Name: 联体小鼠：一个详细的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习联体小鼠手术技术，通过连接两只小鼠的循环系统建立共享血液循环模型。该方法无需免疫抑制，可在10至14天内实现血液嵌合，适用于长期研究。

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作者谨此感谢 Adriane Mosley 和 Libuse Jerabek（斯坦福大学）在手术技术方面提供的协助。

所有动物实验均按照加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会的指南以及美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。以下所述实验程序从开始到结束大约需要45至60分钟。
1. 手术区域的准备
<ol>
	<li>在洁净的动物手术室内进行操作。</li>
	<li>设备：异氟烷挥发罐、配备加热垫的Gaymer T型泵。</li>
	<li>无菌器械：两把弯镊、精细剪刀、持针器。</li>
	<li>整个操作过程中必须佩戴无菌手套。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>将两只同品系、体重和体型相近的雄性或雌性小鼠放入同一笼中，共同饲养至少两周，以确保其能够和谐共处。优先选用雌性小鼠，因其攻击性较弱。</li>
	<li>使用异氟烷挥发罐对动物进行麻醉。将小鼠置于连接异氟烷挥发罐的Posi-Seal诱导室中（4–5% v/v）。麻醉诱导后，将动物转移至脱毛区域，并通过连接异氟烷（1.5–2% v/v）的鼻罩在整个操作过程中维持麻醉状态。使用棉签涂抹眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>将动物置于仰卧位。彻底剃除左侧小鼠的左侧体壁和右侧小鼠的右侧体壁毛发，范围自肘关节上方约1 cm至膝关节下方约1 cm。</li>
	<li>用浸有聚维酮碘的擦拭巾对剃毛区域进行2–3次彻底擦拭，随后使用酒精擦拭巾消毒，完成无菌准备。将小鼠置于覆盖无菌垫的加热垫上。</li>
	<li>为实现镇痛，按10 mg/kg和0.1 mg/kg剂量分别经腹腔或皮下注射卡洛芬和布托啡诺。</li>
	<li>将两只动物侧卧背对背放置，使相邻的剃毛区域朝上。为避免手术区域污染，用无菌手术单覆盖小鼠，仅暴露手术区域。制作一个小的开口以保持无菌状态进行手术操作。我们采用较大的手术窗，以便在录像过程中获得更好的视野。</li>
</ol>
3. 连体共生
<ol>
	<li>使用锋利的剪刀，在每只动物剃毛后的体侧进行纵向皮肤切口，从肘关节上方0.5 cm处开始，一直延伸至膝关节下方0.5 cm处（图1）。切开后，用一对弯镊轻轻提起皮肤，再用另一对镊子分离皮下筋膜，使皮肤边缘游离出约0.5 cm。沿整个切口全长完成该分离操作。</li>
	<li>开始连接时，将一只动物的左侧鹰嘴突与另一只动物的右侧鹰嘴突相连接。皮肤切开后，鹰嘴突和膝关节均清晰可辨。为便于连接，弯曲第一只小鼠的肘部，将不可吸收的3-0缝线穿入其鹰嘴突下方；同样弯曲第二只小鼠的肘部，并将同一根缝线穿入其鹰嘴突下方。使用双外科结紧密固定关节。</li>
	<li>采用相同方法连接膝关节。</li>
	<li>关节连接完成后，从肘部向膝部方向，沿腹侧开始使用可吸收的5-0 Vicryl缝线连续缝合两只动物的皮肤。为防止皮肤撕裂或分离，应在肘部和膝部周围区域紧密缝合皮肤。完成腹侧皮肤缝合后，打双外科结。将小鼠置于俯卧位，继续沿背侧缝合，最终以双外科结结束。检查缝线的连续性，并确认无任何缺口。</li>
	<li>每只小鼠皮下注射0.5 ml的0.9% NaCl，以防止脱水。</li>
</ol>
4. 术后恢复
<ol>
	<li>将动物置于加热垫上直至恢复。</li>
	<li>恢复后给予镇痛剂卡洛芬（carprofen）和布托啡诺（buprenorphine），分别每24小时和每12小时通过腹腔或皮下注射重复给药一次，剂量同上文所述（步骤2.5），持续48小时。密切观察动物是否出现疼痛或痛苦的迹象，例如颤抖、嗜睡、啃咬尾巴、背部弓起、缺乏理毛行为等。 等等。 持续两周，每天一次。</li>
