלי.וזה היה כאילו, אהבנו שם דברים של סחוס. ולכן אהבתי את התרבות החברתית שם. ואז בהופקינס בשנה האחרונה שלי עבדתי עם אחרים, אז אני, כמו העניין של ההנדסה, זה היה הרבה יותר לנסות, אנחנו מהנדסים תלת מימד את זה.

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. חלק 1 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

בידול בימוי של hESCs לתוך תאים ספציפיים יצרה עניין רב ברפואה רגנרטיבית. אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול...

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

יצירת קרדיומיוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים במבחנה מאפשרת גישה לכמויות גדולות של רקמת לב במבחנה למדע בסיסי וליישומים קליניים.  פרוטוקול זה משתמש בגורם הפרוזדורים Grem2 כדי להגדיל את מספר הקרדיומיוציטים המתקבלים וליצור קרדיומיוציטים עם פנוטיפ פרוזדורים.

דיפרנציאציה של פרפור cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים שימוש Grem2 אנטגוניסט BMP

שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון קיצור סרקומר באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים עם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

כדי להימנע מהמגבלות הקשורות למעבר אנזימטי או מכני של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בתרבית על תאי הזנה, ביססנו שיטה מהירה, יעילה, חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לקצירת מושבות hESC או hiPSC המתוחזקות על שכבת תאי הזנה של פיברובלסטים אנושיים של עורלה באמצעות דיס-הדבקה בתיווך EDTA.

העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

למד את שיטת הפסג'ינג לתאי גזע עובריים אנושיים HuES באמצעות טריפסין. הפרוטוקול מדגים כיצ� לשמור על תרביות בריאות, לא מובדלות ועם קריוטיפ תקין למחקר ויישומים תרפויים.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

גלה סרטונים נוספים