	<li>预防性地在小鼠饮水中加入磺胺甲噁唑/甲氧苄啶口服混悬液，剂量为每毫升水含2 mg磺胺甲噁唑和0.4 mg甲氧苄啶，连续给药10天，以预防细菌感染。</li>
	<li>将每对异体共生小鼠饲养在装有整块垫料的清洁笼具中（例如 使用纸巾或无菌吸水垫，以防止吸入垫料。当动物能够维持胸腹侧卧位且头部抬起时，将其放回装有垫料的笼子中。为减轻其在适应连体共生状态期间取食时的负担，将湿润的饲料颗粒置于笼底。提供筑巢材料。术后1至2周，连体小鼠即可利用手术配对的前肢和后肢正常行走。</li>
	<li>术后10至14天出现血液嵌合现象。</li>
</ol>
5. 验证与反向操作步骤
<ol>
	<li>两周后，从小鼠尾静脉采血，进行流式细胞术分析，以确认血液嵌合状态（图3）。</li>
	<li>流式细胞术分析的血液处理：将2–3滴血液加入500 μl含10 mM EDTA的溶液中稀释。加入500 μl 2%右旋糖酐（用PBS稀释），充分混匀后于37 °C孵育30分钟。将上清液转移至新管中，以1,200 rpm离心5分钟，将沉淀细胞重悬于PBS（或其他缓冲液）中，用于流式细胞术分析。</li>
	<li>根据实验设计，可在后续时间点分离联体小鼠对。据我们的经验，联体小鼠对可维持长达9个月而无任何并发症。</li>
	<li>在无菌手术台面上执行反向操作。将小鼠置于连接异氟烷挥发器（4–5%）的诱导舱内进行麻醉，并如上所述（步骤2.2）以1.5–2%异氟烷维持麻醉。</li>
	<li>去除初始缝合线周围区域的毛发，并如上所述（步骤2.3、2.4）对剃毛区域进行无菌处理。</li>
	<li>为镇痛，按10 mg/kg和0.1 mg/kg剂量分别经腹腔或皮下注射卡洛芬和布托啡诺。</li>
	<li>如上所述（步骤2.6），用无菌手术巾覆盖手术区域。</li>
	<li>使用锋利的剪刀沿侧向缝合线作纵向切口分离小鼠，并用弯头镊子轻轻剥离两只小鼠之间新形成的筋膜组织。为分离关节，剪断连接它们的缝合线结。沿切口修剪皮肤以获得平滑边缘，并使用可吸收的连续5-0涂层薇乔缝线重新缝合皮肤。</li>
	<li>为防止脱水，每只小鼠皮下注射0.5 ml 0.9% NaCl。将动物置于加热垫上直至恢复。</li>
	<li>恢复后，继续给予镇痛药物，每24小时注射一次卡洛芬（10 mg/kg），每12小时注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg），持续48小时。</li>
	<li>为预防细菌感染，将磺胺甲噁唑/甲氧苄啶口服混悬液（每毫升含2 mg磺胺、0.4 mg甲氧苄啶）加入饮水瓶中，连续给药10天。</li>
</ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文讨论的联体共生方法技术难度较低，且死亡率低。膝关节和肘关节的连接方式是对Bunster和Meyer技术的重要改进。然而，该手术仍具有侵入性，因此在整个手术过程中必须维持无菌条件。为进一步预防手术部位感染，必须对联体动物使用抗生素组合治疗，并定期进行监测。为确保牢固固定并防止疼痛，连接肘部和膝部的缝合线应环绕关节，而非穿过组织。
作为异氟烷吸入麻醉的替代方法，也可通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪或其他经机构委员会批准的麻醉药物来诱导麻醉。使用异氟烷的优点在于能够快速诱导麻醉，并显著缩短恢复时间。此外，麻醉深度可以得到精确控制。
异种共生（parabiosis）是一种强大的实验方法，可使两只动物的循环系统相互连通并达到平衡，适用于生理学研究。与骨髓移植或细胞注射等常用技术相比，该方法具有多项优势。细胞递送操作有时仅能提供较短的时间窗口来观察移植细胞的作用效果，此外，免疫抑制会增加感染以及后续发病率和死亡率的风险。而通过异种共生，可长期维持嵌合循环状态，从而研究循环因子（如细胞、细胞因子、 等等。）与其来源无关。该系...

异种共生（parabiosis）是指通过外科手术将两个生物体连接在一起的技术，最早由Paul Bert于1864年描述，旨在建立研究共享循环系统模型，最初的操作包括将两只大鼠的皮肤和肌肉壁连接在一起1。异种共生可促进炎症部位微血管的形成3，并在生理学研究中具有多种应用，例如研究垂体与性腺之间的激素通讯，以及肾脏在高血压中的作用4。该技术还被进一步用于研究前体细胞在新生血管形成中的募集与整合5、造血干细胞的迁移6、淋巴细胞的迁移行为7，以及循环中的炎症细胞或干细胞在肿瘤转移8,9和神经退行性疾病10中的作用与动力学特征。
异种共生的一个显著优势在于，配对动物共享循环中的共同抗原，从而允许细胞迁移和新生血管形成，而不会引发免疫反应。重要的是，Weissman 等 研究表明，雄性和雌性小鼠之间的异种共生不会导致抗H-Y抗体的产生11。
在Paul Bert最初描述的实验方案中，两只动物通过皮肤和肌肉壁的连接而结合在一起1。然而，这种方法对动物造成显著的应激，并因伤口感染导致较高的死亡率。此后，多个研究团队对连体共生技术进行了改进，其中以Bunster和Meyer于1933年提出的方案最为广泛采用2。他们的方法包括肩胛关节、体腔和皮肤的连接，从而为动物提供了更好的支撑并减轻了疼痛。同时，该新方法显著减少了术后护理需求，并大幅降低了死亡率。本文所述方案是在Bunster和Meyer技术基础上的改良，侵入性更小且连接更为牢固。具体而言，小鼠通过肘关节、膝关节以及皮肤进行连接。这种连接方式可防止皮肤过度伸展，因而减轻疼痛并减少并发症。本文中，我们描述了将一只野生型（WT）成年小鼠与一只组成性表达GFP的小鼠进行连接的过程。结果显示，术后两周可达到50%的血液嵌合率，证明该手术方法在建立共享循环系统方面的有效性。

<table><tbody><tr><td>异氟烷-凤凰</td><td>Clipper</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Seal 诱导室</td><td>分子成像产品公司</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>便携式麻醉系统</td><td>分子成像产品公司</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Gaymer T 泵</td><td>Gaymar 工业公司</td><td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>加热垫（保温毯）</td><td>Kent 科学公司</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具公司（FST）</td><td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>电动剃毛器</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠异体共生：详细实验方案

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

异种共生是一种通过手术将两个生物体连接在一起，使其共享血液循环的技术。将两只动物的皮肤缝合可促进炎症部位微血管的形成。异种共生伙伴共享其循环抗原，因此不会产生不良免疫反应。该技术最早由 Paul Bert 于1864年描述1，后于1933年由 Bunster 和 Meyer 改进，以提高动物存活率2。在本实验方案中，采用改良的 Bunster 和 Meyer 方法，通过手术将两只小鼠连接在一起。动物通过肘关节和膝关节相连，随后缝合皮肤，以提供牢固支撑，避免缝合部位皮肤受力过大。本文详细描述了将一只全身表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠与一只野生型（WT）小鼠进行异种共生连接的过程。手术两周后，将这对小鼠分离，可通过流式细胞术在 WT 小鼠的外周血中检测到 GFP 阳性细胞。这种血液嵌合状态使得研究者能够分析一只动物的循环细胞对另一只动物的贡献程度。

将两个生物体进行异种共生（parabiosis）后，预期结果是每个动物的循环系统对共同血液循环作出均等贡献（图2）。通过流式细胞术分析，可轻松验证野生型（WT）小鼠与GFP阳性小鼠在异种共生后血液是否成功达到平衡。本实验中，在手术后2周从小鼠尾部采集静脉血，并分离外周血细胞（以去除红细胞）。随后，对分离得到的造血来源细胞组分进行流式细胞术分析，检测其中GFP阳性细胞与野生型（WT）细胞的存在情况。结果与以往研究一致，来自野生型小鼠的血液显示出嵌合现象，表现为约一半为GFP阳性细胞，另一半为野生型细胞（53% WT细胞和47% GFP细胞）（图3）。
<img alt="动物解剖学研究，两只小鼠背部区域标记，用于生理分析的实验。" src="/files/ftp_upload/50556/50556fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 连体手术：切口位置。 对麻醉动物的体侧进行...

将两个生物体进行异种共生连接可导致形成共用的循环系统。在本方案中，我们描述了在野生型小鼠与组成型表达GFP的小鼠之间建立异种共生连接的手术步骤。

异体共生是一种将两个生物体通过外科手术连接，使其共享血液循环的技术。将两只动物的皮肤缝合在一起，可促进……

本实验的总体目标是通过将两只小鼠进行异种共生连接，以研究其共用的循环系统。该过程首先在两只动物相邻的一侧做切口，分离筋膜后，将两只小鼠的肘关节和膝关节牢固连接在一起。最后一步是通过连续缝合将两只动物的皮肤连接起来。最终，流式细胞术分析可在手术后10至14天内显示血液嵌合现象。该技术相较于现有方法（如骨髓移植或细胞注射）的主要优势在于无需免疫抑制，且能够长期维持CX循环。演示该操作的将是 punctu jaw。我实验室的动物外科医生。至少提前两周，准备多笼同性别（最好是雌性）、相同遗传背景、体型和体重相近的小鼠配对。选定一对关系和谐的小鼠后，在洁净的动物手术室内进行连体手术。确保所有接触表面、工具和手套均无菌。将小鼠置于连接异氟烷挥发器的PAI密封诱导室中进行麻醉。一旦麻醉生效，需在整个操作过程中维持麻醉状态。使用鼻罩输送较低浓度的异氟烷，现在将小鼠腹部两侧的毛发剃除，并涂抹眼用软膏。然后以无菌操作方式，用浸有聚维酮碘的擦拭巾彻底擦拭剃毛区域，随后再用酒精擦拭巾擦拭。接下来，将小鼠转移至由无菌垫覆盖的加热垫上。使用卡洛芬和丁丙诺啡进行镇痛。将小鼠背对背侧卧放置，脱毛区域朝上。然后用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露手术区域。使用锋利的剪刀，在每只动物体侧做纵向皮肤切口，切口从膝关节下方0.5厘米处开始，至肘关节上方0.5厘米处结束。切开后，用一对弯头镊子轻轻提起皮肤，再用另一对镊子分离皮下筋膜，从而将皮肤与皮下筋膜轻轻剥离。为了形成半厘米的游离皮肤，需使下肢末端软组织（LEC）与膝关节清晰可辨。皮肤切开后，开始缝合左侧与右侧的LEC。首先弯曲第一只小鼠的肘部，并将3.0缝线的针头从Theon下方穿过。其次，弯曲第二只小鼠的肘部，并将同一根缝合线从其下方穿过。通过双外科结将关节紧密固定。接下来，按照相同步骤连接膝关节。关节固定后，使用连续可吸收的5-0薇乔缝线将两只动物的皮肤缝合。从肘部腹侧开始缝合，以防止皮肤破裂和分离。在肘部和膝部周围的皮肤区域进行严密的缝合。将小鼠皮肤连接在一起是该手术的关键步骤。必须确保小鼠皮肤紧密连接，以避免术后发生破裂或分离。因此，每隔四到五个月，我们需确认皮肤是否紧密连接。腹侧皮肤缝合完成后，将小鼠置于俯卧位，继续向背侧缝合，最后以双重外科结结束。检查缝合线的连续性，并确认无任何开口。通过向每只动物皮下注射0.5毫升0.9%氯化钠溶液以防止脱水，完成手术。将动物留在加热垫上直至其恢复意识。将每对共生动物饲养在清洁的笼子中，并提供湿润的饲料颗粒，以减少动物在适应共生状态时因取食而产生的负担。将食物颗粒放在笼子底部。同时，在术后前48小时内务必提供筑巢材料。每天每24小时给予一次卡洛芬，每12小时给予一次布托啡诺，持续两周。观察动物是否出现疼痛和痛苦的迹象，例如颤抖、嗜睡、啃咬尾巴、弓背、缺乏理毛行为等。为预防术后前10天内的细菌感染，需在小鼠

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